印记基因与胚胎发育

印记基因与胚胎发育 印记基因与胚胎发育 《上海畜牧兽医通讯》2007年第4期?45? 印记基因与胚胎发育 张敏(辽宁医学院畜牧兽医学院辽宁锦州121001) 来自双亲的同源染色体或等位基因在功能上存在差异. 当同一种染色体或基因的改变,由不同性别的亲本传给子代 时可引起不同的表型,这种同源染色体上基因表达活性不同 的遗传现象称之为基因组印记.基因组印记又称遗传印记, 它是指来自双亲的基因或染色体存在功能上的差异,因而后 代对来自父亲和来自母亲的基因表达不同.当某个印记基 因来自母本时,是缄默的,来自父本时是激活的,就称这个基 因为母系印记基因;而当它来自父本时缄默,来自母本时是 激活的,则为父系印记基因.这是由于基因在生殖细胞分化 过程中受到不同的修饰,一些基因在精子生成过程中被印 记,另一些基因在卵子生成过程中被印记,被印记了的基因, 它们的表达受到抑制.在哺乳动物中的一些印记基因与胚 胎发育有关,这些基因对于胎儿的大小及存活率有着重大的 影响,印记功能的紊乱将导致多种发育异常.如LGF2基 因,MEAT/Pegl基因,Peg3基因,当它们表达异常时会使胚 胎着床失败并死亡,即使幸存的胚胎体积也只有正常的 40%.一般认为,父源性印记基因促进胚盘生长,母源性印 记基因促进胚胎生长.有人认为胚胎移植技术中出现的一 些问题也是由基因印记所致.因此,弄清印记基因的机制对 于提高胚胎移植技术的成功率有重大意义…. 印记基因对于胎儿发育,个体生长与行为,特别是胎盘 的发育都极为重要.印记基因表达异常会导致多种疾病发 生.同时人们也发现,在当前动物克隆的研究中制约克隆效 率提高的关键因素之一可能正是克隆动物的印记基因表达 异常.因而,深入透彻地研究印记基因对治疗相关的遗传疾 病,提高动物克隆效率具有非常现实和深远的意义. 1与胚胎发育有关的主要印记基因的简介 1.1IGF2(胰岛素样生长因子一2) IGF2胰岛素样生长因子一2(insulin—likegrowthfactor 一 2)基因,定位于小鼠7号染色体远端,在人位于1lp15.5. IGF2是胰岛素,胰岛素样生长因子,释放生长因子家族的成 员,由Dechiara等通过基因剔除技术从小鼠中发现的第一个 内源性印迹基因(IGF2基因)所表达产生的生长因子【2]. IGF2为单链多态,分子量7.5ku,有A,B,C,D4个区域, IGF2基因在猪中被定位于染色体2Pter上影响猪肌肉量的 数量性状基因座(quantitytraitslocus,QTL)上,研究表明,人 体IGF2基因由9个外显子,8个内含子组成,其转录由4个 组织和分化特异性的启动子(p1一p4)调控【31. IGF2是最早发现的内源性印迹基因,正常情况下在成 人柔脑膜,脉络丛,肝细胞及胚胎中枢神经系统为双等位基 因表达,其它皆为母源印迹父源表达.其转录由4个组织和 分化特异性的启动子(P1,P4)调节,转录产物分别在胚胎期 和成年期特异性表达,其编码的胰岛素样生长因子一2为胚 胎性生长因子,在胚胎发育和细胞生长等诸多生理过程中具 有重要促分裂作用,是一种促有丝分裂肽,对胚胎的正常生 长发育有重要作用,其印迹异常参与了许多遗传病及肿瘤的 发生,并能刺激肿瘤细胞的增殖l4j. 1.2H19 H19基因定位于小鼠7号染色体远端和IGF2基因相距 仅70kb,在人位于11P15.5,为单拷贝基因,全长3kb,共含 有5个外显子,4个内含子.H19mRNA有35个小的开放阅 读框(openreadingframe,ORF),最大的开放阅读框是ORF6 起始于第一个外显子,终于第二个外显子,理论上可以潜在 编码一个含256个氨基酸的蛋白质分子,但在体内以及各种 细胞系中都不到任何与这些开放阅读框相对应的蛋白 质产物,而且尚未发现H19与翻译系统有联系,因此目前大 多学者认为H19不能产生蛋白质,其最终表达产物是RNA, 并在RNA水平发挥作用,有人称之为核糖凋节因子或胞浆 核糖核蛋白的组分之一.