孕妇外周血胎儿游离DNA的检测及应用研究

孕妇外周血胎儿游离DNA的检测及应用研究 孕妇外周血胎儿游离DNA的检测及应用研 究 现代妇产科进展2006年6月第15卷第6期ProgObstetGynecol,June2006,Vo1.15,No.6 孕妇外周血胎儿游离DNA的检测及应用研究 陶红,王雪梅,纪向虹 (青岛市市立医院妇产科,青岛266071) 【摘要】从1997年首次在孕妇外周血中发现胎儿DNA以来,众多学者致力于将其应用于无创性 的产前诊断.荧光定量PCR实现了胎儿游离DNA浓度的检测,目前研究发现,正常孕妇血浆胎儿DNA 浓度稳定于某一水平,有望成为产前诊断和孕期检测的一项新指标.有学者认为,子痫前期母循环中胎 儿DNA可有异常增高,而且子痫前期的孕妇在有临床症状前,孕妇血浆胎儿DNA水平异常增高,这与 较多胎儿DNA释放到母血中,和肝肾功能异常导致胎儿DNA在母血中清除紊乱有关.此外许多妊娠 合并症和并发症都伴有母外周血DNA水平的异常增高,例如:性连锁疾病,Rh血型不合,父系遗传性疾 病,染色体非整倍体胎儿,早产等.现就孕妇外周血胎儿游离DNA的检测及临床应用作一综述. 【关键词】产前诊断;外周血,孕妇;游离DNA,胎儿 中图分类号:R714.7文献标识码:A文章编号:1004—7379(2OO6)O6—0461—04 多年来,无创性产前诊断一直是学者们研究的主要思路 和探索途径.从孕妇血中分离胎儿细胞是无创性产前诊断 的一种确定方法,但由于其细胞数量太少,富集,分离技术操 作复杂,而且价格昂贵,限制了其临床应用.近年,随着分子 生物学等技术的发展,使得从孕妇外周血检测胎儿游离DNA 成为可能,并为无创性产前诊断和妊娠并发症的筛查开辟了 新途径,具有应用范围广,易被广大患者接受的优点. 1孕妇外周血游离胎儿DNA的发现和证实 1979年Herzenberg利用流式细胞术在母体外周血中检 测到胎儿细胞,并利用其进行产前诊断.后来又有学者利用 免疫磁珠细胞分离系统和三度梯度离心技术检测母血胎儿 细胞,但由于母血中胎儿细胞少,分离纯度不高,实验难度大 及费用昂贵,故未能在临床推广.1996年,Chen等第一次在 肿瘤患者血浆和血清中检测到肿瘤特异性DNA序列.在健 康人和肿瘤患者外周血中均有少量这种游离的DNA,但肿瘤 患者血浆中DNA浓度高,许多不同肿瘤患者检测结果提示, 血浆DNA可以作为肿瘤非侵入性诊断及判断预后的生化指 标.并有器官移植后在受者血清中也发现宿主来源的DNA 的报道.基于这一现象,有学者认为,在免疫学上,胚胎对于 母体类似于肿瘤对于机体,将胎盘的部分行为称为伪恶性, 则可能在母血中存在胎儿DNA.1997年,等开始在母体 血清和血浆中寻找胎儿DNA,利用一孕男胎妇女作为研究对 象,用快速煮浮法从孕母血浆及血清中提取DNA,应用实时 PCR技术扩增出胎儿Y染色体特异序列(SRY),首次证明孕 妇外周血中存在游离胎儿DNA,性别诊断率血清和血浆中分 别是80%和70%,而同时从母血中分离的有核红细胞中扩 增SRY片段,3O例中仅确定5例阳性基因片段,认为在母血 清及血浆中胎儿游离DNA浓度比母血中胎儿细胞的DNA ? 综述? 浓度高.在其后续研究中又证实…,平均每毫升孕妇血浆中 含有25.4个基因组的胎儿DNA(167.64pg),连续跟踪孕期 妇女发现孕7周时母血中即可测得胎儿DNA,其绝对浓度随 妊娠进展而增加,至孕32周时达高峰,较孕早期高出约11.5 倍. 2孕妇外周血游离DNA的来源 迄今,人们对孕妇外周血中胎儿游离DNA的生物学性 质知之甚少,特别是它的来源尚未完全阐明,有学者报道,在 正常成人外周血中不应出现有核红细胞,妊娠后由于胎盘界 面的胎-母输血,胎儿有核红细胞通过胎盘进入母血循环,以 及淋巴细胞和血小板的相互交换.此外,早期胚胎的滋养层 发育很快,孕4周时滋养层间隙被母血所充盈,滋养层细胞 可侵入到子宫基层甚至充当子宫螺旋小动脉的管壁,所以, 有理由相信滋养细胞可通过此途径进入母亲的血循环,合体 滋养层细胞可直接深入母血中. 目前认为,孕妇外周血胎儿游离DNA存在以下几种可 能的机制:(1)母体循环中胎儿细胞类型为有核红细胞,淋巴 细胞,粒细胞和胎盘滋养细胞,研究发现,妊娠5—1O周母儿 就可以通过胎盘进行细胞交流,75%典型病例为胎儿溶血 病.