通脉醒脑滴丸入血成分分析及透血脑屏障研究

通脉醒脑滴丸入血成分分析及透血脑屏障研究 成都中医药大学 硕士学位通脉醒脑滴丸入血成分分析及透血脑屏障研究 姓 名:肖莹莹 申请学位级别:硕士 专业:药物化学 指导教师:张艺 2008-05 成都 中医药大学硕士学位论文 摘 要 随着社会生活方式的改变以及人口老龄化，心脑血 管疾病已是威胁人类健康的最大疾病之一。中医的整体观和辨证论治、中药及其复 方的化学成分复杂性和作用机制多样性，使中药及其复方在缺血性脑中风的治疗上 有独到之处。 通脉醒脑滴丸(简称CD)是以灯盏细辛有效部位、川芎有效部位等 研制而成的治疗缺血性脑中风的创新中药。但是，由于其药效物质基础不清楚，使 质量控制上存在一定的问题。 目的: 本文以吸收、分布、代谢为切入点，阐释通 脉醒脑滴丸治疗缺血性脑中风的药效物质基础。 方法: 1 采用HPLC梯度洗脱法 进行了通脉醒脑滴丸入血成分分析，在此基础上以主要入血成分为指标，进行了通 脉醒脑滴丸药物动力学研究，采用DAS2.1.1统计软件拟合药物动力学参数。 2 采用 MTT微量自动比色法，研究了野黄芩苷及川芎有效部位对体外培养大脑皮层神经细 胞存活率的影响。 3 采用脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养模拟血脑屏障的 方法，进行了透血脑屏障化学成分研究。 结果: 1 大鼠灌胃给药后，主要入血成 分为野黄芩苷，药时曲线呈现二室开放模型，T1/2为2.925?0.706 h，Tmax为 4.400?0.548 h，Cmax为0.638?0.260 mgL-1，AUC0-18h为4.528?2.18 mgL-1h，CL/F 为3.140?1.910 Lh-1kg-1，V1/F为1.404?1.306 Lkg -1，MRT0-18h为7.187?1.055 h。 2 与空白对照组比较，野黄芩苷仅在较高浓度时能促进细胞体外存活(Plt0.01)，而 川芎有效部位较低浓度时能明显促进细胞存活(Plt0.01)，川芎有效部位及通 脉醒脑滴丸中藁本内酯能透过血脑屏障，进入脑组织，起到脑神 课题来源:国家自 然科学基金项目 基于钙信号通路调节的中药脑靶向神经保护有效成分筛选方法研 究 30672602、四川省科技厅攻关项目 创新中药新药的研究开发,川灯醒脑滴丸治 疗缺血性中 风创新药物研究2006z08-074 1 成都中医药大学硕士学位论文经保护 的作用 3 藁本内酯能透过体外培养血脑屏障模型，野黄芩苷不能透过，并且复方中 藁本内酯的透过率，比单独使用川芎有效部位，藁本内酯透过率提高了近40,，提 示复方配伍应用后，可能促进了血脑屏障开放，提高了藁本内酯的透过率， 结论: 本文通过对通脉醒脑滴丸入血成分分析及透血脑屏障研究，揭示了通脉醒脑滴丸药 物动力学性质，初步阐释了通脉醒脑滴丸治疗缺血性脑中风的药效物质基础，为制 定科学合理的质量控制标准奠定了科学的理论基础。 创新性: 本文采用脑微血管 内皮细胞与星形胶质细胞共培养模拟体外培养血脑屏障的方法，预测通脉醒脑滴丸 有效成分能否透过血脑屏障，建立了有效、快速筛选中药中具有透血脑屏障的化学 成分的方法，有助于揭示中药及其复方治疗缺血性脑中风的药效物质基础及作用机 制。关键词:通脉醒脑滴丸;缺血性脑中风;野黄芩苷;藁本内酯;入血成分; 血 脑屏障;药效物质基础 2 成都中医药大学硕士学位论文 Abstract As society lifestyle changes and population ageing cardiovascular andcerebrovascular diseases have become one of the biggest threats to human health.Because of the overall concept determination of treatment based in pathogenesis ofTCM the complexity of the chemistry components of traditional Chinese medicineand compounds and the diversity of mechanisms the therapy of ischemic stroke hasits own character. Tongmai Xingnao dripping pillsCD consists of scutellarin Chuanxiong volatileand other constituents as a innovative Chinese medicine of the treatment of ischemicstroke. However because of the indistinctness of its effective substances the qualitycontrol has some problems. Objective: The paper according to the drug absorption distribution and metabolismilluminates the effective material foundation of the treatment of ischemic stroke Methods: 1 With the method of HPLC gradient elution to analyze the blood component ofCD the principal blood components as an index were studied the pharmacokinetics ofCD using statistical software DAS2.1.1 to fit pharmacokinetic parameters. 