MASA-PCR检测甲状腺乳头状癌中BRAF^V600E点突变的研究

MASA-PCR检测甲状腺乳头状癌中BRAF^V600E点突变的研究 MASA-PCR检测甲状腺乳头状癌中 BRAF^V600E点突变的研究 第23卷第5期 2005年l0月 石河子大学学报(自然科学版) JournalofShiheziUniversity(NaturalScience) V01.23No.3 Oct.20o5 文章编号:1007.7383(2005)05.0551—05 MASA.PCR检测甲状腺乳头状癌中BRAFv6ooE点 突变的研究 尹香利,张国昌,李锋,赵瑾,李洪安,梁伟华 (石河子大学医学院,新疆石河子832o02) 摘要:采用突变等位基因特异性扩增法(mutantauelespecificamplication,MASA.PCR) 检测了125例甲状腺石蜡包埋 组织中腿AFv删点突变(包括94例甲状腺癌,l5例甲状腺腺瘤,15例结节性甲状腺肿和1例癌旁正常组织),探讨 甲状腺乳头状癌(PTC)与其临床病理学特征之间的关系.结果发现,仅在PTC和l例甲状腺未分化癌中检测到 BPJtFvf~OE突变,PTC中突变率为68.4%(57/83),主要见于经典型PTC和微小癌,其突变率分别为73%(52/71)和2/ 3,在其它类型的甲状腺癌及良性病变中均未检测到BRAF煳突变.临床病理资料显示,患者发病平均年龄为45 岁,突变率在40岁以上者显着高于4o以下者(x=4.69,P<0.05),而与性别,淋巴结转移,慢性淋巴细胞浸润无显 着关系(P<0.05).结果显示,1)职A岫突变仅发生于PTC和部分未分化癌,是PTC中较常见的遗传学事件,可 为PTC的发生机制提供新的视点.2)BRAF嘲砸突变主要见于经典型PTC和微小 癌,可能是甲状腺乳头状癌型的 重要决定因素之一. 关键词:BRAFv~;突变;癌;乳头状;NASA-PCIt 中图分类号:11736.1文献标识码:A 甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,它 的发生发展涉及到多种癌基因的活化,抑癌基因的 失活或突变等多种遗传学改变,如甲状腺乳头状癌 (papillarythyroidcancer,眦)中的RET/PTC,TRK重 排,HRPT2突变;滤泡癌中常见的RAS,GSP,TSHR 突变等.2002年Davie【1J等在66%的恶性黑色素瘤 和一系列的其它肿瘤中检测到BRAF基因体细胞突 变,该突变主要见于BRAF基因11和l5外显子的 激酶结构域内,80%以上的突变都是l5外显子l799 位核苷酸上的单碱基颠换,致使其编码的氨基酸由 缬氨酸转变为谷氨酸.之后,不同国家和地域的学 者在PTC中检测到了BRAFv6ooE突变,但在其它的甲 状腺良恶性肿瘤中均未检测到.从而说明,PTC中 BRAFwooE突变可能是继RET/PTC重排后的又一重 要遗传学事件,其在PTC的发生机制中起着重要作 用.由于BRAF60.E突变率从28%83%E2-5]差异 很大,且BRAFV鲫突变及其临床病理学特征之间的 关系仍有争议,为此,我们检测了94例甲状腺癌及 31例其它类型的甲状腺良恶性肿瘤中BP&F60.E突 变,旨在进一步探讨BRAFv6ooE突变和临床病理学特 征之间的关系. 1材料和方法 1.1材料 收集了新疆石河子大学医学院第一附属医院病 理科1983—2005年的石蜡包埋组织125例,其中 PTC83例,滤泡癌7例,髓样癌2例,未分化癌2例, 甲状腺腺瘤l5例,结节性甲状腺肿l5例及癌旁正 常组织l例.所有病例均由两名以上病理学教授按 照世界卫生组织分类标准进行形态学观察并作出诊 断. 1.2方法 1.2.1组织DNA的抽提 石蜡包埋组织5,um厚,l0张放入2.0mL消毒离 心管中,加入1.5mL二甲苯脱腊,55?