刺梨多糖提取纯化工艺及刺梨多糖铁复合物合成研究（可编辑）

刺梨多糖提取纯化工艺及刺梨多糖铁复合物合成研究（可编辑） 密 级 分类号 学校代码 文 学位论 题目刺梨多糖提取纯化工艺及刺梨多糖铁复合物 合成的研究 夔 指导老师姓名: 塾 专业名称: 主药鲎 申请学位级别: 亟? 论文提交日期:迎垡址论文答辩日期?骘幽弛 学位授予单位和日期:酶剐医堑争型萄 答辩委员会主席:』羟贵阳中医学院硕士学位论文相关声明 原创性声明四号宋体加粗居中 本文声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的 研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的地方外, 论文中不包含 其他人已经发表论文中撰写过的研究成果,也不包含为获得贵阳 中医学院或其他 单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均 己在论文中作了明确说明。 日期:夕矽年多月乡日 储:嘲哆 关于学位论文使用授权说明 本文了解贵阳中医学院有关保留、使用学位论文的,即:学校有权保留 学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内 容,可以采用复印、缩印或其他手段保存学位论文;学校可根据国家或贵州省有 关部门规定送交学位论文。 日期:彩年名月?日 储雠:哪聊撇:贵阳中医学院硕士学位论文 目录 中文摘要?.?..??.??.?一?..??...?.?.?....?. 前言??..? 刖看??..? 实验部分.??一?.. 第一章刺梨不同干燥、不同采收期及不同提取部位优选??.. .实验材料??.... .方法与结果.??.. .精制多糖的制备. .方法学的考察??..?. .刺梨不同干燥条件优选? .刺梨不同采收期多糖含量的测定??..?. .刺梨不同部位多糖含量测定??..??... .结果. 结论与讨论 第二章刺梨多糖的提取纯化及刺梨多糖铁的合成??.. 实验材料??.一. 方法与结果??.. .刺梨粗多糖的制备?.? .方法学考察一.. .刺梨粗多糖提取方法优选. .粗多糖水提法正交实验??..?. .脱色工艺研究.. .聚酰胺脱色单因素考察?.??一 .除蛋白工艺研究?....一 .三氯乙酸法除蛋白工艺优化.?.?...?.. .刺梨多糖铁的合成...?. 结论与讨论..?.......一?..??. 第三章总结和创新点........??........................... 一..?..贵阳中医学院硕士学位论文 参考文献.??..?.....??..?.?... 附录一综述??..?.??.. 附录二附图一?.??..?..??..?...?.. 附录三致谢...?..?.?.?..??.. 附录四个人简介?..??.?.?.?.?..一..... 贵阳中医学院硕士学位论文 中文摘要 目的本课题以蔷薇科植物刺梨干燥果为原料,从中提取刺梨多糖,并进一步合 成刺梨多糖铁复合物,创新之处在于对刺梨的干燥条件、采摘时间、使用部位、 提取纯化方法及合成多糖铁复合物进行一系列实验,以刺梨多糖含量及产率为指 标进行研究,为大量提取刺梨多糖及合成刺梨多糖铁复合物做准备。 方法首先,采用水提醇沉法对刺梨不同干燥条件、不同采收期及不同部位进行 优选;然后,采用水提醇沉法及提取法两种提取多糖方法相比较的方式进行 方法优选,优选出的提取方法进行正交实验,得到最佳提取工艺条件,再考察不 同的脱色及除蛋白方法对刺梨粗多糖含量的影响;最后,将刺梨多糖与三氯化铁 合成刺梨多糖铁。 结果通过实验,得到自然干燥条件下月底采摘刺梨果肉中刺梨多糖含量最 高;对刺梨提取方法进行比较及优选后,得到:刺梨果肉粉在提取次,每次加 倍量蒸馏水,提取.小时是含量最高且产率较高,刺梨粗多糖脱色及除蛋白 最佳工艺为:粗多糖最佳脱色浓度为.?,药脂比粗多糖量/树脂 量比值为,脱色时间小时,脱色效果最好,除蛋白方法以/倍量的 %氯乙酸溶液,振摇离心,除蛋白效果最好。将刺梨多糖与三氯化铁 合成刺梨多糖铁后,测得其铁含量为.%。 