2 MTT automated colorimetry was used to study the survival rate of cerebralcortex nerve cells of the scutellarin and rhizoma Chuanxiong volatile oil in vitro. 3 With the method of co-cultivating brain microvascular endothelial cells andastrocytes the chemical constituents of the blood-brain barrier were studied. Results: 1 The results showed that after rats intragastric administration of CD the mainblood components was scutellarin concentration-time curve became two cabinet openmodel and T1/2 was 2.925?0.706 h，Tmax 4.400?0.548 h，Cmax 0.638?0.260 mgL-1AUC0-18h 4.528?2.18 mgL-1h CL/F 3.140?1.910 Lh-1kg-1 V1/F 1.404?1.306 Lkg-1 and MRT0-18h 7.187?1.055 h. 3 成都中医药大学硕士学位论文 2 As compared to blank group scutellarin promoted the survival rate of cells invitro only in high concentrationsPlt0.01 and in lower concentrations rhizomaChuanxiong volatile oil significantly promoted cell survival ratePlt0.01. 3 Ligustilide could permeate through blood-brain barrier model in vitro andscutellarin could not. And ligustilide in the compounds had increased nearly 40compared to rhizoma Chuanxiong volatile oil in solo appliance Conclusion: In this paper the analysis of the blood constituents and the blood-brain barrier ofCD has revealed the nature of pharmacokinetics and defined that the scutellarin andrhizoma Chuanxiong volatile oil could pass through the blood-brain barrier to protectcerebral nerve and promote the open of the barrier to raise the crossing rate ofligustilide without scutellarin permeated which might protect nerves from other ways.the effective components of CD have been initially clarified. The improvement of thescientific quality standards has laid the foundation of interpretation. Innovation: In this paper co-cultured brain microvascular endothelial cells and astrocytes invitro has estimated whether the active ingredients of CD could pass through theblood-brain barrier. Combined with the modern techniques analysis of GC-MS andothers to analyze the ingredients and identify the structure a new method of theeffective and rapid screening of the chemical composition of traditional Chinesemedicine in the blood-brain barrier permeability has been applied and the effectivecompound of Chinese medicine and its treatment of ischemic stroke have also