水浴10min, 4~C90(0)r/rain离心5min,弃上清,重复1次;加入1.5 mL无水乙醇,室温上下颠倒混匀10min,4?900Or/ min离心10min,弃上清,重复2次;用滤纸干燥后加 收稿日期:2005.09.05 基金项目:新疆生产建设兵团专项基金资助(NKBo2sDXNK34)) 作者简介:尹香利,女(1976-),硕士生,主要从事甲状腺肿瘤病理学研 究.e_mail:xiangli.yin@163.toni. 552石河子大学学报(自然科学版)第23卷 入细胞裂解液(0.02mol/Lriffs.Hcl,0.02mol/L EDTA,2%SDS)250uL,短暂混匀后加入20mg/mL蛋 白酶K5O(终浓度为0.3mg/mL)55%水浴过夜;待 组织完全溶解后于95?加热5min,灭活蛋白酶K; 等体积嘶8饱和酚(pH8.0),酚氯仿(1:1),氯仿异 戊醇(24:1)各抽提1次,混匀,12000r/rain离心 10min;移水相,加入2倍体积预冷无水乙醇,置于一 20冰箱30rain,沉淀DNA;12000r/min离心10rain, 弃上清,加入1.5mL75%乙醇溶液,洗涤DNA沉淀1 次,10000r/min离心10min;弃上清,干燥10rain,加入 ,IE5O(pH8.O)溶解DNA12—24h,提取的DNA置 于一2O?冰箱保存备用. 1.2.2引物的合成 所需扩增BRAF基因突变的引物由上海生工生 物工程有限公司合成.引物序列见表l. 表1引物序列 引物名称引物序列 BRAF-Ft5'-TAGGTGATITIgGTCTAGCrACAGT-3 BRAF-F25'-GG~IV.ATITrGGTCTAGCrACAAA-3 BRAF-R5'-GGcC^AAAAI1-rAAI?AC1EGA.3 配对方式:Fl和F2分别为上游有意义引物,R 为共同的下游反义引物,其中F.和R配对扩增出通 用片段,长131bp;F2和R配对扩增出突变型目的片 断,长129bp. 1.2.3PCR反应 所用的试剂均购自上海生工生物工程有限公 司.PCR反应体系为25止,内含双蒸水16.1/,L,10 XPCRbuffer2.5L,MgC12(25mmol/L)2.0vL,dNTP (200mmol/L)0.5ttL,上下游引物(25pmol/uL)各0.8 止,Taq酶(5u/L)0.2p.L,模板2.O(约200ng). PCR反应条件:94oC5min,94?30s,56?45s,72? 45s,72oC10rain,共35个循环.以PCR扩增后测序 确定有突变的样本作为阳性对照,以消毒双蒸水代 替DNA模板作为空白对照.取PCR产物5,2% 琼脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色,凝胶成像仪下观察 并照相.对于第一次用突变引物扩增未出现目的片 断的样本,将循环次数改为40次,重新PCR扩增. 1.2.4PCR产物测序 将PCR产物送往上海基康生物技术有限公司 纯化并测序,以证实PCR结果的可靠性,并将测序 结果经BLAST基因服务网站进行比对以确定有无 突变. 1.3统计学处理 采用SPSS10.0软件,用四格表资料x0检验进 行处理. 2结果 2.1临床病理学特征 83例PTc病例中女性62例,男性2l例,男女比 例为1:3.