【doc】巨细胞病毒临床分离株感染血管内皮细胞伴肾素基因表达

【doc】巨细胞病毒临床分离株感染血管内皮细胞伴肾素基因表达 巨细胞病毒临床分离株感染血管内皮细胞 伴肾素基因表达 ? 164?公共卫生与临床医学 2009s3PublicHealthandClinicalMedicineVolume5,Number3,Aug2009 巨细胞病毒临床分离株感染血管内皮细胞伴肾素基 因表达 李多多一,远3,程计林1,4,程新5,刘宅玲6,二F海滨3,金壮3张杰林3,CrumpackerClyde. 摘要:目的探讨巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)是否感染血管内皮细胞伴肾素表达.方法? 用10pfu(空斑形成单位)/mLCMV临床分离株BI,5和实验室型CMVAD169分别与10腹主动脉内 度细胞和人脐静脉内皮细胞共同孵育,在23h后,d3,d7,dlO和d14分别收集培养上清200l,d14 用PBS缓冲液洗细胞3次,收获细胞.每组实验均设培养液代替病毒液的无感染对照;?COBAS定量 PCR培养上清中CMVDNA拷贝数;~PCR检测感染细胞中CMVpol基因;@RT-PCR,Realtime RT-PCR和Westernblot检测肾素在感染细胞内的表达.结果?BI一5和AD169感染静脉和动脉细胞后, 胞裂解病理效应;(~)AD169感染细胞不同时间培养上清其形态学变化相似,无细 中CMVDNA拷贝数 无明显增加,BI一5呈增殖趋势;?BI一5感染动脉细胞CMVDNA拷贝数和肾素表达量均大于静脉细胞. 结论临床分离株CMV以非裂解形式在血管内皮细胞持续存在并诱导肾素基因表达,血管内皮细胞分 泌肾素可能是CMV感染引起心血管疾病的新机制. 关键词:巨细胞病毒;血管内皮细胞;肾素 中图分类号:R543.5;R373.9文献标识码:A Reningeneexpressioninthevascularendothelialcellsinfectedbytheclinicalisolateof cytomegalovirusL1Duo.duo1,2. CHENGYuan3. CHENGJi—t|._. CHENGXin5. LIUBao.1ing6. wANGHai.bin4. JlNZhuang4ZHANGJie—t{n, CRUMPACKERClyde《1ShanghaiPublicHealth ClinicalCenteraffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai201508,China;2XinxiangMedicalCollegein HenanProvince,Xinxiang453003,"3PFirstHospitalaffiliatedtoXinxiangMedicalCollegeinHenan Province,WP"453100;4TheDivisionofInfectiousDisease.BethlaraelDeaconessMedicalCenter, HarvardMedicalSchool,HarvardUniversity.Boston02215UsA:5WorcestPolytechnicInstituteinUSA: 6.MassachusettsGeneralHospital,HarvardMedicalSchool,Hnn,ardUniversity,USA1 Abstract:0bjectiveToexplorewhethercytomegalovirus(CMV)isabletoinfectcardiovascularendothelial cellsandcausereningeneexpression.Methods(~Umbilicalveincelllineandabdominalaortacell1ine wererespectivelyinfectedwith出eclinica1isolateofCMVBI一 5andthelaboratorystrainofCMVAD169at multiplicitiesofjnfecfionfMoi)of10f10pfu/mlCMV/】 0.cells)orwithmockcontro1ofmediaalone.200pL 