【word】 红花注射治疗对兔耳增生性瘢痕中TGFβ_1的表达变化

【word】 红花注射治疗对兔耳增生性瘢痕中TGFβ_1的表达变化 红花注射治疗对兔耳增生性瘢痕中TGFβ_1 的表达变化 1294 ? 基础研究? 重庆医学2011年5月第4O卷第13期 红花注射治疗对兔耳增生性瘢痕中TGFt3的表达变化 刘燕,傅跃先?,邱林,田晓菲,甘立强,肖军 (重庆医科大学附属儿童医院烧伤整形科400014) 摘要:目的观察红花对兔耳增生性瘢痕(HS)及其转化生长因子p(TGFI3)表达的影响.方法取27只新西兰大白兔 免耳腹侧建立HS模型,每耳2块.术后第45天开始对HS行注射治疗,每周1次,连续注射4次.设立正常皮肤组,阳性对照 组,生理盐水组,低浓度红花(125g/L)组,高浓度红花(500g/L)组.注射完成后第2,4,6周分别测量HS厚度及硬度并切取8只 兔耳HS及皮肤,采用免疫组织化学方法检测每块组织TGFI3蛋白的表达(TGFt3蛋白面密度),RT—PCR方法检测每块组织 TGFB]mRNA的表达.结果注射后4,6周,高浓度红花组HS厚度及硬度均较其他HS组低(P<O.05);注射后2,4,6周,高浓 度红花组TOF~I蛋白面密度值及TGFI3mRNA的表达均较其他HS 组低(P<O.05);低浓度红花组TGFt3,mRNA的表达在注 射后4,6周均较阳性对照及生理盐水组低(P<0.05).结论红花能促 进兔耳HS的软化,变薄,并能抑制兔耳HS的TGFI3:的 表达,尤以高浓度红花组明显.红花抑制兔耳HS的机制可能与 TGFI31的表达被抑制相关. 关键词:瘢痕;红花;转化生长因子口 doi:10.3969issn.167I-8348.2O11.13.019文献标识码:A文章编 号:1671-8348(20l1)13一l294—03 TGFplexpressionchangesinhypertrophicscarofrabbitsearsbycarthamustinctoriusinjection LiuYah,FuYuexian,QiuLin,TianXiaofei,GanLiqiang,XiaoJun. (DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,ChildrensHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China) Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofcarthamustinctoriusonhypertrophicscar(HS)ofrabbitsearsanditstrans forminggrowthfactor-131(TGF~I)expression.Methods27NewZealandrabbitswerechosenasexperimentanimals.Themodelsof HSwereestablishedwith2HSineachear.On45dafteroperation,HSofarabbitwasinjectedwithnothing,sodiumchloride, carthamustinctorius(125g/L)andcarthamustinctorius(500g/L)respectively.Thetreatmentwasdoneonceaweekfor4weeks. On2,4,6weeksafterinjeetion,HSandskinof8rabbitsthatwerechosenrando mlyweremeasuredtheirthicknessesandhardnes— ses,wereharvestedanddetectedbyimmunohistochemicalmethodandrevers PCR). etranscriptionpolymerasechainreaction(RT— ResultsOn4.6weeksafterinjection,thethicknessesandthehardnessesofgroupcarthamustinctorius(500g/L)werelowestin allHSgroups(P%0.05).TheareadensityofTGFB1proteinandexpressionofTGFI?:mRNAingroupcarthamustinctorius(500g/ L)wereboththelowestinallHSgroupson2,4,6weeksafterinjection(P<0.05).TheexpressionofTGFI31mRNAingroup