年龄范围l2,72岁,平均年龄45岁.83 例FIE中经典型7l例(85.5%),微小癌3例(3.6%), 滤泡亚型5例(6.O%),嗜酸细胞型2例(2.4%),高细 胞型1例(1.2%),透明细胞型1例(1.2%),年龄?4o 岁者39例(47.O%),发生部位左右无差异,25.3%伴 淋巴结转移(21/83),2例有复发. 2.2分子遗传学分析 2.2.1BRAFw0E点突变检测用通用引物扩增出 的BRAF基因第15外显子PCR结果见图1A;用突 变引物扩增出的15外显子突变样本PCR结果见图 1B,在相应位置上出现条带者为突变样本. M1'23456P-NM1234567P'N 一501bp 一13lbp M:标记物(5c..:O1bp);P:阳性对照;N:阴性对照; l一7:PFC病例通用引物扩增片段(t3tbp) A ---,501bp -*129bp M:标记物(50-501bp);p:阳性对照;N:阴性对照; l,7:对应病例突变引物扩增片段(129bp), *代表BRAFv~oE突变 B 图1FffC病例BRAFwooE突变检测结果 83例PTC中,56例(68.4%)检测到BRAF6..性13例,女性44例,年龄12—72岁,平均年龄43 突变,随机抽取6例进行测序,均为杂合性突变(第岁,其中39例(68.4%)?40岁,2l例(25.3%)发生 1799位核苷酸中碱基T变为A或有双峰出现,图了淋巴结转移.统计学分析显示,BRAF突变在年 2),BRAF阳性病例与临床病理学特征和组织学分龄分布上有差异,而与性别,淋巴结转移,慢性淋巴 型的关系见表2,3.发生BRAF瑚E突变的患者中男细胞浸润无关系.BRAF6..E突变主要在经典型PTC 第5期尹香利,等:MASA-PCR检测q1状腺乳头状癌中BR咖点突变的研究553 和微小癌中检测到,在其它亚型中检出率低,对照组中均未检测到BRAFvc~oE突变. T I 90?100 TACAGTGAAATC AcA 上GAAATcTc智G薯TAcAGA广rl100 TGAAATG 注:A为正常组织,B,C分别为BRAF咖突变的PrC病例(第1799位核苷酸碱綦上有双峰出现;对应图lB中的第 1和第5号样本PFC病例) 图2BRAF哪突变病例测序结果 表2BRAF基因突变与临床病理学特征的关系BRAF基因核苷酸序列第1外显子 缺失了一个密码 组别例数_尸 表3P'I'C不同组织学亚型中BRAF突变情况 3讨论' BRAF基因是1988年由shuntakoikawa等【6j首 先在尤文氏肉瘤中发现并克隆确认的,因其与c.mf 和A.mf具有相当高的同源性,故称其为BRAF.该 基因属于RAF家族成员,位于染色体7q34,大小为 190Kb,含有七个转录区,包括l8个外显子,编码一 个67KD,99KD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,参与细 胞的增殖,分化和凋亡.现已证实,BRAF基因可在 恶性黑色素瘤,肠癌,卵巢癌等多种肿瘤中发生突 变,根据NCBI基因库核苷酸序列NM004333,此种活 化性错义突变以前被称作T1796A,由于该基因库中 子,而后随着NCBI基因库核苷酸序列M79l4的 修正,此突变现被称作BRAFT1799A,从而导致了其 蛋白质产物中V600E的转换.由于该突变中在599 位的苏氨酸活化性磷酸化位点附近插入了一个负性 调节残基,可模拟活化区域的磷酸化过程,使BRAF 基因与维持其失活态的ATP结合环活化区的联系 中断,从而级联式激活,并通过RAS.RAF.MEK.MAP 激酶信号传导通路而引起细胞的异常增殖和分化, 最终导致肿瘤的形成.同时,Sithamandam[7j和 Meroer-8J等证实BRAF基因为MAPK通路中最强的 活化因子,将BRAF突变体转染到NIH3T3细胞内, 其转化效率比野生型BRAF增强了70,138倍,从 而更加支持BRAF突变可能通过RAS.RAF-MEK. MAPK通路致癌的主要机制. 迄今为止,不同的研究报导中BRAF咖突变率 不尽相同,从28%83%不等,主要与不同地域及 民族背景等流行病学因素有关,此外,有学者认为可 能与PIE的亚型分布有关.