但对异位H19的ORF6上游非翻 译区进行删失和点突变研究发现其产生一26kD的蛋白 质5],而在内源性H19细胞中尚未发现此蛋白.正常情况下 H19基因父源印迹母源表达.H19是目前发现的唯一不表 达蛋白质的印迹基因,而是在mRNA水平发挥作用,其在人 和小鼠胚胎期广泛表达,参与胚胎的正常生长,发育及小儿 的行为发展,长期以来认为其RNA具有抑瘤活性【6】. H19是一种生长凋节基因,它在胚胎组织中高度表达, 出生后,在大多数组织中都受到了明显表达抑制,在成人 H19在乳腺,心肌和骨骼肌中有一定水平表达,在肾,肾上腺 和肺中保持较低水平.H19和IGF2在脑组织中的表达方式 明显有区域性.Pham等【7对胚胎及成人脑组织研究发现, 在7,8周的胚胎脑组织中,IGF2,H19均为双等位基因表 达,而在其他胚胎组织中两者均保持了印记;在成人脑组织 中.IGF2在脑桥,延髓中缝核,丘脑下部仍为双等位基因表 达,而H19的表达量较胚胎明显下降,仅在脑桥,延髓中缝核 有表达,但保持印记.因此,H19在脑组织中的印记表达应 建立于8周后.而研究表明,在人胎盘中,H19印记建立于 第10周,这表明H19印记在部分组织中存在迟发现象.由 于H19基因主要在胚胎组织中表达,在成人乳腺,心肌和骨 骼肌中有一定水平表达,这种现象提示H19在细胞的增殖和 分化方面具有双重作用. 1.3IGF2和H19发生印迹的机制 因为无论人还是鼠,IGF2和H19基因都是位于同一印 迹区域且紧密相连的,故弄清楚这两个基因的印迹机制,已 成为研究的热点.长期以来,这两个基因被证明是交互印迹 的.1992年,以Sasaki为代表的研究小组提出了IGF2和 H19基因竞争同一增强子学说,即IGF2和H19共同竞争 H19下游的增强子【8]. 在父源染色体上,H19启动子甲基化,H19下游的增强 子将激活IGF2启动子,IGF2得以表达.在母源染色体上, 未甲基化的HI9启动子能竞争过IGF2启动子,H19得以表 达.由增强子学说可知,由于甲基化的存在使父源H19及母 源IGF2保持沉默.而母源IGF2启动子并未甲基化,它是如 何保持沉默的呢?近来通过对位于H19上游2kb差异甲基 化区域(DMR)的研究,这一问题得以明朗化.这个区域有绝 缘子功能,绝缘子的活动是由甲基化控制的,而DNA甲基化 是通过控制凋节锌指蛋白CTCF的结合起作用的【9). 所谓差异甲基化区域(differentiallymethylatedregion, DMR)即卵子和精子中对同一基因不同程度的甲基化,也有 文献把此区域称为印迹控制区(imprintingcontrolregion, ICR).对于IGF2和H19基因而言,若H19上游DMR是母 本来源则是未甲基化状态,若是父本来源则是甲基化状态. 甲基化的DMR在父本染色体上作为失活中心,从而使H19 ? 46?《上海畜牧兽医通讯》2007牟第4期 基因甲基化或发生沉默,母本染色体上未甲基化的DMR内 一 些序列和核因子结合,形成绝缘子(insulator)阻止IGF2基 因和其下游增强子之间的作用,IGF2基因发生沉默这不 同于以前提出的竞争同一增强子学说.Be及Hark等研究发 现在H19基因上游的印迹控制区也即差异甲基化区域.有一 序列能阻止增强子的活性,而这一序列活性是由甲基化控制 的并依赖锌指蛋白CTCF的存在【l.?"j.CTCF是从脊椎动 物进化而来的一大类核内蛋白,可作为转录因子广泛参与基 因的表达调控,可激活也可抑制转录.对于IGF2和H19基 因而言,母本染色体上未甲基化的DMR内绝缘子序列可与 cT(1F结合形成绝缘子CTCF复合体阻止IGF2基因和其下 游增强子作用,结果只有HI9基因表达,父本染色体上甲基 化的DMR内此序列CpG岛甲基化无法和CTCF结合,所以 H19下游增强子能够激活IG启动子IGF'2基因得以表达, 同时HI9启动子和侧翼序列由于甲基化而保持沉默.