结论本实验分别对刺梨的干燥条件、采摘时间、使用部位、提取纯化方法及 合成多糖铁复合物进行一系列实验,得到的结果可为以后工业生产选取栽培刺梨 提取刺梨多糖及合成刺梨多糖铁复合物提供参考依据。 关键词刺梨;多糖;提取方法;纯化贵阳中医学院硕士学位论文 : , 也 , ,, ,. 蚯 , . : , ,; ,,;, . :, ; :. , , : .‘~, /蓟 ,/ % 贵阳中医学院匍士学位论文 ; , .蹴., , : : , , 耐 . 呵: ;; ; 贵阳中医学院硕士学位论文 ?上..‘ 刖百 刺梨 . . 是蔷薇科植物缫丝 花的果实,原产于云贵高原,贵州、四川、湖北等省。入本草始载于‘纲目拾遗》。 《官游笔记》谓:“刺梨形如棠梨,多芒刺,不可触,味甘而涩?花于夏,实 于秋,花有单瓣、重台之别,名为送春归,蜜萼繁英,红紫相间。据考证,重 台者为蔷薇科植物缫丝花,此花所结果实即为本实验所用的刺梨果,含有丰富的 维生素、超氧化物歧化酶、刺梨黄酮及刺梨多糖等。是一种具有较高价值药食 的两用植物,在贵州省内有着丰富的资源。自然成熟时含有大量的多糖成分且具 有广泛的药理作用。 刺梨不仅能增加血浆中抗氧化剂的含量,也可提高机体抗氧化能力,减轻自 由基引起的动脉及毛细管内皮等的损伤, 维持心血管和中枢神经的正常功能。 人体血液中超氧化物歧化酶含量高低与寿命长短成正比关系。而随着年龄增长, 人体超氧化物歧化酶减少,过氧脂质则上升,刺梨可提高体内超氧化物歧化酶含 量,因而可延缓衰老。曾被证实,刺梨的作用之一为抑制衰老小鼠脑单胺氧化酶 活性,减少单胺氧化酶的脱氧,延迟大脑衰老。 将刺梨榨汁口服后,冠心病患者血浆抗氧化剂水平升高,且低密度脂蛋白抗 氧化能力也提高瞳。通过研究得到刺梨汁是通过抑制低密度脂蛋白的氧化修饰, 并且多种抗氧化剂可介导细胞内胆固醇外流,从而抑制促泡沫细胞的形成来实现 其抗动脉硬化的功能?,。 多糖广泛存在于动物、植物和微生物细胞壁中,是生物体中广泛存在的一种 物质,由醛基和酮基通过糖普键连接而成,为一种高分子聚合物,是维持生命活 动正常运转的基本物质之一,也是构成生命的四大基本物质之一。它毒性小、安 全性能高、功能也广泛,具有非常重要和特殊的生理活性。部分多糖通过共价键 与蛋白质,构成了蛋白聚糖发挥多种生物学功能,可作为机体润滑剂、血型物质 的基本成分、识别外来组织的细胞等。自发现真菌多糖具有抗癌作用以来,陆陆 续续发现多糖类化合物具有免疫调节、降血糖等生物活性。因此对多糖的研究领 域越来越广泛嘲。 贵阳中医学院硕士学位论文 现代科学技术对中药多糖的提取、纯化、分子结构、生物活性等方面进行研 究已成为当前研究趋势耵。 目前在多糖的提取方法中常见的传统方法嘲有水提醇沉法、碱提取法和酸提 、 取法。因这些方法设备要求低,且操作简单,在多糖提取工艺中占一定比例。对 多糖的提取工艺还有一些新技术,比如:超临界萃取技术、超声波提取法、 酶法、微波提取法、半仿生提取法等技术。多糖在经过提取后可能还未除去其中 的蛋白质等物质,因此要使用纯化方法对多糖进行处理,而且前对多糖的纯化方 法主要有:分步沉淀法、盐析法、季铵盐沉淀法、透析法、柱色谱法等。 而对于刺梨多糖提取方法,王慧嘲等的研究采用多糖提取方法中的传统方 法:水提醇沉法,对刺梨多糖的提取工艺进行优化,实验使用苯酚一浓硫酸法测 定刺梨多糖含量。结果得到刺梨多糖提取的最佳工艺条件为:水用量为刺梨粉末 体积的倍,提取次,提取时间为小时,温度为?,使用乙醇浓度为%进 行沉淀。 至今为止,对刺梨多糖提取和纯化工艺的研究报道很少。因此,本实验将刺 梨的提取纯化工艺进行了研究并优化,可也为大量生产刺梨多糖铁复合物的制备 做一个前期的准备,为刺梨多糖铁保健品的制备尽一份力。 贵阳中医学院硕士学位论文 实验部分 第一章刺梨不同干燥方法、不同采收期及不同提取部位优选 .实验材料 仪器 紫外可见分光光度计澳大利亚照生公司;一 旋转蒸发器上海亚荣公司;电子天平日本;卜?离心沉淀机 上海医用分析仪器厂;一冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限 公司;四数显恒温水浴锅常州澳华仪器有限公司;循环水 式多用真空泵河南巩义市英谷子华仪器厂 试剂葡萄糖天津市科密欧化学试剂开发中心,批号,分析纯; %乙醇上海振兴化工一厂,批号,分析纯;三氯甲烷西龙化工 股份有限公司,批号,分析纯;正丁醇天津市化学试剂二厂,批号 ,分析纯;蒸馏水实验室自制;苯酚重蒸;浓硫酸分析纯。 