beenrevealed to therapy ischemic stroke.Key words: Tongmai Xingnao dripping pills Ischemic stroke ScutellarinLigustilide Constituents migrating to blood Blood-brain barrier Pharmacodynamicmaterial basis 4 成都中医药大学硕士学位论文 英文缩写词对照表HPLC High performance liquid chromatography 高效液相色谱法GC-MS Gas chromatography-Mass spectrometry 气 相色谱,质谱联用法LC-MS Liquid chromatography-Mass spectrometry 液相色谱, 质谱联用法EDTA Ethylenediamineteraacetic acid 乙二胺四乙酸RSD Relative standard deviation 相对标准偏差 SD Standard deviation 标准偏差AUC Area under concentration time curve 浓度-时间曲线下面积 T1/2 Biological half-life 生物半衰期 Ke Elimination rate constants 消除速率常数 Ka Absorption rate constants 吸收速率常 数 CL Total body clearance 体内总清除率 Vd Apparent volume of distribution 表观 分布容积MRT Mean residence time 平均滞留时间VRT Variance of residence time 滞 留时间方差BBB Blood-brain barrier 血脑屏障CNS Central nervous system 中枢神经 系统BMEC Brain microvascular endothelial cells 脑毛细血管内皮细胞 AC Astrocytes 星形胶质细胞BSA Bovine serum albuminnn 牛血清白蛋白b-FGF Basic fibroblast growth factor 碱性成纤维细胞生长因子CNS Central nervous systern 中枢神经系统DMEM Dulbeeeo’s modified eagle’s medium 达尔伯克(氏)改良伊格 尔(氏)培养基DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 EB Evan’s blue 伊文思兰ECGF Endothelial cell growth factor 内皮细胞生长因子 FBS Fetal bovine serum 胎牛血清 7 成都中医药大学硕士学位论文GFAP Glial fibrillary acidic protain 胶质纤维性蛋白NSE Neuron Specific Enolase 神经匾煨韵?蓟 窰EPES 4-2-Hydroxyethyl-1- 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 piperazineethanesulfonic acidMTT 3-45-Dimethy-2-thiazolyl-25-diphenyl- 3-(4 5-二甲基噻唑基) 2H- tetrazolium bromide -25-二苯基四氮唑溴盐 PBS Phosphate buffered solutionnn 磷酸盐缓冲液液 SD Sprague Dawley 远交群大鼠 TJ Tight junction 紧密连接TEER Transendothelial electrieal resistance 跨内皮电阻TEM Transmission electron microscopy 透射电镜 8 成都中医药大学硕士学位论文 声 明 硕士学位论文通脉醒脑滴丸入血成分分析及透血脑屏障研究是本人在成都中医药大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的，该论文成果归成都中医药大学所有。有关学位论文成果的开发、转让、论文发表等，均需征得导师和成都中医药大学同意。 导 师签名: 硕士生签名: 年 月 日 75 成都中医药大学硕士学位论文 引 言 随着社会生活方式的改变以及人口的老龄化，心脑血管疾病的发病率呈现上升趋势，它已是威胁人类健康的最大疾病之一。在世界范围内，脑血管疾病是第二大死亡率的疾病，也是最大的致残性疾病，其中由脑部血液供应障碍，缺血、缺氧引起脑组织坏死软化形成的脑梗塞，是最常见的缺血性脑中风，约占脑血管病的 75,，有相当高的病死率，80,的存活者留有不同程度的功能障碍， 40, 约重度致残，严重影响病人的生活质量。发展中国家的中风患者死亡率超过全球总数的 2/3。我国作为人口总数最多的?怪泄 遥 磕昃托略?150,200 万的中风 1患者，严重影响了患者的生存质量，并且带来了严重的经济负担 。医学界已付诸了极大的努力来研究其病理机制和防治措施。 中医认为，中风病系由于气血逆乱导致脑脉痹阻，引起脑髓神机受损，临床出现突然昏仆，半身不遂、口舌歪斜、言语蹇涩或失语、偏身麻木等，其病位在脑，与心、肾、肝、脾密切相关，病因以积损正衰为主，病机多由于气血逆乱，导致脑脉痹阻。论其病性，为本虚标实之证，本虚在于肝肾不足，气虚血少;标实乃风火相煽，痰湿壅盛，瘀血阻滞，气机逆乱，最终导致痰瘀内阻，随气机上逆，扰乱清空，蒙蔽清窍，成上实下虚，阴阳不相维系之危急证候。