【word】 南瓜叶枯病病原菌生物学特性研究
南瓜叶枯病病原菌生物学特性研究
松扬保2009,35(3):66—69PlantProtection
南瓜叶枯病病原菌生物
杨克泽,徐秉良,梁巧兰,薛应钰,陈荣贤,梁志福
(1.肃农业大学草业学院,草业生态系统教育部重点实验室,中美草地畜牧业
可持续发展研究中心,兰州730070;2.甘肃武威金平果有限责任公司733000)
摘要本文对南瓜叶枯病病原菌瓜链格孢(Alternariacucumerina)进行了生物学特性研究,结果表明:温度,pH,光
照对其生长和产孢都有一定的影响.该病原菌菌丝生长,产孢和萌发的适宜温度为28?,pH为7时菌丝生长最
快,pH为8时最易产孢.25?下连续黑暗培养产孢最多.碳,氮源对菌丝生长和产孢量有一定的影响,碳源中甘
露醇组菌丝生长最快,山梨醇处理产孢量最多.氮源中牛肉浸膏最适宜菌丝生长和产孢,硫酸铵最差.该菌致死温
度为5O?.
关键词南瓜叶枯病;瓜链格孢;生物学特性
中图分类号:S436.429文献标识码:ADOI:10.3969/j.issn.0529—1542.2009.03.016
Studiesonbiologicalcharacteristicsofthepathogenofthepumpkinleafblight
YangKeze,XuBingliang,LiangQiaolan,XueYingyu,ChenRongxianz,LiangZhifu
(1.CollegeDPrataculture,GansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryof
GrasslandEcosystem,MinistryofEducation,SinoU.S.Centerfor
GrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China;
2.WuweiJinpingguoCompanyCo.Ltd.,Lanzhou733000,China)
AbstractThebiologicalcharacteristicsofthepathogenofthepumpkinleafblightwerestudied.Theresuitsshowed
thattemperature,pHandlightaffectedthemycelialgrowthandsporulationofthefungus.Theoptimumgrowth
temperaturewas28?:thesuitablepHwas8:thebesttemperatureforsporulationwas25?underdarkcondition.
Bothcarbonandnitrogensourceshadaneffectonmycelialgrowthandsporulation.Thegrowthofmyceliawasthe
fastestwithmannitol,andthenumberofsporulationwasthelargestwithsorbito1.Sodidthenitrogensources.Beef
extractwasthemostsuitableforthegrowthofmyceliaandsporuiation,whileammoniumsulfatewasthepoorest.
ThelethaltemperaturetOAlternariacucumerinawas50?.
Keywordspumpkinleafblight~Alternariacucumerina;biologicalcharacteristics
据贾菊生,李新辉等报道_1],近年来,新疆瓜类
作物感染叶斑类病害日趋复杂,危害程度也与日俱
增,每逢7,8月间,瓜类作物因感染此类病害导致大
量叶片干焦,一些学者将此病命名为瓜类叶枯病.
经贾菊生等多年的病情观察和病原的研究鉴定,将
新疆瓜类作物上由链格孢菌侵染而形成的叶斑病分
为两个群组,一组是哈密瓜,西瓜被链格孢霉侵染后
形成的黑斑病类型,其病原被认为是瓜链格孢EA!一
ternariacucumerina(El1.etEv.)Elliott];另一
组是黄瓜被侵染后形成的褐斑病类型,被认为是由
南瓜链格孢(A.cucurbitaeLetendreetRoum)
引起.
近年来,在甘肃省武威市南瓜产区发生了严重
的叶枯病,南瓜栽培中后期,叶片出现较大面积的焦
枯和死亡,成为影响南瓜生产的关键性问题.为此,
作者经过初步比较鉴定,认为是由于感染瓜链格孢
菌[Alternariacucumerina(El1.etEv.)E11iott~
而导致南瓜叶片出现了大面积的枯死.田间调查表
明,某些品种病叶率达100,给南瓜生产带来严重
损失.南瓜叶枯病主要危害叶片,发病初期病斑为
褐色小点,逐渐扩大呈深绿色圆形,直径2,5mm,
边缘呈水渍状,稍微隆起,病健部界限分明,具有明
收稿日期:2008—10—16修订日期:2008—10—20
基金项目:国家自然科学基金(30671267);甘肃省中青年基金(3XZ051一A25—015)
*通讯作者Email;xubl@gsau.edu.cn
35卷第3期杨克泽等:南瓜叶枯病病原菌生物学特性研究?67?