材料刺梨,采于贵州龙里千家卡,经贵阳中医学院生药教研室王 世青教授 .. . 鉴定为蔷薇科蔷薇属植物刺梨 的果实。 .方法与结果 本实验采用硫酸一苯酚法测定刺梨中多糖含量,其原理是:多糖 在适当温度 下被浓硫酸水解成单糖,并迅速脱水成糖醛衍生物,该衍生物在 强酸条件下与苯 酚反应生成橙黄色溶液,此溶液在一定波长内有最大吸收峰?。 .精制多糖的制备 ..原料预处理 刺梨果肉一自然干燥一粉碎一过目筛一石油醚索式提取小时,脱 除脂肪类物质一药渣水浴挥干溶剂一再用%乙醇索式提取小时, 脱除部分 贵阳中医学院硕士学位论文 水溶性色素和单糖一药渣水浴挥干溶剂一置干燥器中保存备用。 ..提取多糖 准确称取.经预处理的刺梨粉末,加入其倍体积的蒸馏水,摇匀后 置于恒温水浴锅中回流提取次,每次。抽滤,所得滤液为刺梨多糖粗 提液。将粗提液在条件下置旋转蒸发器中浓缩至原体积的%,浓缩液加入 聚酰胺,搅拌,静置脱色,脱色后的浓缩液加入氯仿:正丁醇:溶液,振 荡分钟,静置小时,/离心,用半透膜扎袋透析过夜以脱去部分 小分子物质,透析后的溶液中加入倍体积的%乙醇,搅拌摇匀,置于冰箱中 静置过夜使沉淀完全,抽滤,将沉淀真空干燥得刺梨多糖。 ..样品溶液的制备 精密称取刺梨多糖.,蒸馏水溶解,即得,放置备用。 .方法学的考察 ..对照品溶液的制备 精密称取?干燥至恒重的无水葡萄糖对照品.于,置 容量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,再精密吸取此溶液?,用蒸馏水定容至 ,得浓度为. .‘的葡萄糖对照品溶液。 ..最大波长的选择 精密吸取. ,置于比色管中,加入 .?。的对照品溶液. %苯酚溶液,浓硫酸,迅速振摇混匀,室温下放置 ,将. 一 的水同法操作空白,在 波长做全波长扫描。扫描情况见图。 躬 .. 。. 图葡萄糖全波长扫描图贵阳中医学院硕士学位论文 从图结果可知:在处有最大吸收。因此选择作为测定波长。 ..葡萄糖标准曲线的绘制 精密吸取浓度为. .的葡萄糖对照品溶液.、.、.、.、 .、.、.、. 分别置于 比色管中,依次加入蒸馏水使最终体积 为?,以水作为空白液,分别加入%苯酚?、浓硫酸,摇匀,室 温放置分钟,以空白校正零点,于测定吸光度,以吸光度为纵 坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。 各样号吸光度实验结果表,绘制标准曲线见图。 表葡萄糖溶液浓度与吸光度 图葡萄糖标准工作曲线 .,结果表明 计算得回归方程为:.. 对照品溶液在.~.??范围内吸收度与浓度线性关系良好。 ..换算因数的测定 容量瓶中,蒸馏水 精密称取精制刺梨多糖. 份,分别置于 溶解并稀释至刻度,摇匀,放置做为储备液。精密吸取储备液,按标准曲线 贵阳中医学院硕士学位论文 制定项下方法操作,测定吸光度,从回归方程中求得供试液中葡萄糖的质量“, 按/ 计算换算因子。式中为精制多糖的质量为多 糖稀释液中葡萄糖质量,为多糖溶液的稀释因素。计算得到换算因素 .。测定结果如表。 表换算因数测定结果 ..精密度试验 精密吸取对照品溶液.,按照标准曲线项下的测定方法操作,重复测定 吸光度次,计算相对标准偏差%,即可得到此项测定方法的精密度,结果 见表。 表精密度试验测定结果表 计算得.%,结果表明仪器的精密度良好。 ..稳定性试验 精密吸取样品溶液.,按照样品含量的测定方法测定吸光度,每隔 分钟测定一次吸光度,共测次,观察吸光度变化情况,计算。实验结果 见表。 表稳定性试验结果表 计算得.%,结果表明该项测定方法在小时内稳定性良好。贵阳中医学院硕士学位论文 ..重复性试验 精密吸取样品溶液.,按照样品含量的测定方法重复操作次,测定吸 光度,计算相对标准偏差,即可得到含量测定方法的重复性。结果见表。 表稳定性试验结果表 计算得.%,结果表明该测定方法重复性良好。 ..