胎儿的状态,妊娠合并症及并发症均能影响母儿间的交 换,任何引起胎盘屏障交换的疾病均可导致胎儿细胞进入母 体的量增加,在胎儿生长受限的母体外周血中胎儿细胞数量 明显高于对照组.胎儿有核细胞通过胎盘屏障渗透到母体 血液中,被母体的免疫系统识别为异物,并受到免疫攻击,致 使细胞核膜溶解,DNA释放入母血循环中.例如:子痫前期, 21三体孕妇血液中胎儿有核细胞与血浆中胎儿DNA呈平行 关系;(2)一项研究使用荧光原位杂交技术对胎儿有核红细 胞进行凋亡检测,42%的细胞标记为阳性,提示可能是胎 46】 现代妇产科进展2006年6月第15卷第6期 ProgObstetGynecol,June2006,Vo1.15,No.6 儿组织在发育过程中自然凋亡,释放出的DNA经母一胎界 面进入母血循环中.凋亡的启动可为自发启动或受到外界 刺激诱发,因在某些高龄孕妇和子痫前期孕妇的血循环中水 平很高,同时细胞凋亡明显增多,且有证据表明,循环胎儿 DNA具有凋亡DNA片段的一些特征.胎盘的细胞凋亡已经 得到证实,而且胎盘的细胞凋亡时随着孕周的增加而增加; (3)胎儿DNA直接从胎儿组织中释放,经母一胎界面进入母 血中,药物终止妊娠的妇女胎儿DNA含量持续升高直至胚 胎排出;(4)母血中胎儿DNA来源于胎盘滋养细胞,推测 胎儿DNA可能是母体和胎儿界面的滋养细胞破坏后直接释 放的结果.Ohashi等证实,孕妇血浆胎儿DNA水平和血 浆中绒毛膜促性腺激素(HCG)呈平行关系;(5)血浆中胎儿 DNA升高可能与其清除率下降有关,肝肾是清除胎儿DNA 的主要器官,而一些妊娠合并症例如子痫前期-子痫,孕妇的 肝肾功能下降,而导致DNA异常增高. 3孕妇外周血游离DNA的清除 有学者对产后胎儿DNA的清除进行了研究,在产时,产 后立即,产后数小时,产后数天分别抽取外周血检测,发现大 部分孕妇(7/8)在产后2h即检测不到胎儿DNA,估计胎儿 DNA的平均半衰期为16.3min.研究表明,母血中的胎儿 DNA很快被肾脏清除,与早期将外源性DNA注入动物循环 血中的实验相同均表明了胎儿DNA的快速肾脏清除率.因 此,以血中游离DNA为产前基因诊断研究的对象可以避免 前次妊娠可能残留有胎儿DNA而影响本次妊娠分析的结 .的新近报道的数据也表明, 果,假阳性率减少.Botezatu等 肾脏在血浆DNA清除中可能起主要作用,这一结果也使其 发现了尿中存在游离胎儿DNA的事实.他应用PCR研究 17例孕早期妇女的尿液,1O例孕有男胎的妇女尿中扩增到 了Y染色体特异序列,7例孕女胎者则无此特异序列出现. 母血中胎儿DNA的快速肾脏清除率与胎儿有核细胞的 清除率明显不同,后者虽然大多数细胞于产后几周内就从母 血循环中清除,但仍有某些细胞亚群会在产后存在数十年. 胎儿细胞与胎儿DNA清除率的明显差异可能是由于胎儿 DNA来自滋养细胞的游离DNA,母血中的胎儿细胞系来自 胎儿有核红细胞,与两者形成的优势细胞群明显不同有关. 4荧光定量PCR技术检测母血清及血浆中胎儿DNA的应 用 荧光定量PCR是目前国内外临床实验室推荐使用的基 因诊断方法.此方法将特异引物和探针杂交相结合,进一步 提高了基因检测的特异性,利用荧光探测仪检测荧光的大 小,通过计算机分析软件进行分析,则可检测到单拷贝的基 因,灵敏度极高.更重要的是,PCR反应过程中,由于利用扩 增进入指数增长起的ct值(荧光信号增强到某一阈值时的 循环次数)来定量起始的量,实现了极为精确的核算定 量检测,可根据荧光强度的变化,对待测基因进行实时定量. 定量结果描述为基因组当量/ml(genome-equivalents/m1),1 462 个基因组当量定义为存在于1个男性二倍体细胞中特定 DNA序列的量.荧光定量PCR的整个反应过程以及结果的 定量测定都在密闭的仪器中自动完成,防止由于污染造成的 假阳性.为开展大规模无创性产前遗传学筛查提供了方法, 2003年又报告了采用母血干纸片检测胎儿DNA,大大方 便了标本的采集和运送.方法是在含有6—7滴孕妇手指血 的滤纸片上,取6个3mm直径的血纸片(9含血液112)用 于提取DNA,作为荧光定量PCR的模板.