但其热点突变均为 BRAF,其它类型的甲状腺良恶性肿瘤中未检测 到此突变,从而有助于甲状腺癌的诊断与鉴别诊断, 如PCT与甲状腺腺瘤乳头状增生,结节性甲状腺肿 乳头状增生等病变的鉴别.本研究在68.4%的VIE 及l例未分化癌中检测到了BRAF鲫突变表明 BRAF突变是眦表型的重要决定因素之一,也为 高分化型PTC进展为未分化癌的观点l9j提供了依 据.同时,本研究还在2/3微小癌中检测到了 BRAF?突变,说明BRAF突变可能在PTC形成的 早期发挥着重要作用.Knauf~10]等通过诱导转基因 鼠甲状腺细胞发生BRAF?突变而引发PTC形成 的实验也充分说明了这一点.在此小鼠模型中VIE 可进一步进展为侵袭性更强的低分化性PTC,因此, 石河子大学学报(自然科学版)第23卷 提示我们,BRAF突变与较差的临床预后有关,但尚 需延长随访时间进一步证实. 研究证实,BRAF突变主要见于经典型PTC和 高细胞型PIE,而本研究在高细胞型PIE样本中未 检测到BRAF突变,可能与高细胞型PIE样本例数 少有关,同时仅在1例滤泡亚型PTC中检测到BRAF 突变,在滤泡癌中未检测到此突变.但以往的研 究表明30%一50%的滤泡癌及约10%的滤泡亚 型PTC中均有RAS突变,从而支持BRAF突变与 RAS突变可能在肿瘤发生的不同时期不同阶段发挥 重要作用的观点,也提示PTC不同亚型其发生的分 子生物学事件可能不同,进而影响到其临床预后. 本研究检测到BRAF突变的1例未分化癌中既有 PTC成分又有未分化癌的成分,表明BRAF突变是 PTC进展的一个潜在性预后因子,高细胞型PTC和 由PTC进展而来的低分化及未分化癌中BRAF突变 可能与甲状腺癌的侵袭性生长特性有关.此外,本 研究中淋巴结转移组与无转移组之问差异无显着 性,因此有待于扩大样本进一步研究. 大量的研究发现,黜600E突变,RET/PTC重 排及RAS突变可能通过PET/FIE.RAS.BRAF信号 传导通路发挥作用,但除了1例报导有BRAF突变 与RET/PTC重排在甲状腺癌在中共存?以外,所 有的研究证实这三种遗传学事件相互独立存在.因 此,Xing[12]等认为这三种遗传学事件任何一种已足 以促使甲状腺癌的形成,虽然它们都处于同一信号 传导通路中,但其发挥作用的步骤可能不同,这就支 持BRAF突变可作为PTC发生的一个独立事件,前 面的转基因鼠模型也充分的说明了这一点.令人迷 惑的是最近发现的RASSF1A及AKAP9.BRAF融合 基因也参与甲状腺癌的发生发展[13,14],但其与以上 三种遗传学事件也相互独立存在,从而说明甲状腺 癌的发生不同阶段涉及不同的癌基因,但这些遗传 学事件是否为独立事件尚有争议,需要进一步的研 究探讨. 参考文献: [1]DaviesH,BignellGR,etnf.MutationsoftheBRAFgenein humancancer[J].Nature,20O2,417:949-954. 2JCohenY,XingM,etal,BRAFmutationinpapi~arythyroid carcinomalJj+NailCancerInst,20o3.95:1454-l457+ 【3JFugazzolaL,MannavolaD,etnf.BRAFmutationsinanItalian cohortofthyroidcancers[J]+ClinicalEndocrinology(Oxford). 20O4,61:239-243. 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Keywords:BRAFv600;mutation;cancer;papillary;MASA.PCR