显的轮纹,后期导致叶片焦枯,死亡,脱落.
2001年,张派勇对温室甜瓜叶枯病的发生进行
了简单报道,认为甜瓜因感染瓜链格孢而引起叶枯
病,并提出了有效的防治
[2].而关于南瓜叶枯
病的研究,在国内尚未见详细报道.为此,本文对南
瓜叶枯病生物学特性和营养条件等进行了研究,不
仅有利于进一步认识病原菌的本质,病害发生特点,
而且在其与土壤碳,氮等养分转化关系研究方面有
重要意义.
1材料与方法
1.1材料
南瓜叶枯病的标本采自甘肃省武威市金苹果公
司南瓜生产基地.对所采集的新鲜病叶用常规组织
分离法分离,切取5mm大小病健交界组织,用
0.1升汞溶液消毒3O,50S,后用灭菌水换洗4
次,置于PDA培养基中,放在28?生化培养箱中培
养48h.将培养后的菌种采用稀释纯化法进行单孢
分离和纯化,并保存在PDA斜面培养基上备用l3一.
1.2方法
1.2.1温度对瓜链格孢菌丝生长和产孢量的影响
1.2.1.1温度对瓜链格孢菌丝生长的影响
取培养7d的菌落,用打孔器沿菌落边缘打取
内径0.4cm菌饼移人PDA平板中央,每皿1块,分
别置于5,10,15,20,25,28,30,35,40?无光照保湿
培养7d,用十字交叉法每2d测量1次菌落的直
径,取其平均值并计算菌丝平均生长速度.每个处
理5个重复.
1.2.1.2温度对瓜链格孢产孢量的影向
从培养7d的瓜链格孢PDA平板,在距离菌落
中心1cm处取直径0.4cm的3个菌饼于5mI无
菌水中,加1滴吐温一8O激烈振荡使孢子脱落,取
50L孢子悬浮液用载玻片平板计数法在光学显微
镜下随机检查10个视野(40×10)的孢子数量并取
平均值.
1.2.2pH对瓜链格孢菌丝生长和产孢量的影响
用0.1mol/L的NaOH或HC1将PDA培养
基调节pH为5.0,6.0,7.0,8.0,9.0等5个梯度后
再灭菌,用内径为0.4cm的无菌打孔器沿菌落边缘
打取菌饼移人PDA平板中央,每皿1个,每个处理
5个重复.在室温下培养,按1.2.1中的方法测量
菌丝生长和产孢量.
1.2.3光照对菌丝生长和产孢量的影响L5
将已接种的PDA培养基分为5组,在25?条
件下培养24h后作如下处理:25?持续光照培养
96h(光照培养箱);25?持续黑暗培养96h;25?
黑暗12h与光照12h交替培养96h;紫外线照射
2h后于25?连续黑暗培养96h;紫外线照射2h
后于25?持续光照培养96h.每处理重复5次.
按1.2.1中的方法测量菌丝生长和产孢量.
1.2.4不同碳源对瓜链格孢菌丝生长和产孢量的
影响.:
试验所用的基本培养基为查彼(Czapek)培养基:
1L蒸馏水中含1gKHzPO4,0.5gMgSO~?7H2O,
0.01gFeSO4?7HeO,30g蔗糖,0.5gKC1,2g
NaNO3.制平板时1L培养液中加入17g琼脂.分
别以相同质量的葡萄糖,麦芽糖,淀粉,乳糖,甘露醇
和山梨醇代替基本培养基中的蔗糖,配成不同碳源的
培养基,并以不加碳素的培养基为对照.沿菌落边缘
取直径为0.4cm菌饼接人平板中央,室温培养,每个
处理重复4次.7d后观察菌落形态和孢子形成情
况,并按1.2.1中的方法测量菌丝生长和产孢量.
1.2.5不同氮源对瓜链格孢菌丝生长和产孢量的
影响
分别以相同质量氮的甘氨酸,硫酸铵,硝酸铵,
氯化铵,DL-蛋氨酸,牛肉浸膏和尿素替代基本培养
基中的NAN().,配成不同氮源的培养基,并以不加
氮素,补加2g0.1mol/LNaC1的培养基为对照.
同1.2.1中的方法测量菌丝生长和产孢量.
1.2.6瓜链格孢菌致死温度测定
移取直径为0.4CFI’I的菌饼到无菌试管中,加入
2mL的无菌水,置于40,45,5O,55,6O,65,70?的
恒温水浴中加热10min,取出后立即在冰水中冷却
至室温.将处理后的菌饼接种到PDA平板上,7d
后观察其生长情况,每个处理5个重复.
