兔下颌骨髁状突软骨细胞的分离,培养和鉴定

兔下颌骨髁状突软骨细胞的分离,培养和鉴定 兔下颌骨髁状突软骨细胞的分离,培养和鉴 定 436一j5赢.l{jG差. 兔下颌骨髁状突软骨细胞的分离,培养和鉴定 姚向前马绪臣张震康 (北京萼面外科10.081) 摘要目的:获得均一性的兔髁状突软骨细胞.方法:机械分离乳兔髁状突软骨,分切 为约1mm.,分 别用0.25胰蛋白酶消化30rain,0.1胶原酶IA消化h以DMEM培养基体外培养, 并以原位杂交 方法进行鉴定.结果:应用c*l(I)eDNA胶原探针原位杂交阳性,软骨细胞体外培养 生长良好.结论:应 验均突敬 DN 骨细 A:~[-DNA7-晰{-将酝T,/主题词细胞,培养;原位杂交;软骨;?筒11钾,扣 中图号R78l 4 ISoLAT10N,CULTUREANDIDENTIFICATIONOFTHECHONDROCYTESFROM MANDIBULARCONDYLARARTICULARCARTILAGEOFTHERABBIT YAOXiangqian,MAXuchen,ZHANGZhenkang (Schoolo{Stomato]ogy,BeijingMedicalUniversity100081) AbstractObjective:Tocu[turetheeondytarehondrocytesoftherabbitsinvitro.Methods:The mandibu】8reondylarcartilagefromneonate】 rabbitwasdissected.cutintotheSizeof1mmorsoand thendigestedin0.25trypsinsolution{oY3OminutesandinO.1eoilagenaseIAsolution{or5 hours.Theisolatedce【】swereculturedinDMEMmediumandidentifiedbv… hybridization.Re- suits:Thec~lturedcellswereconfirmedaschondrocytesbythepositiveresultofinsituhybridi zation (al(I)cDNAprobe)andgrewwellinvitro.Conclusion-Thehomogeneousehondrocytesofth erabbit couldbeharvestedbyusingthemethodsuggestedbythepresentstudy. MeSHCeltculture;Insituhybridization;Card]age;DNAprobes 正常情况下.关节软骨是由软骨细胞,蛋白 多糖,胶原,水及少量非胶原蛋白质构成,当关 节发生病变时,关节软骨细胞及细胞外基质成 分均发生质和量的变化]. 通过分离,培养髁状究软骨细胞从而进一 步研究其生物学特性,对于研究颖下颌关节病 变的发病机制和临床治疗具有重要意义.国外 仅有个别有关髁状突软骨细胞培养研究的报 道一国内尚未见报道本实验研究了兔下颁骨 髁状突软骨细胞的分离,培养和鉴定方法. 1材料与方法 髁状突软骨细胞的分离:(1)实验动物:生 后24h内的日本大耳白兔3只(中国农业科学 院动物所提供).(2)步骤:参照Weissn等的方 法,在无菌条件下解剖分离乳兔的双侧下颌骨 髁状突,仔细剥离去除髁状突软骨面的纤维 组织,切取呈半透明状的软骨中央部分,将其切 碎成约1mm大小.加入0.25胰蛋白酶(1: 250)5ml,在37C下消化30min.离心5min(1 000r/rain),弃上清一再加入0.1胶原酶1A 5ml(美国Sigma公司生产),37C下消化5h. 用100m滤网过滤后离心5mln(1000r/: min),收集已经分离的软骨细胞.用血细胞计 数器在相差显微镜下计数后,加入DMEM细 胞培养基(美国Gibco公司生产),调整细胞密 挑向前?等兔下颌骨髁状突软骨细胞的分离,培养和鉴定No61996 度至I×10s/ml后,接种于直径35mm塑胶培 养皿内. 