carthamustinctorius(125g/L)waslowerthanpositivecontrolandsodiumchloridegroupson4,6weeksafterinjection(P%0.05). ConclusionCarthanmstinctoruscouldenhanceHSinrabbitsearssoftening,andcouldinhibittheexpressionofTGFG1.Theeffect ofcarthamustinctorius(500g/L)ismorethancarthamustinctorius(125g/L).ThemechanisminhibitingHSofrabbitseariscor— relativepossiblytotheexpressionsinhibitionofTGFI3lbyearthamustinetorius. Keywords:cicatrix;carthamustinctorius;transforminggrowthfactorbetal 增生性瘢痕(hypertrophicsear,HS)是创伤愈合的异常结 局,可造成机体的外形改变和功能障碍,并伴有痒痛,影响生活 质量,迄今为止,HS的治疗方法多种多样,但疗效有限.近年 来中药抑制病理性瘢痕生长并促进其软化逐渐被人们发现,并 用于研究.故本课题设计兔活体HS模型作为实验对象,通过 红花注射治疗后了解其对HS及其TGFB的影响. 1材料与方法 1.1材料27只新西兰大白兔,雌雄不限,体质量 (1885.875?82.1919)g,由重庆医科大学实验动物中心提 供.500g/L红花注射液由山西太原华卫药业有限公司生产. 鼠抗TGFI31多克隆抗体购于美国SantaCruzbiotechnology公 司.鼠/兔s—P试剂盒,二氨基联苯胺显色试剂盒等购于福州 迈新生物技术开发公司.PCR引物由上海英骏生物技术公司 合成.Taq酶,DNsaeI(RNasefree),MMulvReverseTran— scriptase购自上海生物工程有限公司.RNA提取试剂Tri— purereagent为Roche公司产品. 1.2方法 1.2.1Hs模型的建立于兔耳腹侧手术切除1cmX1em大 小皮肤及软骨膜,间距为3cm,每耳2块,无菌纱布包扎J. 1.2.2分组及给药术后第45天开始对兔耳HS进行治疗, 其中右耳外侧HS为阳性对照组,不予以任何处理;右耳内侧 HS为生理盐水组,注射生理盐水;左耳内侧HS为低浓度红花 组,注射125g/L红花注射液;左耳外侧HS为高浓度红花组, 注射500g/L红花注射液.注射量均为0.15mL,待HS发白 *基金项目:重庆市卫生局科研项目(渝中N(2002—63]);重庆医科大学儿科学院资助课题.通讯作者,Tel:(023)63632270;E—mail yuexianfu@163.corn. 重庆医学2011年5月第4O卷第13期 表1HS厚度及硬度(?5) 1295 a:P<0.05,与阳性对照,生理盐水组,低浓度红花组比较;b:P<0.05, 与各HS组比较. 时停止注射.每周1次,共注射4次.自身兔耳腹侧皮肤作 对照. 1.2.3表观检查术后第45天,注射完成后第2,4,6周,分 别用SEQUIA512彩色多普勒彩色超声诊断仪13HZ高频探 头检测瘢痕及皮肤厚度,硬度计测量瘢痕及皮肤硬度. 1.2.4标本采集注射完成后(以后表述为注射后)第2,4,6 周分别切取8只兔耳HS标本,同时,于右耳腹侧各切取1块 相同大小的皮肤标本.标本的各一半分别于多聚甲醛液和液 氮保存. 1.2.5TGF/3蛋白表达的检测采用免疫组织化学法,多聚 甲醛固定后的标本经包埋,切片,烘烤,脱蜡,水化,抗原修复, 阻断内源性过氧化物酶活性,封闭血清,加鼠抗TGFI3多克隆 抗体,加二抗,蛋白结合,显色,苏木素复染,脱水,透明,封片 后,光学显微镜下观察1O个视野,并采用IPP软件进行TGFI3 蛋白面密度(视野中被物体的总面积/视场面积)处理]. 1.2.6TGF8mRNA表达的测定采用RT—PCR,即总RNA 提取,并除去RNA中的DNA污染;cDNA第一链合成,用反 转录试剂盒,将总RNA逆转录成cDNA第一链,反应体积2O “L,反应条件为42?,孵育60min,99?5min终止反应,4 ?5min灭活反转录酶;TGF~I引物合成上游引物F5f_CTT CTCCACCAACTACTGCTTC-3下游引物R5|_CTCCAC CTTGGGCTTGCGGC-3(288bp);PCR扩增,PCR反应条 件为:94?预变性13min,然后按94?30s,55?30S,72? 30S进行32个循环,最后72?