收稿臼期:2009.04.29:参回日期:2009—0519 基金项目:复旦人学医学院基础一临床交叉研究基金(JC08.7),复大学生物医学研究院(IBS)2009年度开放课题基金 (20o8B100)和』'海ff(复日J大学附属)公共卫生临床中心引进人才科研启动基金(RCJJ7)资助 作者单位:1}海市f复旦火学附属)公芡卫生临床中tl,,上海201508:2河南省新乡医学院第一附属医院小儿内,一科, 河南新乡453000;3河南省新乡医学院生理学与神经生物学教研室,河南新乡;4TheDivisionofInfectiousDisease, BethIsraelDeaconessMedicalCenter,HarvardMedicalSchool,HarvardUniversity,USA:5 WorcestPolytechnicInstituteinUSA; 6MassachusettsGeneralHospital,HarvardMedicalSchool,HarvardUniversity,USA 作者简介:李多多(1983一),女(汉族),河南省新乡『人,硕士研究生在读,住院医师.主要研究方向:小儿感染性疾 病的诊治. 通讯作者:程计林(1962一),另(汉族),河南省人;1993年河南医科大学获消化内科硕士学位,1996年北京科大学获 消化内科博J学位,1999年上海交通人学医学院进行消化内科博士后研究;2001年以访问学者赴英国皇家大学医学院 进,于慢性肝瘸和免疫细胞集的机研究,2002年于美国明尼苏大学药学院进行分子生物学技术构建基因文库等研究,2004 年r美国哈佛大学进行巨细胞病毒诱导血管内皮细胞损伤与动脉粥样硬化的基基础等研究;2007年受聘j'复_日大学附属 公共卫生临床中心,任消化内科副主任医师,科j任;是《胃肠病学》,《肝脏》,《中华微生物》,《免疫学杂志》特邀审稿 人,《公共JJ与临床医学》编委;先后承担国家863,国家自然科学基金,国家博士后基金,』一海f教育基金等课题;发 表论文5O余篇,副主编与参编着3本;获科技成果奖等多项.主要研究方向:消化内科疾病的诊治与基础. 术论着术 公共卫生与临床医学20095卷3驯 PublicHealthandClinicalMedicineVolume5,Number3.Aug2009?165? supematantfromeachculturewascollectedatthe23rdhour,day3,7,10,and14post— infection.Atthe14th dayofpost-infection,thecellswererinsedwithPBSthreetimesandthenharvested.? CMVDNAcopiesin thesupernatantwerequantifiedbyCOBASPCR.@CMVDNApolymerase(po1)geneintheinfectedcells wasdeterminedbyPCR.@ThereninexpressionintheviralinfectedcellswasmeasuredwithRT-PCR.real timequantityRT-PCTandwesternblot.Results? LyticreplicationofCMVwasnotobservedinboth CMV-infectedvenousandarterialcellsduringthe14dayculture.~TheclinicalisolatesBI一 5persistently replicatedinbothvenousandarterialendothelialcellsbutnottheAD169,determinedbyviralpolgenecopies. @CMVDNAandreninexpressioninCMV-infectedarterialcellswerehigherthanthoseinvenouscells. ConclusionsCMVwasnon?lyticandcontinuouslyreleasedfromtheinfectedvascularcellsandinducedrenin expressioninCMV-infectedcells.ThelocalreninfromCMV-infectedcellsmayplayallimpo~antrolein pathogenesisofatherosclerosis. Keywords:Cytomegalovirus:vascularendothelialCells;Renin 巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)作为一 种常以无症状的临床隐性感染或潜伏感染的病毒在 自然界中分布广泛,一旦发生感染常终身携带病毒. 