加样回收率试验 精密称取同一样品份,每份约. ,分别精密加入一定量的葡萄糖对照 品,按..项下样品液制备方法制各供试品溶液,测定条件同标准曲线项下, 测定吸光度,计算回收率及相对标准偏差%结果见表。 表回收率试验结果: .刺梨不同干燥条件优选 不同的方法将新鲜刺梨制备为干燥品会直接影响刺梨多糖的提取效果。为 此,本实验在优化刺梨多糖提取工艺前先对刺梨的干燥方法进行摸索,以多糖含 量为指标考察自然干燥、微波干燥、冷冻干燥、真空干燥等四种不同干燥方法, 以优选出最佳干燥方法。 ..自然干燥:取一定量刚采摘并切成片状的刺梨果肉,于室外阳光下自然干 燥,得到的刺梨干燥果肉经粉碎后过目筛,得自然干燥样品,保存至干燥器 中,备用。 贵阳中医学院硕士学位论文 ..微波干燥:取一定量刚采摘并切成片状的剌梨果肉,采用微波中低火干燥, 至有香气溢出时取出,经粉碎后过目筛,得微波干燥样品,保存至于燥器中, 备用。 ..冷冻干燥:取一定量刚采摘并切成片状的刺梨果肉,使用冷冻干燥器进行 干燥,得到的刺梨干燥果肉经粉碎后过目筛,得冷冻干燥样品,保 存至干燥 器中,备用。 ..真空干燥:取一定量刚采摘并切成片状的刺梨果肉,?条件下真空干燥, 得到的刺梨干燥果肉经粉碎后过目筛,得真空干燥样品,保存至干燥器中, 备用。 ..样品多糖含量的测定:分别取..、..、..、..项下不同方 法制备的过目筛的刺梨粗粉样品各,精密称定后置于圆底烧瓶中,用 %乙醇 加热回流提取小时,残渣用%乙醇洗涤次,继续用 蒸馏水 回流小时,过滤,再加蒸馏水皿回流小时,过滤,残渣 用 蒸馏水洗涤次,合并滤液,用 聚酰胺脱色分钟,置 ,备 容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度,精密吸取样品溶液.皿,定容至 比色管内,按标准曲线制作项操作测 用。精密吸取样品溶液吐,置于 定样品吸光度值,按下式计算样品中多糖含量:多糖含量%/× %。式中为供试液中葡萄糖的质量,为供试液中稀释因素,为换 算因子,为供试品重量。结果见表。 表不同干燥条件样品多糖含量情况 ..结果表结果显示,刺梨经过冷冻干燥法后得到的多糖含量有最高值, 真空干燥次之,自然干燥下的多糖含量稍低。冷冻干燥法及真空干燥法,虽然多 糖含量较高,但是干燥时间较长,且设备要求条件高,耗能;微波干燥虽然时间 较短,但干燥过程中,不容易观察刺梨的干燥程度;自然干燥法在干燥过程中也 容易观察刺梨的干燥程度,且节能环保,可降低生产成本,故选择适用于大工业 生产的自然干燥法,而弃去微波干燥法、真空干燥法和冷冻干燥法:贵阳中医学脘硕士学位论文 .刺梨不同采收期多糖含量的测定 不同的采收时间会直接影响刺梨多糖的提取效果。为此,本实验在优化刺梨 多糖提取工艺前先对刺梨的不同采收期进行摸索,方法是以多糖含量为考察指 标,对不同时间采收的刺梨样品进行测定,以优选出最佳的采收时间。 ..样品多奢蛤量的测定 分别称取月中旬、月底、月初经自然干燥条件下得到的刺梨粗粉,精 密称定后置于圆底烧瓶中,步骤同..项下方法进行样品多糖含量的测定,结 果见表。 表不同采收期剌梨样品多糖的含量测定 ..结果由表结果显示,不同采收期刺梨中多糖含量存在一定差异,其中 月底采摘的刺梨多糖含量有最高值,因此选用月底采摘的刺梨进行大工业生产。 .刺梨不同部位多糖含量测定 刺梨不同部位含多糖量是不同的,为了充分利用好资源,为此,本实验在优 ? 化刺梨多糖提取工艺前先对刺梨的不同部位进行测定,以多糖含量为指标考察, 对资源利用取得理论依据。 ..样品多糖含量测定 称取经自然干燥条件下已干燥并粉碎过目筛的刺梨果肉、全果、果蒂和 籽样品 ,操作步骤同..项下方法,含量测定结果见表。 贵阳中医学院硕士学位论文 表不同部位刺梨的多糖含量 ..结果由表结果显示,刺梨果肉中多糖含量最高,全果次之。 .结果 通过本次实验可得出:刺梨在经过冷冻干燥后刺梨多糖含量最高,含量达到 .%,而真空干燥次之,自然干燥含量最低,与最高值相差.%;采摘于 月中旬的刺梨多糖含量为.%,月底的刺梨多糖含量为.%,月初的刺 梨多糖含量为.%,结果说明了不同采收期刺梨的多糖含量是不同的,在 月底采摘的刺梨多糖含量较高;刺梨不同部位多糖含量是:果肉全果果蒂籽。 