延伸8min;根据扩增片段,进 行1.1琼脂糖电泳,最后用Bandscan扫描系统,测定各产物 密度值,用凝胶自动成像仪拍照. 1.3统计学方法运用SAS8.2软件分析,统计学采用完全 随机设计下的多组之间的多重比较方法(SNK方法)对HS厚 度,硬度,TG即蛋白面密度及TGF#mRNA平均光密度值 进行分析,数据以i?表示.P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1HS表观改变术后第45天,兔耳HS发生率为89.81 (术后第4,5天,2个创面发生穿孔;术后第45天,9个创面未 形成HS;未形成HS的创面及发生穿孔创面位于3只兔耳 中),呈暗红色,高出体表皮肤,质硬,HE染色见真皮层内大量 成纤维细胞增殖,并且有与人类HS相似的结节或旋涡状结 构.注射后2,4,6周,各组HS色泽均逐渐变浅,厚度逐渐变 低,硬度逐渐变小,尤以高浓度红花组明显,高浓度红花组在注 射后4,6周两值均较其他各HS组低(P<O.05),见表1. 2.2各组TGFI?蛋白表达检测结果注射后第2,4,6周,各 HS组TGI~H蛋白面密度呈下降趋势,同一时间段高浓度红花 组均为各HS组中最低值(P<O.05),见表2. 表2各组TG即面密度测定结果比较(?s,=8) :P<0.05,与阳性对照,生理盐水组比较;:P<0.05,与其他各 HS组比较;:P<0.05,与各HS组比较. 2.3TGF.rnRNA表达测定结果RT—PCR法通过电泳条 带的平均光密度值反映TGmRNA的表达,二者成反比关 系.阳性对照,生理盐水组TGF/?mRNA平均光密度值在注 射后第2,4,6周无明显变化且接近;高,低浓度红花组TGF臼 mRNA平均光密度值在注射后第2,4,6周均逐渐升高,且尤 以高浓度红花组明显;三时间段高浓度红花组TGFI3mRNA 平均光密度值均较其他各HS组高(P<0.05);低浓度红花组 TGFBmRNA平均光密度值在注射后第4及6周均较阳性对 照及生理盐水组高(P<0.05),见表3. 表3各组TGmRNA平均光密度测定 结果比较(5_--+-S,一8) :P<0.05,与阳性对照,生理盐水组比较;:P<0.05,与其他各 HS组比较;.:P<O.05,与各HS组比较. 3讨论 HS形成是多种细胞及细胞因子相互作用,调控的结 果l_3],转化生长因子(TGFa)在其中扮演着重要角色.TGFB 被认为是促纤维化发展的最重要的生长因子,它既可促进成纤 维细胞增殖并分泌基质成分,又可抑制其降解.在创伤修复过 程中,TGF8是巨噬细胞,中性粒细胞的有力激活剂,经自分 泌和旁分泌,TG局部浓度增加,激活巨噬细胞,提高 1296 TGFGmRNA的表达,进一步促进成纤维细胞增殖.甚至加 入外源性的TGF8也可增加创伤中胶原纤维,蛋A和炎性细 胞的数量,TGFI3被认为是促进瘢痕组织形成必需的因素l4]. 近年研究还发现瘢痕形成与细胞外基质代谢异常l5],高自 由基],过度脂质过氧化反应,过度炎性反应及免疫有关口_8. 中医认为瘢痕系气血壅滞,经络痹阻,痰湿搏结或三者相 辅而成所致,因此活血化淤,软坚散结成为中医治疗瘢痕的关 键.红花为活血化淤类中药的重要代表药物,近年研究发现红 花具有减少自由基,抑制脂质过氧化反应,炎性反应等作 用[91o3.已有研究证明红花能抑制.肾小管间质纤维化,肝脏纤 维增生,丹参红花提取物能抑制心肌间质成纤维细胞胶原 合成,抑制体外培养的人HS成纤维细胞的增殖和胶原合 成[1.本文结果显示,高浓度红花能促进HS厚度及硬度降 低,低浓度和高浓度的红花药液均能抑制TGFI3的表达,且高 浓度红花明显优于低浓度红花,两种浓度红花药液对兔耳HS 模型的表观改变基本一致.故推测红花抑制兔耳增生性瘢痕 的机制可能与TGF[3的表达被抑制相关. 红花注射液为中药提取物,其成分复杂,药理表明红花黄 色素是红花中的主要有效成分l】].研究表明红花黄色素可 抑制脂质过氧化,清除氧自由基,控制炎症过程病理变化的肉 芽增生,故推测红花黄色素可能为抑制HS的有效成分. 在今后的研究中,有待进一步明确红花作用的具体有效成分及 其作用机制. 参考文献 [1] [2] [3] [41 李希军,柳大烈,王吉慧.兔耳增生性瘢痕模型建立方法 的探讨[J1.中国美容医学,2006,15(5):499—500. 王少华,曹广信,王燕华,等.病理性瘢痕中结缔组织生长 因子的免疫组化研究l-j].中国美容医学,2007,16(8): 1032—1035. 张娟娟,吕世军.病理性瘢痕发病机制研究进展[J].医学 综述,2007,13(8):580—582. 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