发展中国家的人口感染率高于发达国家,在我国的 成人感染率高达95%以上.艾滋病患者免疫状态低 下极易合并CMV感染,这种人类免疫缺陷病毒 (HumanImmunodeficiencyVirus,HIV)感染者中有 很高的心肌梗塞发生率,合并心血管疾病是导致艾 滋病死亡的第三重要病因….目前,半数的动脉粥 样硬化病人尚未发现可以解释的致病因素或原因, 临床和基础研究发现CMV感染与心血管疾病有关 [2-41 ,进行心脏移植的患者感染CMV后更是会加速 术后动脉粥样硬化的发生f4J.动脉粥样硬化是一种 炎症疾病的观点正在受到广泛的关注,然而,CMV 诱导动脉粥样硬化的分子病理机制仍不清楚..肾素 是肾素.血管紧张素系统序列启动的第一步,它直接 作用于肝脏所分泌的血管紧张素原,使血管紧张素 原转变成血管紧张素I,最终导致血管紧张素II产 生.许多研究发现高血压和动脉粥样硬化病人.肾素一 血管紧张素系统的不同成分明显上调.已有研究证 实CMV感染与心血管疾病有关,而先前相关研究 结果也显示CMV可对血管内皮细胞脂质体的形成 产生影响J,这些结果表明CMV感染在血管粥样 硬化斑的形成过程中起重要作用.本研究用CMV 感染血管内皮细胞,试图发现CMV感染血管内皮 细胞后细胞内肾素基因表达的变化,以推测CMV 感染诱导主动脉细胞.肾素一血管紧张素系统成分活 化与心血管疾病发生的关系. 1材料和方法 1.1材料 1.1,1CMV临床分离株和实验室株扩增和滴度定 量CMV临床分离株BI一5由美国芝加哥Rush— Presbyterian—St.Luke'SMedicalCenter的NellLurain 博士惠赠,BI一5DNA序列含ToledoORFs (UL133,151).BI一5和CMV实验室株AD169(美 国ATCC,AmericanTypeCultureCollection)均用 人包皮纤维母细胞(humanforeskinfibroblast,HFF) 进行传代培养,获取第一代培养上清作为感染血管 内皮细胞的病毒液.用空斑分析法检测病毒滴 度(空斑形成单位pfu/ml表示)l6',储存于一80~C 中备用. 1.1.2CMV感染血管内皮细胞人脐静脉内皮细 胞系(CRL一1730)和人腹主动脉内皮细胞系 (CRL.2472)均购买于美国ATCC.培养液选用 Ham'SF12K内加2mM左旋谷酰胺,1.5g/L碳酸氢 钠,0.1mg/mL肝素和0.03,0.05mg/mL内皮细胞生 长增强物(endothelialcellgrowthsupplement, ECGS)和10%胎牛血清.CRL一1730和CRL.2472 属于贴壁细胞,当细胞呈对数生长覆盖率达90% 时,移出培养液,按照病毒MOI(感染量)=10(10 pfu/mL病毒/10.细胞)分别加入BI.5,AD169和培 养液(无病毒感染对照即mock感染)在细胞培养 箱中孵育2h,然后,移出病毒液,加入新鲜培养液 继续培养.每天在倒置显微镜下观察细胞形态,并 用数码相机记录其变化.分别在感染后23h,3d, 7d,10d和14d时,收集培养上清200~L,再加入 等量的新鲜培养液.d14,留取上清后,先用PBS 缓冲液小心洗细胞,收获细胞,将细胞小粒储存于 一 80?备用. J.2方法 1.2.1COBASPCR检测培养上清CMVDNA按 照COBASamplicorCMVmonitorTMtest试剂盒使用 说明,从200gL来自每一标本培养上清中提取DNA, ?166?公共卫生与临床医学2009第5卷第3n』 jPublicHealthandClinicalMedicineVolume5,Number3,Aug2009 并配制PCR反应体系,放置于COBASPCR机器 (COBASAMPLICOR??Analyzer)中进行CMV DNA拷贝计数,这个PCR扩增试剂盒购买于美国 RocheDiagnosticSystems,Inc.