其突然昏仆不省人事之症状，又可纳入窍闭神昏之范畴。中风病又分为急性期、缓解期和后遗症期。急性期以标实为主，急则治其标，当以祛邪为要。对瘀血为患之中风，治当行血、活血、通畅血脉，去瘀生新;神昏之证当开窍醒神或扶正固脱。恢复期及后遗症期多为虚实挟杂，正虚为主，缓则治其本，治当扶正祛邪。常用育阴熄风，益气活血之法;针对其后遗诸证，则当施以祛风通络、活血化瘀之法2。 因此，中医的整体观和辨证论治、中药及其复方的化学成分复杂性和作用机制多样性，使中药及其复方在缺血性脑中风的治疗上有独到之处，从中药中寻找预防和治疗缺血性脑中风的活性成分也已成为国内外研究的热点之一。 目前，对于缺血性脑中风，可选用单味中药治疗，如葛根3、川芎4-5、刺五加注射液6、灯盏细辛注射液7等。单味中药功效各有所长，性味各有所偏， ，根据方剂配伍原理选择合适的药味所谓“药有个性之专长，方有合群之妙用”组方， 可提高疗效，减轻毒副作用。近年来，在秉承古方，借鉴现代药理学对单 9 成都中医药大学硕士学位论文味中药研究成果的基础上，通过辨证论治，综合考虑风、火、痰、瘀、毒诸多因素，研制了一系列治疗缺血性脑中风临床效果良好的复方制剂，如清开灵注射液8 、三七活络饮9、疏血通注射液10等。 中医历来认为川芎以活血为主而兼行气开郁，为著名的“血中气药”，《本草汇言》称之“……味辛而阳，气善走窜而无阴凝粘滞之态，虽入血分，又能去一切风，调一切气。”可谓之能上行头目，祛风活血，疏通脑脉瘀血;又能中开郁结，善行厥阴肝经之气，疏泄一身之气机，畅通血行。亦能旁通络脉，对卒中后遗之半身不遂、口舌歪斜、言语蹇涩或失语、偏身麻木等颇有良效。灯盏细辛同样既能活血化瘀， 早在 又能上清脑络通络止痛， 《滇南本草》就记载其能治疗“左瘫右痪”11。灯盏细辛有效部位是从灯盏细辛中提取分离出的一类黄酮类成分，主要含野黄芩苷(4’56-三羫基黄酮-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷)及其它黄酮类成分。从20世纪70年代始，灯盏细辛有效部位注射液、灯盏细辛注射液、灯盏细辛有效部位片等灯盏细辛制剂已广泛应用于临床治疗多种疾病，并充分肯定了其对缺血性脑中风的显著疗效。因此，川芎、灯盏细辛二药合用，共奏行气通络，活血化瘀之功，以达到治疗中风之效。 通脉醒脑滴丸是在中医药理论指导下，根据有效部位配伍配比的原理，运用现代有效部位提取方法及制剂工艺技术，以灯盏细辛有效部位、川芎有效部位等研制而成的治疗缺血性脑中风的创新中药，具有活血化瘀，开窍醒神之功效。课题组前期药效实验表明，通脉醒脑滴丸具有改善神经功能障碍、减小脑梗死比率、减轻脑水肿、减轻脑组织病理损伤，抗血栓形成，改善软脑膜微循环，提高脑组织对缺氧的耐受等作用。 但是，通脉醒脑滴丸在体内到底以何种成分、何种形式发挥作用，其药效物质基础不明确，使质量控制上存在一定的问题。而中药药效物质基础是中药质量控制的基础与核心，是诠释中药作用奥秘的关键12。因此，寻找适合于中药复杂体系的药效物质基础研究方法，阐明中药药效物质基础及作用的本质，一直是中药研究的关键问题。传统的中药药效物质基础研究往往遵循先化学分离、后分析鉴定，再结合药理实验以确定主成分的活性导向方法，应用此法已阐明很多中药活性成分，但这样的分离、分析操作繁琐、周期长，并且不能完全阐明中药多成分、多靶点的作用特点。若从药物的吸收、分布、代谢、排泄入手，通过测定 10 成都中医药大学硕士学位论文人体或动物各种体液、组织中药物成分及其代谢物的数量和质量变化规律，使效应成分的分离与筛选相结合13，以此建立中药复方药效物质基础的生物活性成分筛选,色谱联用分析方法，这样不但有助于阐明其药效物质基础，揭示作用机制，也有助于建立起科学合理、有效的质量控制标准，促进中医药理论创新及我国自主知识产权的新药研发。 因此，本文以通脉醒脑滴丸的吸收、分布、代谢为切入点，运用HPLC、GC-MS等现代检测手段及体外培养血脑屏障模型，进行了通脉醒脑滴丸入血成分分析及透血脑屏障化学成分研究，探索复方药效物质基础、方剂组方原理及配伍规律，指导临床合理用药，促进中药剂型改革，同时为复方治疗缺血性脑中风的作用机制奠定科学的理论基础。在明确药效物质基础上进行制剂质量控制体系研究，有助于制定科学有效的质量控制方法，确保其有效性和安全性。 实验研究思路见下图。 11 成都中医药大学硕士学位论文 通脉醒脑滴丸 以吸收、分布、代谢为切入点入血成分分析 透血脑屏障研究大鼠血浆 体外培养大脑皮层 体外培养血脑屏障 神经细胞 模型 揭示通脉醒脑滴丸治疗 缺血性脑中风的药效物质基础 建立基于中药复方药 效物质基础的生物活性成分筛选,色谱联用技术的分析方法 建立通脉醒脑滴丸 质量控制标准 12 成都中医药大学硕士学位论文 正 文 第一章 通脉醒脑滴丸入血成分分析 中药口服给药后，经消化道、肠道菌群作用，生成一种由中药固有成分及其代谢产物组成的混合物，有的直接被排泄，有的被选择性吸收，经肝酶作用进入血液，通过血液运输到各个器官组织或靶点，并在达到一定的血药浓度时才能真正起效。可见，不论中药含有多少成分，只有进入血液的成分才有可能成为有效成分(外用药及直接刺激胃肠道药物除外)14。并且药物成分即使能被吸收入血，但由于其药物动力学性质不理想，如首过效应较强或不易通过肠黏膜被吸收，生物利用度太低;或者代谢太快，半衰期太短等原因，使进入临床试验后约有40,的药物被淘汰，这足以说明药物动力学研究在创新药开发研究中的作用15。 因此，本文采用HPLC梯度洗脱法探讨了大鼠灌胃给药通脉醒脑滴丸后，有效成分吸收入血的情况，在此基础上.