食品毒理学论文(亚硝酸钠对小鼠肝脏谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的影响)

食品毒理学论文(亚硝酸钠对小鼠肝脏谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的影响) 综合设计性实验报告 亚硝酸钠对小鼠肝脏谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT) 的影响 摘要:研究探讨亚硝酸盐急性中毒对小鼠肝损伤的作用。通过将小鼠分组后进行不同剂量的亚硝酸钠溶液灌胃，使小鼠肝脏损伤，收取小鼠血液后，利用分光光度计测定其血清的吸光值，而后利用谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)标准曲线计算出肝脏受损小鼠的GPT、GOT活力，不同剂量梯度比较就能得出亚硝酸盐对小鼠GPT和GOT活力的影响。 关键词:亚硝酸钠、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、肝脏组织 0引言 亚硝酸钠是工业用盐，由于其具有咸味且价钱便宜，常在非法食品制作时用作食盐的不合理替代品。亚硝酸盐类也是食品添加剂，起着色、防腐作用，广泛用于熟肉类、灌肠类和罐头等动物性食品。亚硝酸盐对人体的损害作用机理是使血液中的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，失去运输氧的能力而引起组织缺氧性损害。了解亚硝酸钠对肝脏的影响情况，对修订亚硝酸盐食品添加剂安全使用剂量和有效治疗亚硝酸盐急性中毒具有参考意义。 1 材料与方法 1.1仪器和药品 1(试剂 (1)磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.4):取甲液420ml和乙液80ml，混合均匀即得。 ?甲液(0.1mol/L 磷酸二氢钠):取NaHPO?12HO 35.82g，加蒸馏水溶解242 后稀释至1000ml。 ?乙液(0.1mol/L磷酸二氢钾):取无水KHPO 13.61g，加蒸馏水溶解后稀24 释至l000ml。 (2)丙酮酸钠标准液(2mmol/L):在100ml磷酸盐缓冲液中溶解22.0mg丙酮 酸钠。 (3)0.4mol/L氢氧化钠溶液:先配1mol/L NaOH{(称取NaOH 40g，用蒸馏水溶解后稀释至1000ml即得)，以1mol/L NaOH 稀释配成0.4mol/L NaOH。 (4)SGPT基质液:精确称取DL-丙氨酸1.79g和α-酮戊二酸29.2mg，放于100ml烧杯内，加入少量(约15m1)磷酸盐缓冲液及少量1mol/L的NaOH溶液使其溶解，并调pH至7.4，放入100ml容量瓶内，用磷酸盐缓冲液定容，4?冰箱保存，此液每升含α-酮戊二酸2mmol、丙氨酸200mmol。 (5)SGOT基质液:在100ml的烧杯中加入29.2mgα-酮戊二酸和2.66gDL-天门冬氨酸，再加入足量的1mol/L氢氧化钠，配成溶液，用1mol/L氢氧化钠调节pH为7.4，移入100mg容量瓶中，用磷酸盐缓冲液定容，4?温箱保存。此液每升含α-酮戊二酸2mmol、天门冬氨酸200mmol。 (6)2,4-二硝基苯肼液(1mmol/L):称取19.8mg 2,4-二硝基苯肼，加1mol/L盐酸至100ml使之成为溶液。盛于棕色瓶内备用。 (7)亚硝酸钠溶液:亚硝酸钠0.5g+蒸馏水100ml(c=5mg/ml)。 2(器材 分光光度计、注射器(1m1)、灌胃针头、试管、鼠笼。 1.2动物及分组 健康、未妊娠的小鼠。 亚硝酸钠LD220mg/kg(小鼠，经口),小鼠每只体重大概20g(0.02kg)，小50 鼠胃容量为0.4ml(400ul)。 分组灌胃 亚硝酸钠摄入质量 亚硝酸钠溶液摄入量 (c=5mg/ml) 1/20 LD 0.22mg 44ul 50 1/10 LD 0.44mg 88ul 50 1/5 LD 0.88mg 176ul 50 1.3样品制备 1(损伤鼠肝脏 取健康、未妊娠小鼠以10,四氯化碳植物油溶液灌胃(0.1m1/10g) 损害其肝脏。 