荧光定量PCR可 在同一反应管中同时检测胎儿多个基因位点,如SRY和 RhD,而且能通过定量检测游离胎儿DNA和总DNA,借此可 识别不同的妊娠状态,如子痫前期和早产,将无创性产前基 因诊断水平提高到新的高度. 5孕妇外周血游离DNA在子瘸前期一子瘸诊断中的应用 子痫前期一子痫是导致母婴死亡的首位原因,但其病因 至今尚未明确,而且对它的预测和预后没有明确的指标,国 内外专家对此广泛的关注.子痫前期一子痫的主要病理学改 变可能是由于滋养层不能有效地侵入蜕膜和缺乏动脉管璧 的侵入导致胎盘的缺陷.有研究发现,子痫前期一子痫的孕 妇中胎儿有核细胞通透性增高,在子痫前期-子痫发生的前 几周,母血循环中有核红细胞的数量异常增加;此外,负责清 除血循环中DNA的主要器官,如肝,肾等功能受损而清除减 少.因此有学者认为,子痫前期一子痫母血循环中胎儿 DNA可有异常增高.Simd等发现,正常妊娠母血中胎儿 DNA的量在妊娠早,中,晚期和足月时分别为20.7,13.4, 23.6,74.8基因组当量/ml,而子痫前期?子痫孕妇胎儿DNA 的量为332.9基因组当量/ml,大大高于正常对照组,在7例 妊娠合并子痫前期一子痫和胎儿生长受限者中为146.8基因 组当量/ml,4例妊娠合并胎儿生长受限者中为308.14基因 组当量/ml,2例合并胎儿生长受限和HELLP综合征者中为 249.7基因组当量/ml.Farina等检测母亲血浆中胎儿 DNA,考虑是否可用作观察没有临床症状的子痫前期.子痫 的一个指标.他们收集6例孕妇的血浆,每例配备5个条件 相同的,推测胎儿为男性的孕妇,胎儿DNA是从1.5ml母亲 血浆样本中提取的,用real?time定量PCR分析DYS14基因. 结果子痫前期?子痫组较对照组高2.39倍.另有学者对 加例正常孕妇和2O名子痫前期一子痫孕妇的血浆胎儿DNA 进行比较,结果表明,后者是前者的5倍,HELLP综合征出现 时,胎儿DNA浓度比子痫前期一子痫再增加4.3倍,母体血浆 中总DNA浓度再增加17.9倍.Zhang等"发现,子痫前期- 子痫妇女血浆总DNA定量较正常妊娠妇女增高1O倍 (219023.9copies/ml,2O235.8copies/m1).Tae等在妊娠 11—22周时抽取孕妇外周血检测胎儿DNA,发现后来发展 成子痫前期-子痫孕妇的胎儿DNA高于正常孕妇(41.9gene/ ml:22.Ogene/m1),即子痫前期一子痫的孕妇在有I临床症状前 孕妇血浆胎儿DNA水平已经异常增高.认为胎儿游离DNA 定量可以作为预测子痫前期-子痫的指标. 屋生?月第15卷第6期ProgObstetGynecol,June2006,Vo1.15,No.6 胎儿游离DNA在子痫前期?子痫孕妇体内增加的现象, 可使人们对子痫前期一子痫的发病机制有更深刻的理解,由 于胎母界面的滋养层细胞受到母体免疫损伤,胎盘滋养细胞 凋亡增加而引起更多的胎儿游离DNA释放人血,是胎盘发 生异常改变的标志.L丑u等比较了子痫前期.子痫跟正常 孕妇产后循环胎儿DNA浓度比较,分别在产后5,15,30,45, 60,120,360min测定母血中胎儿DNA浓度,发现正常孕妇在 产后6h时循环胎儿DNA全部降至0,而子痫前期一子痫组无 一 人为0,子痫前期一子痫孕妇血浆中胎儿游离DNA的半衰 期为114min,而对照组为28min.因此认为,如胎盘异常很 可能导致较多胎儿DNA释放到母血中,或肝肾功能异常导 致胎儿DNA在母血中清除紊乱,造成母血中胎儿DNA的量 增多,提示母体血浆中总DNA浓度和游离胎儿DNA浓度可 用来预测子痫前期一子痫的发生及预后. 6孕妇外周血游离DNA在其他产前诊断中的应用 目前研究表明,正常孕妇血浆中胎儿DNA浓度稳定在 某一水平,而有妊娠合并症和并发症者伴有母外周血DNA 水平的异常增高,有望成为产前诊断和孕期检测的新指标. 6.1性连锁疾病X连锁隐性,显性及性染色体综合征的 提前诊断对于指导优生有一定的意义.通过检测循环胎儿 DNA可准确地测出胎儿的性别,从而为胎儿是否患有性连锁 疾病提供有价值的诊断.Hromadnikova应用实时定量 PCR技术分析孕妇血浆中Y染色体特异性序列DYS14,其男 性胎儿敏感性达97.2%,特异性达100%. 