(Branchburg,NJ). 1-2.2从感染细胞中提取RNA按照RNA提取试 剂盒(RNeasyMiniKit,QIAGEN公司)和DNA 酶(DNaseRNaseffee,QIAGEN公司)使用说明, 分别从CMV感染和未感染细胞中提取总RNA. 1.2.3RT-PCR检测细胞中CMVDNA多聚酶(po1) 基因800ngRNA通过随机hexamer引物(美国 App】iedBiosystems公司)反转录成cDNA,用与 COBASPCR试剂盒相同的CMVDNApol基因引 物,以cDNA为,PCR(Thermocycler9600): 变性94?30s,退火55?30s,延伸72?1min, 35循环,最后72?延伸10rain.1.2%琼脂糖胶电 泳显示365bp的PCR产物带. 】.2.4检测CMV感染细胞肾素mRNA每次每组 取与检测细胞内CMVDNA多聚酶(po1)基因相同 体积的Cdna:@PCR分析:上游引物5'CAATCCG AGAAAGCCTGAAG3,下游引物5'GATGTCCTG GCTGAGAAAGC3',PCR产物365bp,管家 (houskeeping)綦因B—actin作PCR反应系统阳性 内参照,通过Bio—Rad密度定量分析软件计算PCR 电泳条带密度,比较各组问的差异.?用相对定量 PCR(relativequantificationrealtimePCR)方法分 析肾素mRNA在CMV感染细胞中的表达(定量 PCR仪:AppliedBiosystemsPRISM7300Sequence Detector).用于检测肾素的相对定量PCR引物和探 针(产品号:Hs00166915mL),TaqMan基因表达分 BI一5 静脉内皮细胞 析和万能混合剂均购买于美国AmpliedBiosystems 公司,按照其说明配制实时荧光定量PCR反应体 系,每份标本均用GAPDH作内源性对照,用Raw RQ(Rawrelativequantification)值比较各组问肾素 基因表达的差异. 1.2.5WesternBlot检测肾素蛋白在感染细胞的表 达在收获的细胞小粒离心管中加含蛋白酶抑制剂 的裂解液(美国CellSignalingTechnology,Inc.)150 ,冰浴5rain,在4?12000rpm离心10min,收 集上清,用BioRad蛋白分析试剂在595nm波长测 定蛋白浓度.每组标本取20蛋白用于12%SDS— PAGE电泳,并被转移到硝化纤维素膜(美国 BioRadLaboratories公司),在宅温下膜与5%脱脂 干燥奶粉PBS—Tween20缓冲液孵育lh以封闭非特 异性蛋白结合位点.然后,在4V与鼠抗人肾素单 克隆抗体(1:500,美国AbDSerotec公司)共育 过夜.洗膜,加酶标第二抗体,洗涤,化学发光显 影.Houskeeping基因GAPDH作阳性对照,并通过 蛋白条带密度,比较各组间蛋白表达的差异. 1.2.6统计学处理每组实验均重复3次,墩其平 均值进行SPSS13.0统计学软件处理,组间样本均数 的两两比较采用t检验. 2结果 2.1CMV感染血管内皮细胞的形态学变化CMV 感染后的14d期问,未发现典型的细胞裂解病理效 应,也未观察到病毒感染细胞空斑区形成.静脉 细胞和动脉细胞感染后的细胞形态变化相似(见 图1). 动脉内皮细胞 一一_一 一一_一感染后ld感染后14d感染后ld感染后14d 图1CMV感染静脉和动脉细胞后细胞形态的变化 公共卫生与临床医学2009年第5卷第3期 PublicHealthandClinicalMedicineVolume5,Number3,Aug2009?167? 2.2BI一5感染细胞培养液中CMVDNA拷贝量增 加图2为COBASPCR检测结果,图表左为CMV 感染脐静脉内皮细胞实验,右为CMV感染腹主动 脉内皮细胞实验.BI一5感染静脉和动脉内皮细胞后 5OOE+05 4OOE+05 三3OOE+05 手2OOE+05 舌1OOE+05 静脉内皮细胞 14d期间,培养上清CMVDNA拷贝量均增加,提 示病毒增值趋势,见图2中的蓝色曲线;而实验室 株AD169感染细胞培养上清CMVDNA拷贝量无 增高变化,见图2中的粉红色曲线. 