结论与讨论 在此实验时要保证硫酸和苯酚液的加入准确、反应时间和温度恒定,平行操 作,这样得出的实验结果才具有可比性、具有说服力。 此次实验得到刺梨在经过冷冻干燥条件下刺梨多糖含量最高,在经过自然干 燥后于月底采摘的刺梨中刺梨果肉多糖含量有最高值。 单从数据上看,从栽培刺梨中提取多糖,采用的最佳干燥条件应为冷冻干燥, 且刺梨最佳提取部位应为果肉,但从可操作性和工业生产上看,采用刺梨经过自 然干燥及使用全果较好,因冷冻干燥耗费大量时间,且成本较高,而对于刺梨全 果来说,其含量不仅与果肉接近,而且省去去籽及去蒂的繁琐操作,节省了时间 和劳动力,从而节约成本。贵阳中医学院硕士学位论文 第二章刺梨多糖的提取纯化及刺梨多糖铁的合成 实验材料 仪器紫外分光光度仪澳大利亚照生公司, ,分类号: :跚一数显恒温水浴锅;型电动沉淀离心机上海分析仪器厂; 一旋转蒸发仪;型真空干燥箱上海跃进医疗器械厂; 型循环水式多用真空泵;型磁力搅拌器型电子天平日本等。 试剂咒无水葡萄糖中国药品生物制品检定所,批号为; 牛血清白蛋白国药集团化学试剂有限公,批号为;考马斯亮蓝 国药集团化学试剂有限公司,批号为;木瓜蛋白酶;三氯乙酸,浓 硫酸、氯仿、苯酚、氯化钠、磷酸、丙酮、聚酰胺均为国产分析纯。 材料同第一章。 方法与结果 .刺梨粗多糖的制备 ..刺梨粉末的预处理称取采摘与龙里千家卡的栽培刺梨,除去果蒂及 籽,得到刺梨果肉,经自然干燥后粉碎过目筛,粉末置于索式提取 器中加入 石油醚进行脱脂,药渣挥干溶剂后,再加入%乙醇,置于索式提取器中, 提取约小时,药渣子水浴锅上挥干,得到粉末置于干燥器中放置备用。 ..刺梨粗多糖的提取取..项下经预处理样品粉末,加入十倍量蒸馏水, 摇匀后置于?恒温水浴锅中回流两次,每次一小时,取出抽滤,合并滤液, 条件下在旋转蒸发器上浓缩约为,再加入四倍体积的无水乙醇,溶液 立即浑浊,冰箱中静置过夜使沉淀完全。将沉淀离心,弃去上清液,得到沉淀, 放入冷冻干燥器中干燥,即得刺梨粗多糖。 .方法学考察 因本章节实验与第一章实验不在同一台仪器操作,因此再做方法学考察。 贵阳中医学院硕士学位论文 ..葡萄糖最大波长的测定 称取无水葡萄糖.,置容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,再从 ~ 。 一 ’ : 中取用蒸馏水定容至吐容量瓶巾;。得到浓度为:?.的溶液。 ~ 七色管中,加入. 取葡萄糖浓度为.?的溶液.予 。。 。,。 蒸馏水,再加入%苯酚.?,及.田.浓硫酸,摇匀,室温下放置分钟, 于 紫外分光光度仪上测最大吸收波长,结果在皿处有最大吸收,故 选择 作为测定波长。如下图。 /\ \ 、~ / / × ~ 玎. 吡习姒鼍, 圜. . . 啊. ,. 口,鼍置 .石? 呶口日目口日 口 ? 肿 图葡萄糖最大吸收波长 .一葡萄糖标准曲线的绘制 按照苯酚一浓硫酸显色方法测定多糖含量。分别精密量取葡萄糖 浓度为 .?的溶液.、.、.、.、.、.、.、.、., 于比色管中,依次加入蒸馏水使总体积为,再分别加入%苯酚.及 浓硫 酸.,摇匀,室温下放置分钟后于紫外分光光度仪上测出吸光度, 做出 标准曲线,为..:.,,为葡萄糖浓度 .‘: 为吸光度。结果表明在...范围内,标准葡萄糖浓度与吸收 度具有良好的线性关系。结果见表、图。 表标准曲线结果表 贵阳中医学院硕士学位论文 图表标题 . . 返. ?标准曲线 】 叶、 餐. 一线性标准曲线 . 浓度 图葡萄糖标准曲线 ..换算因数的测定 精密称取精制多糖.,置于容量瓶中,用蒸馏水溶解,定容至 刻度线,取..定容至容量瓶刻度线,摇匀,再从中取.溶液,加 入.%苯酚及.浓硫酸,摇匀,室温下放置分钟,紫外分光光度仪 上测吸光度,计算得到换算因素为.。 ..精密度试验 精密量取...。葡萄糖溶液,加入蒸馏水、.苯酚、 .浓硫酸,室温放置分钟,利用紫外分光光度计在.下依次测量 其吸光度。重复次,并把每次的实验结果进行记录,见表。 , 表精密度试验 计算得到%.%,表示仪器精密度良好。 ..稳定性试验 精密量取样品溶液,按照样品含量测定方法操作,每隔分钟测定 一次吸 光度,共测次,实验结果见表。 表稳定性试验贵阳中医学院硕士学位论文 计算的胙.