6.2Rh血型不合除了Y染色体外,研究者关注的另一个 基因即RHD基因,此基因引起RHD阳性表型.在RHD阴 性孕妇外周血清,血浆中检测到胎儿RHD基因表明RHD阳 性胎儿存在.一些研究者已经使用RHD基因的不同区带作 为靶序列进行产前诊断研究,大量报道证实,这种方法有高 度的可靠性,尤其是用于孕中期者.等用实时定量 PCR法检测57例RhD阴性孕妇血浆中RhD基因序列,结果 中,晚孕诊断符合率为100%.由于其高度准确性,母血浆胎 儿DNA的检测可望成为无创性产前诊断胎儿RhD血型的常 规诊断实验. 6.3父系遗传性疾病Pertl等报道,应用多重荧光PCR 检测到了可疑患病胎儿携有的13,18,21号染色体上的多态 性微小卫星序列.通过以女性胎儿携有父源性的位于x染 色体上的多态性微小卫星序列作为女胎DNA的特异性标记 物,对妊娠中及晚期孕妇血浆中的游离胎儿DNA进行荧光 标记PCR,其检出率分别为80%和71%.Chen等报道, 使用母血微卫星分析方法可检测到父系遗传性3p染色体远 端易位,并且证明,孕妇血浆中胎儿DNA分析可检测父系遗 传性非整倍体病.这些报道证实,母血中胎儿游离DNA分 析可用于某些遗传病的产前诊断. 6.4染色体非整倍体胎儿产前诊断染色体非整倍体胎儿 对个人和社会都具有深远的意义.Farina等…应用实时定 量PCR检测Down综合征孕妇血浆胎儿DNA,发现比正常对 照组高1.7倍.Zhong等证实,13?三体胎儿,母体循环胎 儿DNA水平高于正常对照组(185.8copies/mlVS81.9copies/ m1)(P=0.151).这一研究说明,母血中胎儿DNA对检测某 些染色体异常性疾病有意义,与其他血清生化指标联系更具 有诊断意义.然而,在某些染色体病的产前诊断方面,胎儿 有核细胞的基因组分离和检测较胎儿游离DNA更有意义, 如:从母血中分离出胎儿细胞后,进行荧光原位杂交来明确 诊断胎儿染色体异常. 6.5早产孕妇血浆血清中胎儿DNA浓度的连续性检测 显示,孕妇血中胎儿DNA的浓度随孕周的进展而升高,在孕 32周之后,又一个突然的升高.提示在母儿的胎盘接触面上 可能发生了某些变化.这种胎儿DNA浓度的生理性升高预 示着分娩的临近. Leung等已证实,随孕周进展母体血清中胎儿DNA 浓度不断增高,而且这种增高在早产时可能发生的更早.他 认为,在自发性早产前母体血浆中胎儿DNA浓度升高的生 物学基础可能是在分娩前胎盘的屏障被打破所致.孕妇血 浆胎儿DNA浓度水平在足月产时要比早产时高,在妊娠最 后8周,母血中可检测高浓度的胎儿DNA.他对20例妊娠 26,34周自发性早产的孕妇血浆中胎儿DNA进行分析,结 果显示早产组为124.8(67.8,568.2)copies/ml,对照组为 65.8(44.3,143.3)copies/ml,早产组明显升高.同时比较 了治疗成功者和治疗无效者,前者较后者低,为46.3(8.8, 79.4)copies/ml比11.9(78.8,439.1)copies/ml,提示胎盘 屏障受到破坏,增加了胎儿DNA的释放.因此可应用此原 理,对妊娠进行检测,可区分真性早产和经产科治疗可治愈 的早产.胎儿DNA的含量测定可作为预测早产的指标. 6.6羊水过多Zhong等检测1例羊水过多的孕妇外周 血中胎儿DNA和有核红细胞的量,结果表明,比正常孕妇明 显增高,胎儿DNA为749.2基因组/当量比404基因组当量/ ml,有核红细胞为321/ml比5/ml,认为可能对诊断胎源性羊 水过多有意义. 此外,在遗传性疾病的产前诊断中具有广泛的应用前 景,可通过测定SRY基因确定胎儿性别,进行性连锁遗传病 的产前诊断. 7结论及对未来的展望 虽然循环胎儿DNA的研究仅有数年时间,但是产前诊 断方面的研究有着极其广泛而且深远的应用价值,特别是随 着人类基因组计划的进展,必定会有更多胎儿DNA遗传标 志可用于产前诊断.然而仍有许多问题有待于解决:(1)生 物学上胎儿DNA的释放机制尚未明确,参与这种DNA释放 过程中的优势细胞群尚未得到证实,这对了解循环胎儿DNA 的生物学活性具有非常重要的意义;(2)母血循环中胎儿 DNA是否有转录活性.