1.2.7温度对瓜链格孢分生孢子萌发的影响
孢子萌发采用悬滴法[3,在发病的南瓜叶片上,
用南瓜叶片煎汁液经灭菌制成孢子悬浮液,采用凹
玻片悬滴法放在保湿培养皿内,分别置于5,15,20,
25,28,30,35,40?的恒温箱中,每个温度设2次重
复,24h后镜检,测定不同温度下分生孢子的萌
发率.
1.2.8不同营养液对瓜链格孢分生孢子萌发的影响
设置10南瓜叶片煎汁,10蔗糖液,1O葡
萄糖液,蒸馏水4个处理,以无菌水做对照,配制成
不同营养的孢子悬浮液,用悬滴法做孢子萌发试验,
每个处理2次重复,置于28?的恒温箱中,24h后
镜检孢子萌发率.
?
68?舡物锯2009
2结果与分析
2.1温度对瓜链格孢菌丝生长及产孢量的影响
在25~30?的温度范围内菌丝生长较好,其中
28?生长最快,与其他温度差异显着.产孢量以
28?最多,平均每个视野103.5个,瓜链格孢菌在
5?以下和4O?以上几乎不生长也不产孢(表1).
表1温度对瓜链格孢菌丝生长及产孢量的影响”
温度/?菌短牛长速率/cm?d孢了量/个?视野
0.089f
0.344e
O.353e
0.550d
0.829b
0.883a
0.781C
0.336e
0.033f
1)同列不同小写字母表示0.05水平下差异显着性.
2.2pH和光照对瓜链格孢菌丝生长和产孢量的影响
该病原菌能适应较宽的pH范围,在pH为5,
9时,菌丝直径和产孢量较好,其中pH为7时菌丝
生长最快,pH为8时产孢量最多;pH8与pH9之
间,菌丝生长速率和产孢量差异都不显着;pH为8
时菌丝生长次之,而pH为5时菌丝生长速率最慢
产孢量最少,说明该菌在中性条件下生长快,但在偏
碱性条件下容易产孢;pH5,pH6和pH7之间产孢
量无明显差异,产孢量都较少(表2).
该菌在25?条件培养24h后进行不同光照处
理后菌丝生长和产孢量有一定差异.12h光暗交替
培养96h的菌丝生长速率最大,与其他4种条件形
成显着差异;紫外线照射2h后持续黑暗菌丝生长
速率最小.产孢量以持续黑暗培养96h最多,紫外
照射2h后持续黑暗96h次之,持续光照培养96h
产孢量最少(表2).
表2不同pH和光照条件下瓜链格孢菌丝生长速率及产孢量(25oC)
pH生长速率/cm?d孢子量/个?视野光照条件生长速率/cm?d孢子量/
个?视野1
50.91c26.4b持续光照1.O1b18.5c
60.97b27.8b持续黑暗1.O0b41.2a
71.11a21.4b12h光暗交替1.06a28.7b
80.99b53.9a紫外照射2h持续光照0.95C21.3d
90.97b53.6a紫外照射2h持续黑暗0.94c37.0a
1)同不I司小写字母表不0.05水半r差异显着性.
2.3碳源对瓜链格孢菌丝生长及产孢量的影响
与其他生物一样,碳和氮也是南瓜叶枯病病原
菌生长繁殖的必需元素之一.该病原菌在山梨醇,
甘露醇,淀粉,乳糖,葡萄糖,麦芽糖培养基上都能生
长,并且都与缺碳对照差异显着.最适碳源为山梨
醇,甘露醇产孢量最少但菌丝生长速率最大,该菌在
葡萄糖和蔗糖培养基上生长速率和产孢量比较接
近,在麦芽糖培养基上生长最慢.缺碳时菌丝几乎
不生长产孢量为0,说明碳源是病原菌生长的必需
元素(表3).
表3碳,氮源对瓜链格孢菌丝生长及产孢量的影响
碳源生长速率/cm?d孢子量/个?视野氮源生长速率/crn?d一1孢子量
/个?视野_-
甘露醇0.8Oa3.6e牛肉浸膏O.86a90.1a
山梨醇0.78a52.1a蛋氨酸0.65b16.7e
乳糖0.77ab17.3C甘氨酸0.56C24.1d
淀粉0.74b11.1d缺氮0.51d5.6f
葡萄糖0.69C30.5b硝酸钠0.49d36.4c
蔗糖0.64d26.3b硝酸铵0.42e24.6d
麦芽糖0.57e18.8c尿素0.41e43.7b
缺碳0.O0f0.0f硫酸铵0.38f15.0e
1)l司列不l司小写字母表不0.05水半差异显着性.