体外 研究揭示CTCF蛋白结合了母源H19DMR区域全部4个 CpG岛甲基化位点,当靶序列包含甲基化CpG位点时,则这 种结合消失,无法形成绝缘子【l.Kanduri应用凝胶电泳 (geshift)和染色质免疫纯化也发现CTCF这一高效价因 子结合到印迹控制区而致印迹绝缘作用是甲基化敏感性和 亲本起源依赖性的引.总之,HI9下游的增强子对于HI9 和IGF2的转录是必需的,研究证实这些增强子的作用具有 组织特异性.Ainscough利用长为130kb酵母人工染色体转 基因(YAC)证实在H19上游90kb到其下游35kb区域有功 能不同的增强子指导IGF2和HI9在骨骼,肌肉中的表 达【I3j.2000年.他把130kb长的YAc插入异位的单拷贝 位点让IGF2和H19进行异位转录,发现不同的细胞类型有 不同的增强子存在,因此认为IGF2和H19的调节是复杂 的,至少需要3种不同种类组织细胞起源的增强子作用, IGF2和H19交互印迹的机制是在小鼠的发育过程中,在不 同组织细胞利用不同的调节序列对其进行调节ll.到目 前,已有足够数据表明IGF2和HI9交互印迹发生在转录水 平,这些数据都是通过对细胞群体进行研究观察其RNA水 平,这反映了基因的最终表达活性.近年来的研究结果表 明,来源于父,母本的基因在配子发生过程中发生了不同的 印记,从而使两者在胚胎发育过程中具有不同的功能.DNA 的外因遗传修饰(Epigeneticmodification)在控制哺乳类胚胎 的正常发育中扮演极为重要的角色,DNA的甲基化作为外 因遗传修饰的一种形式【l-1引. 2IGF2(印记)基因在胚胎发育过程中的调控 对于基因印记,配子发生过程是印记形成的关键时期, 而印记主要表现在基因调控区CpG岛甲基化状态的改变 近年来的研究结果表明,印记基因在配子中不同时复制,这 种现象一直贯穿到整个发育期(Simon等,1999).印记基 因的甲基化随着发育进程而变化.在8细胞至囊胚期,DNA 甲基化程度显着下降;在胚胎植入时出现DNA的新生甲基 化.但是生殖细胞不出现上述的新生甲基化过程.在对哺 乳动物单性生殖的研究中发现:小鼠的孤雌胚可以正常地完 成附植前的发育,并且可以诱导附植,但不能分化形成正常 的胚外组织.具有双亲本性和杂合子性的小鼠雌核胚,雄核 胚也同样不能完成正常的胚胎发育过程. 在哺乳动物生命周期中,在性原细胞(精原细胞和卵原 细胞)阶段,DNA分子的甲基化被清除.在配子(精子和卵 子)阶段,DNA甲基化重新开始建立.因此,配子发生阶段 是印记(imprinting)形成的关键时期,此时期受外界因素干扰 将可能影响胚胎发育,导致疾病发生.对于非印记基因来 说,随后出现去甲基化,在受精后的几小时,双亲的染色体尚 处于分离状态.父方基因组DNA的去甲基化过程主要是主 动的[18,而这个阶段的印记基因的甲基化却继续维持,由 于染色体在复制过程中维持甲基化失败,母方去甲基化过程 主要是被动的,重新甲基化是开始于囊胚的内细胞团(inner. eellmass.ICM).印记基因在受精时及之后,甲基化的等 位基因将维持甲基化状态,非甲基化的等位基因也将维持非 甲基化状态,遗传印记在囊胚期正式建立].胚胎期后遗 传印记在身体的各组织器官充分表达,但是性原细胞中印记 标记再被清除.这种以基因组DNA分子甲基化为形式的遗 传印记标记是在动物的整个生命周期中可被清除(erasure) 和再建立(reestablishment). 多数父源表达的基因能够促进胎儿的生长,而每个雌性 个体则试图限制和平衡它所有后代的生长,因而表达抑制后 代过度生长的基因,有袋动物和哺乳动物的基因组中存在印 记基因,它们的胎儿要在母体子宫内停留一段时间,通过抑 制父源组织相容性基因表达,来逃避母体免疫系统的检测, 因此也有假说认为,印记就是作为针对母胎耐受或胎盘发育 的一种应对措施出现的【2引. 