%,表示该测定方法在内稳定性良好。 ..重复性试验 按照样品含量测定方法重复操作次,测定吸光度,计算值,见表. 表重复性试验 计算得%.,表示该测定方法重复性较好。 ..加样回收试验 精密称取同一样品份,每份约. ,分别精密加入一定量的葡萄糖 对 照品,按样品液溶的制备方法制备供试品溶液,按照标准曲线项 下的相同测定条 件操作,测定吸光度,计算回收率及相对标准偏差。结果见轰. 表加样回收试验两 样号样品量多糖含量?加入标品量?测得量%回收率%平均值%% .刺梨粗多糖提取方法优选 ..水提法 取..项下经预处理样品粉末加入倍量蒸馏水,煮沸.小时,四 层纱布过滤,煎煮次,合并滤液,/离心分钟,上清液加入倍 量%乙醇沉淀/离心分钟,弃去上清液,沉淀再加入%乙醇至 浓度为/离心分钟,弃去上清液,沉淀加丙酮洗涤两次,抽滤, 沉淀于。真空干燥。即得样品粗多糖,研细备用。 贵阳中医学院硕士学位论文 .. 提取法 取..项下经预处理样品粉末加入倍量溶液浓度为.%, 煮沸.小时,四层纱布过滤,煎煮次,合并滤液,滤液加醋酸调节 为. 左右,/离心分钟,上清液加入倍量%乙醇沉淀,/离 心分钟,弃去上清液,沉淀再加入%乙醇至浓度为%,/离心 分钟,弃去上清液,沉淀加丙酮洗涤两次,抽滤,沉淀于?真空干燥。即得样 品粗多糖,研细备用。 ..粗多糖含量测定 平行操作..、..项下方法三次,每次操作所得样品分别在样品袋上 标记为水提法号、号、号,提取法号、号、号,对以上粗多糖 样品进行含量测定。 样品溶液的配制:取前步操作得到的粗多糖样品各.,精密称定,蒸 馏水溶解,定容至容量瓶中,取定容至容量瓶中,即得待测的粗 多糖样品溶液。 分别取以上样品溶液各,分别加入蒸馏水、.苯酚、.浓 硫酸,室温放置分钟,用紫外分光光度计测各自的吸光度,读取六个相近的 吸光度,得到结果见表。 表不同多糖提取方法结果比较表 ..结果 由表可看出,水提法得到多糖含量及多糖得率均高于提取法,水提 法中多糖含量最高值达到了.%,高于提取法的最高值.%,且粗多 糖得率水提法明显高于提取法。从工业生产角度来说,提取法不仅需要 配制一定浓度的溶液,且在提取过程中还要调节等过程,方法较繁琐, 而水提法用的蒸馏水不用调节浓度及,因此选取水提法做正交实验。贵阳中医学院硕士学位论文 .粗多糖水提法正交实验 正交表设计如下: 表正交实验设计表 因素 水平 提取间/ 提取次数 加水量/倍 .由.处理数据,以多糖含量为指标进行数据处理得到下表: 表提取工艺正交实验结果表 表正交结果分析表??????????’????????????????????? ????????? 方差分析型平方和 自由度 方差 值值 ..正交结果 由表分析可看出,值.,即实验无显著性,又根据正交实验结果 表,多糖含量均没有与提取法做对拢时含量高,因此选择在做两 种方法对比 『 .『 后,选择水提法的步骤进行粗多糖的提取,即提取次,每次加倍量蒸馏水, 提取.小时。 贵阳中医学院硕士学位论文 ..验证实验 平行称取样品粉末三份,分别置于烧杯中,烧杯编号分别为、、, 按照..项下最佳提取工艺方法提取粗多糖,得率及多糖含量见表。 表验证实验结果表 由上表可知,该提取方法效果较好,方法可行性高。 .脱色工艺研究 刺梨中不仅含有大量多糖,还有色素及蛋白质等物质,因此为了纯化多糖, 对多糖进行脱色工艺研究,以优化刺梨多糖的提取工艺。 ..脱色率及多糖保留率的测定及计算 将刺梨粗多糖溶液在一波长范围内进行全波长扫描,以确定最大 吸收峰,因在此波段多糖溶液无最大吸收峰,根据多糖溶液在脱色前后颜色均为 橙黄色,由颜色互补原理取为最大吸收波长。测定..项下溶液的 吸光 度,按下式计算脱色率。 脱色瓤堕罨勰湍警×% 按照多糖测定方法,即苯酚一浓硫酸法进行多糖含量的测定,按下式进行计 算多糖保留率。 多糖船率%黼×% ..脱色素方法考察 ...刺梨粗多糖样品溶液的配制 称取刺梨粗多糖样品.,配制成.?的溶液,放置,备用。 ..?树脂吸附法贵阳中医学院硕士学位论文 树脂的预处理:取一定量未经处理的阳离子型吸附树脂,用与其等体 积的饱和食盐水浸泡~小时,放尽食盐水,用清水漂洗净,使排出水不带 黄色,再用与树脂等体积%氢氧化钠浸泡~小时,放尽碱液,用蒸馏水 作小流量清洗,直至排出水接近中性为止,最后用与树脂等体积的%盐酸溶液 浸泡树脂~小时,清水漂至中性即可。 