00E+05 00E+05 00E+05 00E+05 00E+05 动脉内皮细胞 图2CMV感染血管内皮细胞期间培养上清CMVDNA拷贝的变化曲线 Figure2ThekineticsofCMVDNAinthesupernatantofCMV-infectedendothelialcells 2.3BI一5感染细胞可检测到CMVDNApol基因 PCR产物电泳结果显示在BI一5感染的脐静脉内皮 细胞和腹主动脉内皮细胞内有CMVDNApol基因 的表达,动脉细胞的PCR产物带密度强于静脉细 胞.AD169感染的脐静脉内皮细胞和腹主动脉内皮 细胞内仅显现很弱的CMVDNApol基因PCR产物 带.末用病毒感染的对照细胞(即mock感染细胞) 未观察到CMVDNAPCR产物.用housekeeping基 因B—actin作参照进行PCR电泳条带密度比较, CMV临床分离株在感染血管内皮细胞内的表达强 RT_PCR RT_PCR RT_PCR 于实验室株(P<0.05),而且,CMV临床分离株感 染动脉细胞和静脉细胞问pol基冈的检出强度也存 在明显性差别(P<0.05),见图3和表1. 2.4肾素mRNA在CMVDNApol基因阳性细胞表 达RT-PCR发现,肾素mRNA在与CMV临床分 离株BI一5孵育过的脐静脉内皮细胞和腹主动脉内 皮细胞内有较强的表达,远远大于与实验室株孵育 的细胞(P<0.05,见图3和表1).BI一5感染的动脉 细胞肾素的PCR产物强度又远大于它感染的静脉 细胞(P<0.05,见图3和表1).AD169和mock感 静脉细胞动脉细胞 CMVpol基因 肾素基因 肾素蛋白 图3CMVpol基因和肾素基因在感染细胞的表达 Figure3TheexpressionofCMVpolandReningenesinCMVinfectedendothelialcells. Note:Fromlefttoright,Lane1,2,3arederivedfromBI一 5,AD169andmockvirusinfectedumbilicalveincells lane4,5,6arederivedfromBI一 5,AD169andmockvirusinfectedabdominalaortacellsrespectively ? 168?公共卫生与临床医学2(}09f卜5讯3圳 PublicHealthandClinicalMedicineVolume5,Number3,Aug2009 VenousCells 1O0 80 60 40 200_ .?鬻:?0? BI.5AD169mOckBI.5AD169moek 图4RealTimeRT-PCR检测细胞肾素结果 Figure4QuantificationofReninmRNAbyreal—timeRT-PCR 表lPCR产物电泳带密度比 Table】TheratioofelectrophoresisbandintensityofPCRproducts Note:Studentttestwereemployed.P<0.05forcomparisonbetweenVS 料,VS,VS,VS,VS槲, VS ?凸 , VS;P>0.05forcomparison between槲VS^^. VSAA . vs料 表!,,cMoFI1Bk)【条带密度比 Table2TheratioofWesternblottingbandintensityofPCRproducts Note:Student,testwereemploy,red,P<O.05forcomparisonbetweenVS}{,VS,VS;P> ;O.05betweenVS 染细胞也可观察到肾素的弱表达,但他们问没有显 着意义的差别(P>O.05). 相对定量PCR,每一组值都与mock感染组比, 显示肾素mRNA在BI一5感染脐静脉内皮细胞中的 表达是AD169和mock感染细胞的32.6和33_3倍, 在BI一5感染腹主动脉内皮细胞中的表达是AD169 和mock感染细胞的90.9和9l倍(见图4). 