最近发现,母胎血浆DNA的嵌和性 也是一种双向现象,母血中可找到胎儿DNA,在胎血中也可 463 现代妇产科进展2006年6月第15卷第6期 ProgObstetGynecol,June2006,Vo1.15,No.6 找到母DNA,这可为进一步研究母胎之间交互作用的研究打 开新局面;(3)母血中提取胎儿DNA面临以下的问题:PCR 的假阴性,假阳性问题,胎儿性别的局限性,大部分染色体病 不能有效诊断等.最重要的是,很多病理妊娠的发病机制不 明确,现可通过研究母血中胎儿DNA,在分子生物学水平上 揭示疾病的发生,发展,以预测疾病的发展趋势及预后. 健康孕妇血浆中胎儿DNA浓度已形成一个平台,在此 基础上能够研究妊娠相关性疾病胎儿DNA的异常.孕妇外 周血中存在胎儿游离DNA,其浓度较高,比胎儿细胞法更快 ,简便易行,而且产后短时间内即可清除,不会干扰 速,可靠 诊断,有利于临床推广应用.有学者应用实时RT—PCR技术 在母血浆中检测到胎盘分泌的胎儿促肾上腺皮质激素释放 激素mRNA,无需依赖胎儿性别和多态性分析即能发现,且 此mRNA较稳定,使我们对血浆中存在的亚细胞微粒有了更 深刻的认识.我们希望未来能简化母血中胎儿游离DNA的 提取及检测方法,并进一步拓宽其在产前诊断中的应用. [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] 464 参考文献 LoYMD.FetalDNAinmaternalplasma:biologyanddiag— nosticapplications[J].ClinChem,2000,46:1903—1906 SekizawaA,SamuraO,ZhenDK,eta1.Apoptosisinfetal nucleatederythrocytescirculatinginmaternalblood[J]. PrenatDiagn,2000,20:886-889 WataganaraT,ChenAY,LeshaneES,eta1.Cell—freefetal DNAlevelsinmaternalplasmaafterelectivefirst—trimester terminationofpregnancy[J].FertilSteril,2004,81:638— 644 OhashiY,MihanN,HondaH,eta1.Correlationoffetal DNAandhumanchorionicgonadotropinconcentration [J].ClinChem,2002,48:386—388 LoYMD,ZhangJ,LeungTN,eta1.Maternalplasmafetal DNAfrommaternalplasma[J].AmJHumGenet,1999, 64:218-224 BotezatuI,SerdyukO,PotapovaG,eta1.Geneticanalysis ofDNAexcretedinurine:anewapproachfordetecting specificgenomicDNAsequencesfromcellsdyinginan organism[J].ClinChem,2000,46:1078—1084 BischoffFZ,DangDX,Marquez—DoD,eta1.Detectingfe— talDNAfromdriedmaternalbloodspots:anotherstepto— wardsbroadscalenon—invasiveprenatalgeneticscreening andfeasibletesting[J].ReprodBi0medOnline,2003,6: 349.351 LauTW,LeungTN,ChanLY,eta1.FetalDNAclearance frommaternalplasmaisimpairedinpreeclampsia[J]. ClinChem,2002,48:2141—2146 LoYMD,LeungTN,TeinMSC,eta1.Quantitativeabnor— malitiesoffetalDNAinmaternalseruminpreeclampsia [J].ClinChem,1999,45:184—188 FarinaA,SekizawaA,SugitoY,eta1.FetalDNAinma— ternalplasmaasascreeningvariableforpreeclampsia [J].PrenatDiagn,2004,24:83—86 TaeN,Leung,JunZhang,eta1.Increasedmaternalplas— mafetalDNAconcentrationsinwomenwhoeventually developpreeclampsia[J].ClinChem,2001,47:137—139 ZhangXY,LaivuoriH,LivingstonJC,eta1.Elevationof bothmaternalandfetalextracellularcirculatingdeoxyri— bonucleicacidconcentrationsintheplasmaofpregnant womenwithpreeclampsia[J].AmJObstetGynecol, 2001.184:414-419 HromadnikovaI,HoubovaB,HfidelovaD,eta1.Repli— caterealtimePCRtestingofDNAinmaternalplasmain— creasesthesensitivityofnon-invasivefetalsexdetermi- nation[J].PrenatDiagn,2003,23:235-238 LoYMD,HjelmNM,FidlerC,eta1.Prenataldiagnosisof fetalRh(D)statusbymolecularanalysisofmaternal plasma[J].NEnglJMed,1998,339:1734—1738 PertlB,SikizawaAK,SamuraL.eta1.Detectionofmale andfemaleDNAinmaternalplasmabymultiplexfluores— centpolymerasechainreactionamplificationofshorttan— demrepeats(STRs)[J].HumGenet,2000,106:45-49 CbenCP,ChernSR,WangWF,eta1.DNAinmaternal plasma:theprenataldetectionofapaternallyinherited 357 fetalaneuploidy[J].PrenatDiagn,2000,20:353— FarinaA,LeshaneES,LambertMGM,eta1.Evaluationof cel1..freefetalDNAasasecond..trimestermaternalserum markerofDownsyndromepregnancy[J].ClinChem, 20o3.49:239—242 ZhongXY,BurkMR,TroegerC,eta1.FetalDNAinma— ternalplasmaiselevatedinpregnancieswithaneuploid fetuses[J].PrenatDiagn,2000,20:795-798 Leungtn,ZhangJ,LauTK,eta1.Maternalplasmafetal DNAasamarkerforpretermlabour[J].Lancet,1998, 352:1904—1905 ZhongXY,HolzgreveW,LiJC,eta1.Highlevelsoffetal erythroblastsandfetalextracellularDNAintheperipher- albloodofapregnantwomanwithidiopathicpolyhydram— nios:casereport[J].PrenatDiagn,2000,20:838—841 (收稿日期2005—12-07) 1J1J1J1J1J1J1J1J1J1J1J m?加 rlrLrlrlrLrlrlrlrlrlrlrl