髁状突软骨细胞的培养:将已接种细胞的 培养皿放入5CO,37c培养箱内培养,应用 含10胎牛血清(中国医学科学院血液所提 供)的DMEM细胞培养基,每mI培养基内含 青霉素100IU一链霉素IO0抗坏血酸50 g.细胞贴壁后开始更换培养基.以后隔日换 液一次.倒置相差显微镜下观察细胞生长状况 髁状突软骨细胞的鉴定:应用核酸原位杂 交技术检查软骨细胞特异性的?型胶原mR— NA.大鼠a1(?)eDNA胶原探针质粒(美国哈 佛医学院细胞生物系NaomiFukai博士惠赠) 提取,纯化后,用地高辛DNA标记和检测试剂 盒(德国BoehringerMamheim公司生产).随 机引物法标记.细胞培养时在培养皿内放入15 mm×20mm的盖玻片,把新分离的原代细胞 以1×10个细胞/ml的细胞混悬液接种于盖 玻片上,在相差显微镜下观察细胞贴壁后开始 原位杂交,50甲酰胺杂交液.42C,杂交l6 h.对照组用PBS(pH7.4)代替n1(?)eDNA 胶原探针-其余实验步骤同前 2结果 细胞形态:酶消化分离后的细胞成圆形.24 ,48h后细胞开始伸展变形(图1),3,4d后 开始贴壁,变成梭形,多角形,以多角形细胞为 主(图2).此后,细胞密度逐渐增加,至10d左 右时细胞满底,2餍左右时细胞聚集出现散在 的结节状分布现象.随着时问延长,细胞结节逐 渐增多(图3). 原位杂交:大多数体外培养的原代细胞胞 浆内可见有密集的紫色颗粒.呈阳性结果.对照 组细胞浆内未见紫色颗粒,呈阴性结果. 3讨论 兔的下颌骨髁状突软骨分为4层.从浅表 至深层为:(1)纤维组织层;(2)增殖层;(3)软骨 细胞层;(4)肥大软骨细胞层这4层中.只有增 殖层细胞具有分裂繁殖能力-当其成熟后则只 合成软骨基质而不再分裂'.本试验仔细剥离 去除髁状突软骨表面的纤维组织,既保证了分 离细胞的均一性,又保存了分裂繁殖能力. 分离软骨细胞时,酶消化的目的在于分解 纤维组织以使细胞游离.由于下领骨髁状突软 骨内的纤维组织量少于其它软骨,因此必须严 格控制消化酶的浓度和时问.本工作在分离兔 髁状突软骨细胞时.曾应用0.25胰蛋白酶(1 :250)消化1h后再用0.2胶原酶IA消化 12h,结果发现收获的细胞体外培养时不贴壁, 约一周左右全部溶解,死亡.之后,我们逐渐降 低酶的浓度并缩短酶消化时间.发现用0.25 胰蛋白酶(1:250)在37c下消化30min,再用 0.1胶原酶IA在37c下消化5h.分离的髁 状突软骨细胞体外培养时生长良好因此我们 认为.提高酶的浓度及延长消化时间虽有利于 游离软骨细胞,提高细胞收获量一但亦有可能对 其造成不可逆性损害使细胞死亡. 除软骨细胞,视网膜神经细胞外.其它组织 细胞无合成?胶原的能力口],本试验培养的细 胞来源于髁状突软骨,应用特异性的n1(?) cDNA胶原探针通过核酸原位杂交技术显示细 胞浆内布满阳性颗粒.说明该细胞内有合成? 型胶原的mRNA,具有合成?型胶原的能力, 从而确定其为软骨细胞. 本研究表明,通过机械分离,酶消化的方法 能够获得均一性的髁状突软骨细胞.可进一步 应用于研究各种外在因素对关节软骨细胞的影 响.以及应用于组织学领域,这将对于颞下 颌关节病变发病机制的研究和临床治疗具有重 要意义. (本文承我院于世风.王卫华李盛琳,岳岷老师的大力支 持.特此致谢) 参考文献 1FukuokaYHagiharaM,NagatsuT.dTherelation shlDbetweencoLLagenmetabo]ismadtemporomandibutar joint0teoarthriti~inmice.JOralMaxillofacSurg.1?3{ 51:18E 2TukanoTTakigawaM,Shi*aiE.alTheeffeccol parathyroidhormoneoncv?JlcAMP】…【.c)thinedecar boxytaseaivivtandglycosaminogtycansynthesis0fchon .u矗...N... drocytesfrommandibularcondylarcartilage-nasalsepta[ cartilage-andspheno—occipitalsynchondrosisincultrue.J DentRes,1987}66:84 3WeissA,livneE,DorMarkK,eta1.Growthandrepairof cartilage:organculturesystemutilizingchondroprngeniror cellsofcondylarcartilagein?miceJBoneMineralRes, 1983}3{993 4EngelFE,KhareAG.BoyamBD.Phenotypiechangeof rabbitmandibularcondylarcartilagecellsinculture.JDent (上接第433页) 3讨论 Res.1990;69:1753 5CapassoO,GiontiE,Pontare1]iG.et口.Thecultureof chickembryochondroeytesandthecontroloftheirdifferen— tiatedfunctioninvitro.1.Charanerlza【10nofthechorro eyte—specificphenorypesExpCellRes-l982;142:197 6顾天爵主编.生物化学.第3版.北京:^民卫生出版社, l989:20驺 (本文图见插页第34页) (1996—05—23收稿) 随着年龄的增长,脏腑虚衰的比率逐渐增 加,其中以肾虚最为明显.目前多数人认为肾虚 是衰老的重要原因之一.然而,肾气虚衰或机体 机能代谢降低必定引起代谢产物堆积,进而造 成细胞或组织损伤,从而形成瘀证.临床研究表 明老年人多有动脉硬化,末稍微循环障碍以及 组织器官硬化退变,甚至发生肿瘤.实验研究也 证明伴随增龄人或大鼠血液流变性呈现明显的 ,凝,聚变化,即衰老机体有自发性血瘀存 粘,浓 在.说明在衰老过程中"虚与"瘀"并存,两者相 互作用共同促进衰老的进程.本实验结果表明, 补肾化瘀法合用的八味丹坤方在改善老化机体 自由基代谢,增强抗氧化酶活性,减少自由基对 机体损伤等方面明显优于单纯补肾的八味地黄 汤或单纯化瘀的丹坤方,进一步反证老化机体 确实存在"肾虚挟瘀"的体质,补肾化瘀法较单 纯补肾或化瘀可能是延缓衰老更为有效的手 段.本实验结果为衰老的正虚挟瘀"观点提供 了更为有力的实验依据. 本实验中补肾八味地黄汤及化瘀丹坤方均 可增强老年小鼠SOD,CAT,GSH—Px的活性, 说明补肾及化瘀方药均能较全面的改善机体的 自由基代谢,但在增强SOD及GSHPx活性方 面.丹坤方优于八味地黄汤;而改善CAT活性 则以八味地黄汤更为有效,说明补肾与化瘀方 药在改善老化机体自由基代谢的环节上可能不 尽相同.因此,补肾与化瘀合用,在作用上相互 增强,互为补充,使之全面发挥清除自由基的作 用. 参考文献 1李顺成-蒋文跃-王传社,等正虚挟褒是衰老的主要机制- 中国医药-1992}7(6);4 2Asokawa.TMat…hjtaSThiobarbituricacidtestforde— t~tinglipidperoxidies.Lipids?1979#(4):401 3HaraPM,IrwinFSuperoxideD.Aphotochemicalaug— mentationassay.ArchBlochemBJophys.1977;181:308 4自秀起.戴工禾.夏兆奇,等.过矗酸盐作底物滴定{去测定红 细胞及心肌组织中过氧化氢酶活力.自求恩医科大学, 1989'15(1):34 5张嘉麟,方允中.血液中答胱甘肽过氧化物酶活力散量测 定中华医学检验学杂志-1985}8(4):199 6Furnaga[1iR.CaponiR.CorsiaiA-alNonprotein sulfhydrylsaspossiblecomponentsoftheprot~tiveeffect ofrosaprosto]onthegastricmucosa.Prostaglandins,1985# 29(3):467 (19960307收稿)