2.5肾素蛋白在CMVDNApol基因阳性细胞表达 用CMVDNApol基冈阳性细胞获取的蛋白进行 WesternBlot检测,Bio—Rad定量分析软件计算肾素 密度与housekeeping基因GAPDH密度比,显示: 肾素在BI一5感染静脉和动脉内皮细胞中均有比 AD169和mock感染强的表达(P<0.05),而且, BI一5感染静脉和动脉细胞肾素表达也存在明显的差 异(P<0.05,见图3和表2). 3讨论 病毒DNA聚合酶(Polymerase,Po1)基因由 ORFUL45编码,在病毒DNA复制中起重要作用. 本研究发现与临床分离株低传代CMV共育的静脉 和动脉内皮细胞在14d的培养过程中,培养液中CMVDNA拷贝数逐日增加,细胞中检测出较实验 室株AD169感染对照组强的CMVDNApol基因 PCR产物,提示该临床分离株低传代CMV株可以 非裂解形式持续存在于血管内皮细胞并缓慢复制. 这与CHA等几位学者的研究结果相吻合,在小鼠 动物模型实验中,Toledo株比实验室株AD169株复 制水平至少高3倍,低传代Toledo株和临床分离株 UL,b区域有19个ORFs(UL133—151),而实验室 AD169株中不存在.由此推测可能是由于实验室株 AD169株在反复传代过程中出现了UL/b区遗传 信息的丢失和重排,并导致其毒力和致病性的明显 减弱,因而这19个ORF很可能在HCMV感染血 管内皮细胞的致病性方面起重要作用.病毒粘附和 进入内皮细胞是启动血管内皮细胞病变的关键, Ryckman等的研究证实这一过程与CMVUL128一 UL150区基因关系密切』. CMV的血管内皮细胞嗜性是目前研究的热点, 存在两种观点,一是它依赖于病毒问的一个或大于 一 个的基因差异【J…,一是认为它与血管组织的起源 有关I】11.CMV临床分离株在动脉细胞和静脉细胞 内的活性差异是否也与组织来源有关?值得进一步 ????如一. 0? +一 0;正 +一 3 3 3 公共卫生与临床医学2009卜5奄3驯 PublicHealthandClinicalMedicineVolume5,Number3.Aug2009?169? 研究.对于免疫功能紊乱的患者,内皮细胞是CMV 急性感染的主要靶向细胞,如果病毒诱导细胞病理 效应,受感染的内皮细胞将会启动直接的血管损伤 ?… .血管内皮损伤是发生动脉粥样硬化的重要一 步.CMV的内皮细胞嗜性和其诱导的内皮细胞损 伤是一个复杂的病理过程,受多种因素影响,如 CMVUL131读码框架,US28位点,极早G蛋白介 导的信号转换,CMV诱导的内皮ICAM一1,胞浆 P53DNA损伤信号通路,氮氧化物合成酶通路破 坏,碱磷酶异构体及核糖核酸降解酶同源物Il引.本 研究发现,CMV感染血管内皮细胞内的肾素表达 与细胞内病毒DNA的检测强度成正比,提示肾素一 血管紧张素系统(RAS)也涉及CMV内皮细胞损 伤机制. 肾素是启动RAS各成分序列活化,最终导致效 应分子血管紧张素II产生的关键.血管紧张素II 能够启动转录因子NF.vd3,从而启动炎症细胞因子 的产生,促进NADPH氧化酶的活性,继之超氧离 子释放,一氧化氮(NO)减少,内皮细胞依赖性血 管舒张被破坏.血管紧张素II还可刺激血管壁局部 分泌尿酸增至5倍左右,血管壁产生的尿酸参与动 脉粥样硬化的病理过程.新近美国Hypertension杂 志刊登Weiss等的研究,他们发现动脉粥样硬化病 变局部的肾素一血管紧张素系统(RAS)被异常激活, 与动脉粥样硬化斑形成的病理过程关系极其密切, 而这个病理效应不依赖于血压的变化?引.动脉粥样 硬化病变区存在肾素异常活性的多种成分?引,这些 与我们发现CMV感染血管内皮细胞分泌肾素的研 究结果相吻合,提示CMV可以通过RAS通路诱发 和加速心血管疾病的病理过程.因此,更好地理解 CMV感染和RAS相互作用的分子基础,可望发现 心血管疾病发生发展的新机理和防治的新方法. 参考文献: 【1]CoilB,ParraS,Alonso?VillaverdeC,eta1.Theroleofimmunityand inflammationintheprogressionofatherosclerosisinpatientswith HIvinfection[J[.Stroke.2007,38f9):2477—2484. 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