基因印记的建立或保持,通常发生在配子形成和胚胎发 育的早期.在实验室对动物胚胎进行克隆操作或体外非生 理条件的培养时,可能导致印记基因不恰当的外因遗传修饰 发生,从而妨碍再程序化的正常进行,使某些基因丢失一 些[24,257.丢失几个甲基对基因来说只是微小的变化,但这 足以改变基因控制产生相应蛋白的能力,从而影响到动物的 健康状况和生存能力.胰岛素样生长因子(insulin2like growthfactor2,Igf2)及其受体基因(I#2R)是被确定的第一 个印记基因,如果I#2R基因丢失所有的甲基,会导致其蛋 白质分泌量比正常值低30%,60%.这种蛋白质能够控制 胎儿的生长,缺少这种蛋白质,克隆动物就会患上体形过大 症(1argeoffspringsyndrome),从而影响克隆成功率. IGF2基因表达所产生的IGF2,是由前体物质通过蛋白 质水解,加工而成的单链蛋白质,由67个氨基酸组成,是胚 胎性生长因子.小鼠胚胎对父源性表达的生长因子一IGF2 的水平极为敏感,IGF2编码基因功能的丧失,将导致出生时 子代小鼠体重减少40%.母源性表达的IGF2基因,编码一 种双功能蛋白质,是生长因子的储备库,缺乏受体的胎儿比 正常生长胎儿几乎大30%.检测猪胚胎血浆中IGF2的浓 度,发现IGF2浓度水平显着的高.Lamberson等试验指出, 在猪胎儿9,12周龄间,IGF2浓度随年龄增长而下降,性别 对其无影响.对9周龄和21周龄猪进行测定,发现IGF2浓 度与生长期所测定的体重呈正相关,提高血浆中IGF2的浓 .另外有研究报道,绵羊血浆中IGF2 度,可提高猪背膘厚l1引 浓度与背膘厚也呈正相关.关于印迹基因调节胚胎生长的 机制,分析认为:印迹基因通过调节胚胎的营养需求,来维持 胎儿需求与母体供应问的平衡,如果胚胎中双亲源性的印迹 基因的作用相互抵触,则母源性印迹基因可以防御滋养层疾 病,并在植入过程中耐受父源性抗原. 克隆动物经常表现为胎盘过大,当使用体细胞或胚胎干 细胞进行克隆时,其胎盘重量是正常的2,3倍【.印记基 因的表达受到在配子发生后期建立的一些特异甲基化位点 的影响z9】.印记基因区域在配子中标记并在细胞分裂中 的保持,使子代细胞中基因表达模式稳定遗传,哺乳动物基 因组印记形成过程包括配子形成中原来已经有的印记的去 除,配子印记的建立及体细胞中基因组印记维持.印记基因 与胎儿及胎盘的生长有关,其在生殖细胞中建立并维持到胚 《上海畜牧兽医通讯》2007年第4期?47? 胎,对核重排可能发生抵抗,不能正常表达,它们可能是造成 某些克隆动物表型异常的原因.动物克隆中的基因组印记 异常导致克隆动物的成活率低,而且存在大量表型异常及不 同程度缺陷,主要表现为克隆动物胚胎和胎盘的过度增长, 而这正与许多印记基因表达失调导致的症状相似.体细胞 在发育过程中逐渐积累的各种异常,核移植操作和体外培养 中对卵母细胞及供体核造成的损伤也都会被带到克隆胚中, 致使印记基因表达异常.例如:卵母细胞和供体细胞的体外 操作与培养都会对印记基因的表达造成一定影响,例如在培 养液中加入血清后会干扰甲基化和Igf2R的表达,因此基因 组印记的异常,可能导致克隆效率低下,克隆胎儿与胎盘发 育不健全. 2004年,KonoKT.等人在《Nature}上发表了他们的研 究论文,采用核移植技术,得到了含有未生长的卵母细胞核 与完全生长的卵母细胞核的孤雌胚,其中未生长的卵母细胞 基因组中的印记基因H19被敲除,胚胎移植后,得到了能够 生长到成年并具有繁殖能力的孤雌小鼠?,未生长的卵母 细胞中尚未建立新的甲基化修饰,因此多数本来母源印记的 基因可以表达;敲除H19基因后,又使与其关系密切的另一 印记基因Ig42得以表达,所有这些本来在母源基因组中被抑 制的基因进行表达,一定程度上起到了代替父源表达的印记 基因的功能,补偿了父源基因组的作用.