2(制备血清 取损伤肝24h后的鼠全血(断头取血)放入干净试管中，静置后取其血清。同法制取健康小鼠的血清(对照)，均置入冰箱保存待用。 1.4方法 1、标准曲线的绘制 SGOT和SGPT不能用一个标准曲线，在作标准曲线时，应分别加入基质液，按1操作。 表1 SGOT和SGPT标准曲线制作步骤 单位:ml 试剂 空白 1 2 3 4 5 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 丙酮酸钠标准液(2mmol/L) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 SGPT/SGOT基质液 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 相当于丙酮酸实际含量(mol) 0 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 相当于GPT活力(IU) 0 28 57 97 150 200 相当于GOT活力(IU) 0 24 61 114 190 置37?水浴中预热5min 2,4-二硝基苯肼液 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 置37?水浴中保温20min 0.4mol/L氢氧化钠 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 混匀，37?保温10min后取出，冷却至室温，于520nm处进行比色，以蒸馏水调“0”读取各管光密度。将各管光密度减去“空白”管光密度，所得差值与其对应的酶活力单位数作图。标准曲线应作2~4套，求其均值较为理想。 2、测定鼠肝脏谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性。 (1)取干净试管3支，各标以“肝损”、“正常对照”、“水对照”，分别准确加入SGPT基质液或SGOT基质液各1.0ml。 (2)将试管置于37?恒温水浴中温热2~3min。然后在“肝损” 管中加入0.2ml肝损鼠血清;在“正常对照”管中加入0.2ml正常鼠血清;在“水对照”管中加入0.2ml蒸馏水。 (3)将上述3支试管均放入37?恒温水浴中温热60min，取出试管，立即分别加入1.0ml 2,4-二硝基苯肼液，混匀后在室温下置20min。 (4)分别加入10.0ml的0.4mol/L氢氧化钠溶液，盖好试管，混合均匀，在室温下静置5min。 肝损 正常对照 水对照 SGPT基质液或SGOT基质液ml 1.0 1.0 1.0 37?恒温水浴中温热2~3min 血清ml 0.2 0.2 蒸馏水ml 0.2 37?恒温水浴中温热60min 2,4-二硝基苯肼液ml 1.0 1.0 1.0 混匀后在室温下置20min 0.4mol/L氢氧化钠溶液 10.0 10.0 10.0 混合均匀，在室温下静置5min (5)用蒸馏水调“0”，在520nm波长处测定光密度。 (6)在标准曲线上查取各自的SGOT或SGPT含量(每毫升血清中的国际单位数，IU/ml)。 2结果与 2.1标准曲线 GPT活力0 28 57 97 150 200 (IU) 吸光值0 0.131 0.248 0.296(误0.222 0.245 (520nm) 差太大，去 除) 2.2转氨酶活性测定 试管名 光密度 SGPT含量IU 水对照 0 0 正常对照 0.405 351.3 肝损(四氯化碳) 0.640 612.4 1/20 LD 0.394 339.4 50 1/10 LD 0.373 315.6 50 1/5 LD 0.358 298.8 50 3讨论与结论 由于GOT基质液配制失败，故无法绘制GOT标准曲线，不能够得出亚硝酸钠对小鼠谷草转氨酶(GOT)的影响情况。亚硝酸钠对小鼠谷丙转氨酶的影响成负相关，亚硝酸钠剂量增加，则小鼠谷丙转氨酶活性降低。 实验中存在误差与失误。在收取小鼠血液时，由于挤压等操作手段不合理，使小鼠血液在后续处理中不能得到足够的血清，使实验数据不准确。