2.4氮源对瓜链格孢菌丝生长及产孢量的影响
7个供试氮源均能明显促进病原菌的生长,
在不同氮源的Czapek培养基平板上,病原菌的培
养性状差异较大.在牛肉浸膏培养基上菌丝生
长最快且产孢量最多,与其他氮源差异显着.硫
酸铵上的菌丝生长最慢,生长较差,产孢量也较
少.硝酸钠和甘氨酸的菌丝生长速率比较接近,
尿素和硝酸铵的菌丝生长速率几乎一样.缺氮
时菌丝生长较快但只是稀疏的气生菌丝,且几乎
不产孢(表3).
ffedbaCef
O7O82520O
O29?9O
35卷第3期杨克泽等:南瓜叶枯病病原菌生物学特性研究?69?
2.5致死温度
7d后,经过4O?和45?恒温水浴处理10min
后,菌丝块在PDA平板培养基上分别形成平均直径
为0.64cm和0.46cm的菌落,而经5O?恒温处理
lOrain后,在PDA培养基上未形成菌落,由此可
知,该病原菌的致死温度为50?,10rain.
2.6温度对孢子萌发的影响
采用凹玻片悬滴法对瓜链格孢分生孢子萌发测
定表明,在10~35?温度范围内该分生孢子都能萌
发,25~30?范围内萌发较好,28?孢子萌发率最
高,说明该孢子的最适温度为28?,在5?以下,
4O?以上不能萌发(图1).
\
替
辖
H’
5lO152O2528303540
温度/?
图1温度对瓜链格孢分生孢子萌发的影响
2.7不同营养液对分生孢子萌发的影响
由图2看出:分生孢子以在1O的南瓜叶片煎
汁中萌发率最高,1O葡萄糖液和1O蔗糖液对孢
子的萌发具有一定促进作用,在蒸馏水中萌发率很
低,在无菌水中几乎不能萌发,说明分生孢子的萌发
需要一定的营养条件.
琴?
一.嘲.圉圉霹
不同营养液
图2不同营养液对瓜链格孢孢子萌发的影响
3结论与讨论
在甘肃武威地区,南瓜叶枯病病原菌瓜链格孢
生长和萌发的最适宜温度范围为25,30?,28?
最适宜产孢,5?基本不产孢.pH对该菌生长有一
定影响,pH6,8时生长旺盛,pH小于5或大于9
抑制其生长,最适pH为8.病原菌连续黑暗培养
96h产孢量最多;黑暗12h与光照12h交替培养
96h的菌丝生长最快;紫外照射2h后对菌丝生长
具有抑制作用,对产孢量的影响不显着;该病原菌能
够利用多种碳,氮源生长并产孢;氮源中牛肉浸膏具
有明显促进作用,牛肉浸膏产孢量最多,缺氮组最
少,具有明显差异;碳源中山梨醇产孢量最多,甘露
醇和缺碳最少,存在显着差异;研究还表明该病原菌
的致死温度为50?左右,分生孢子的萌发需要一定
的营养条件,在南瓜叶片煎汁中萌发率最高.
本文对南瓜叶枯病病原瓜链格孢生物学特性
研究结果与邹凤莲等对番红花链格孢菌生物学特
性研究结果l6一基本一致.瓜链格孢菌生长和产孢
最适宜温度为28?,而番红花链格孢菌为25?,
但对碳,氮源利用有些不同.从瓜链格孢菌丝生长
与温度的关系来看,该菌最适温度较高且适温范围
较宽,15,3O?范围内能够生长.对pH的适应
范围和对碳,氮源的需求也较宽,这表明该菌对环
境的适应性较强.因此,在进一步研究南瓜病害的
流行规律与流行分区时应予以重视.当培养基碳,
氮源变化时瓜链格孢的菌丝形态和色泽发生了明
显变化,这一特点有可能用于研制和开发适宜的鉴
别性培养基,进行病原菌的快速鉴定.本文仅对甘
肃武威地区南瓜叶枯病病原菌的生物学特性进行
了初步研究,自然界不同地理来源的同一种真菌不
同个体间生物学特性方面存在较大差异_8],因此,
今后有必要对不同地理来源瓜链格孢菌株问的生
物学特性进行比较研究.
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