这个构思巧妙的实 验打破了单亲哺乳动物后代不能发育的定论,同时证明了基 因组保持正常的印记状态对哺乳动物发育的重要性.因此, 可以说,印记基因的表达是否正常与动物个体发育状态是直 接相关.由此,我们也可以想到,在体细胞克隆的动物中,它 们的印记基因表达一定也与克隆动物的发育紧密相关.当 然我们也看到,许多克隆胚胎还有新生动物表现出印记基因 表达的异常,但并不是都有表型的异常.这可能表明克隆动 物出现的明显缺陷是许多印记基因表达失调的累积效应,而 不是单个印记基因出现异常的结果.此外,也说明克隆动物 的发育能够耐受一定的印记基因表达异常. 在正常胚胎,印记基因的特异性甲基化位点在胚胎植入 前一直维持甲基化状态,这对植入后的胚胎发育是十分重要 的.如果从原始生殖细胞中将印记基因除去,将会导致精子 生成中有丝分裂和卵子生成中减数分裂的阻断.印记基因 的表达异常或者是由此引起的基因组的不能正常分裂,最终 将导致胚胎的植入后死亡.印记作用的组织特异性清楚地 表明了印记的复杂性.因此,虽然甲基化等修饰机制是在发 育过程中逐渐形成的,但决定一个特定基因是否被印记,发 生却是在合子期之前(配子形成过程中或原核期),在配子形 成过程中或原核期,源于双亲的等位基因可以被打上不同印 记,这种印记决定了基因在随后的发育过程中是否以及何时 何地发生甲基化等. 3结束语 基因组印记对于哺乳动物卵黄囊,胚胎滋养层胚胎的正 常发育都具有十分重要的作用,对个体的生长与行为也有一 定影响,特别是对胎盘发育极为重要.哺乳动物的印记是由 于它们是胎生的,还由于它们的子代直接从母体组织吸取营 养,对于父系基因,促进胎儿的生长以增加存活的机会,有选 择上的好处.而母系基因可能更倾向于保持胎儿较小以顺 利分娩,印记是母亲与胎儿,父系与母系基因之间的,种妥 协,基因偏离于正常的印记形式可能会降低子代的存活力并 改变它们的生长参数.印记在调控哺乳动物发育中起重要 作用,包括防止发病,防止妊娠期间母体与胎儿对有限营养 的竞争,控制胚胎生长和防御滋养层疾患等. 基因印迹是一种不遵从孟德尔定律,依靠单亲传递某些 遗传学性状的现象,也就是某些基因呈亲源依赖性的单等位 基因表达,另,等位基因不表达或表达极弱.关于印记基因 的起源有几种不同的假说,但它们都体现了印记基因作用的 方式与功能,保证后代在生长的促进与阻抑调控下能够正常 发育印记基因结构上的特点,保证了子代细胞中基因印记状 态的稳定遗传.基因组印记发生异常,会对个体发育产生严 重影响,同时也是阻碍克隆动物发育效率提高的关键因素之 一 .基因组印记的发现突破了传统孟德尔遗传定律规定的 法则,全面解析基因组印记的起源,在发育中的建立与维持, 对治疗印记基因缺陷的遗传疾病,从根本上解决动物克隆效 率低下的问题都有着直接的意义,也有助于我们研究表观遗 传修饰调节对动物个体发育过程的影响.此外,在这方面的 探讨对进化论的研究也有深远意义,因而在这一领域的深入 研究对未来遗传学的发展,治疗表观遗传修饰缺陷疾病,以 及解决动物克隆中的问题,都将产生广泛的影响. 参考文献 [1]伏彭辉.哺乳动物基因组印记的研究进展.畜禽业,2OO4,5:66-68 [2]DechiaraTM.,EfstratiadisA.,RobertsonEJ..Imprintingofthe mouseinsuline—likegrowth [3]SussenbachJ.,SteenberghPH.,HolthuizenP.,eta1.Struc—tune andexpressionofthehumaninsulin—likegrowthfactorgenes[J]. 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