树脂吸附法:取 ...项下样品液,加入已预处理的树脂, 搅拌,静置过夜后过滤,滤液定容至容量瓶中,即得经树脂吸附法脱 色的样品液,测其吸光度,计算多糖保留率和脱色率。试验结果见表。 ...活性炭粉末动态吸附 取活性炭粉末.,装入柱中,将...项下样品溶液缓慢过柱, 收集滤液,定容至.容量瓶中,即得经活性炭粉末动态吸附脱色的样品液, 测其吸光度,计算多糖保留率及脱色率。 ...活性炭粉末静态吸附 取 ...项下样品溶液,加入.活性炭粉末,摇匀后于水浴 ?下静置,抽滤,滤液定容至容量瓶中,即得经活性炭粉末静态吸附 脱色的样品液,测其吸光度,计算多糖保留率及脱色率。试验结果见表。 。...活性炭颗粒静态吸附 取...项下样品溶液,加入.活性炭颗粒,摇匀后于水浴 ?下静置 ,抽滤,滤液定容至容量瓶中,即得经活性炭颗粒静态吸附 脱色的样品液,测其吸光度,计算多糖保留率及脱色率。试验结果见表。 ...聚酰胺静态吸附 取...项下样品溶液,加入聚酰胺.,摇匀后静置,过滤, 滤液定容至容量瓶,即得经聚酰胺静态吸附脱色的样品液,测其吸光度, 计算多糖保留率及脱色率。试验结果见表。 ..结果 将..项下各样品溶液测得的吸光度进行计算,得到多糖保留率及脱色 率,结果见表。贵阳中医学院硕士学位论文 表几种脱色方法结果表 注:综合指标%多糖保留率×.脱色率×. 由上表可得,活性炭粉末动态吸附法综合指标有最大值,但多糖保留效果较 差,不宜考虑;树脂吸附法,虽综合指标值相对较高,但树脂预处理较 麻烦,也不宜考虑;而聚酰胺法多糖保留率有最大值,且脱色率也较高,因此优 选聚酰胺进行脱色。 .聚酰胺脱色单因素考察 ..粗多糖溶液浓度考察 精密移取浓度为?的粗多糖溶液.、.、.、.、.至瓶 ~号内,分别加蒸馏水使总体积为。测其吸光度,计算得到脱色前 多糖含 量及脱色前吸光度。重复操作上述方法,分别精密移取浓度为?的粗多 糖溶液.、.、.、.、.,至已标号的’’号瓶内,分别加蒸馏 水使总体积为,再按药脂比粗多糖量?/树脂量相等的加入 聚酰胺,常温静置,滤过,收集滤液,测其吸光度,计算得到脱色后多糖含 量及吸光度,按..项下公式计算脱色率。结果见表图。 表粗多糖浓度考察结果表贵阳中医学院硕士学位论文 图多糖溶液浓度考察图 由表及图可得出,粗多糖溶液浓度在.??。时综合指标达到最 高值。 ..药脂比考察 配制浓度为.?的粗多糖溶液适量,测定脱色前吸光度:精密移 取粗多糖溶液适量份,分别置于容量瓶中,按药脂比粗多糖量/ 树脂量为、、、、、、,分别加入聚酰胺;静置小时, 滤过,收集滤液,测定,得,按..项下公式计算脱色率。结果见表、 图。 表药脂比考察结果表 以综合指标%为纵坐标,药脂比为横坐标作图:贵阳中医学院硕士学位论文 图药脂比考察结果图 结果分析:由表及图可得出,在药脂比为之时,有较好的脱色效果。 ..脱色时间考察 分别取粗多糖浓度为. ?溶液于锥形瓶中,测定脱色前吸光度 :按药脂比加入聚酰胺,静置、、、、、小时后滤过,收集滤液,测 定,按式.及.项下公式计算脱色率。结果见表、图。 表脱色时间考察结果表 图脱色时间结果分析图贵阳中医学院硕士,学位论文 ..结论 由数据分析可知脱色最佳工艺为:粗多糖最佳脱色浓度为.?『药 脂比粗多糖量树脂量比值为,脱色时间小时,脱色效果最好。 .除蛋白工艺研究 为纯化刺梨多糖,因此要对刺梨中蛋白质进行含量测定,并考察其去除方法。 本实验采用考马斯亮蓝比色法对蛋白质含量进行测定。该方法可大大地提 高蛋白质的测定灵敏度,适合于蛋白质类的定量分析,尤其适合于刺梨中蛋白质 的微量分析。 ..方法学考察 ...蛋白质最大吸收波长的确定 首先称取牛血清白蛋白.,置量瓶中,加.%氯化钠溶解后稀释 至刻度制成质量浓度为. ?蛋白质标准溶液。其次精密量取..% 氯化钠,.考马斯亮蓝染液,混匀,静置后进行基线扫描。然后量取 质 量浓度为. ?。蛋白质标准溶液.,加入.考马斯亮蓝染液进行最 大吸收波长扫描,结果显示蛋白质最大吸收波长为时,有最大吸 光度,且 与浓度成正比。 ,一 卜 弋 、\ 。 / 、、、 ?? ? ?,一一 磷 . . . . . . ... .融 . . . . . . . . .眦 帆 图蛋白质最大吸收波长扫描图 ...蛋白质标准曲线的制备 从质量浓度为. ?蛋白质标准溶液中分别吸取贮备液.、.、.、 。 .、.;、.、.、.、. 置于具塞试管中,各分别加.%氯化钠稀 贵阳中医学院硕士学位论文 释至.,再向各管中加入.?的考马斯亮蓝一溶液,另取.氯化钠 .和.考马斯亮蓝溶液作为空白试剂,混匀,静置分钟后于 波长处测吸光度值。以吸光度为纵坐标,牛血清白蛋白质量浓度 为横坐 标,得回归方程为..,相关系数.表明牛血清白蛋白 在. .’. .。呈良好的线性关系。 图蛋白质标准曲线图 ..精密度试验 精密吸取. ?.蛋白质标准溶液.,加.的考马斯亮蓝染液, 混匀、静置分钟,以..%和.?的考马斯亮蓝染液为空白试剂利用 紫外分光光度计于处依次测定其吸光度,重复次,并把每次的实 验结果进 行记录,见表 表精密度试验 计算得到.%,%%,表示仪器精密度良好。 ...稳定性试验 精密吸取供试品.?多糖溶液.,加.考马斯亮蓝染液,混匀、 .%和.珂的考马斯亮蓝染液为空白试剂。利用紫外 静置,以. 分光光度计于处每隔分钟测定其吸光度,共测次结果,见表. 表稳定性试验 计算的. %,表示该测定方法在内稳定性良好。贵阳中医学院硕士 学位。论文 ...重复性试验 精密吸取供试品. ?。多糖溶液.,份,各分别加.考马斯亮 蓝染液,混匀、静置分钟,以.吐.喻和.的考马斯亮蓝染液为空白 试剂。利用紫外分光光度计于硼处澍定其吸光度,结果见表 表重复性试验 计算得%.%,表示该测定方法重复性较好。 ...加样回收试验 精密称取同一样品份,每份约. ,分别精密加入一定量的牛血清 白 蛋白对照品,按样品液的制备方法制备供试品溶液,测定方法同 标准曲线项下, 测定吸光度,计算回收率及相对标准偏差%。结果见表 表加样回收试验 样品平均回收率为.%,为.%,表明本法可行。 ...刺梨样品中蛋白质的含量测定 精密量取样品溶液.,加.%氯化钠.和考马斯亮蓝贮备液.,. 另取..%氯化钠和.:考马斯亮蓝贮备液为空白试剂,振摇,静置分 钟 后在 波长处测定吸光度值,代入方程..求出相应的蛋白 浓度。结果见表.贵阳中医学院硕士学位论文 结果:刺梨样品中含蛋白质平均浓度为.?。 ..确定综合指标 采用蛋白质清除率和多糖损失率各占%作为综合指标进行考察。 计算公式 分别为: 蛋白质清除率%堕堡皇堂堕篆墨菩需型蓍篆甓呈掣% % 多糖损失率%塑量皇堂焉翥墓霁毳轰磊舄产 综合指标%蛋白质清除率%×.多糖损失率%×. ..刺梨多糖除蛋白工艺优选 ...刺梨粗多糖溶液的配制 取..项下制得刺梨粗多糖.,用蒸馏水溶解并定容至,配置 份质量浓度为. ?刺梨粗多糖水溶液,放置备用。 ... 法 先取.的刺梨粗多糖水溶液,根据药脂比为加入聚酰胺.进行刺 梨粗多糖溶液脱色后,过滤,定容至。在按照刺梨粗多糖水溶液与 氯仿: 正丁醇:混合试剂的体积比为:加入氯仿与正丁醇,振摇分钟,离心、 过滤,定容至测定其多糖和蛋白质含量。 ...三氯乙酸法 先取.的剌梨粗多糖水溶液,根据药脂比为加入聚酰胺.进行刺 梨粗多糖溶液脱色时后,过滤,定容至.。在按照刺梨粗多糖水溶液与三 氯乙酸体积比为:加人一定量的%氯乙酸,振摇分钟,过滤,定容至。贵阳中医学院硕士学位论文 测定其多糖和蛋白质含量。 ...木瓜蛋白酶法 先取.的刺梨粗多糖水溶液,根据药脂比为加入聚酰胺.盈进行刺 梨粗多糖溶液脱色小时后,过滤,取滤液根据脱色后的多糖溶液体积与加入的 木瓜蛋白酶质量的比为:,向其中加入相对应木瓜蛋白酶后,调节为.,在 的水浴中反应小时,待反应完全后,水浴灭酶分钟,离心,定容至, 测定其多糖和蛋白质的含量。 ..结果 表除蛋白方法优选结果 由表可得出,在种除蛋白的方法中,法效率低,并且需要大量的 有机试剂,在浓缩时消耗时间较长。三氯乙酸法除蛋白效率较高, 但是由于三氯 乙酸的酸性较强,容易导致多糖的降解,所以控制好三氯乙酸的浓度尤为重要。 木瓜蛋白酶本身就是一种蛋白质,不容易杀灭完全,并且在采用苯酚一浓硫酸法 测定多糖含量时,容易被浓硫酸碳化变黑。 .三氯乙酸法除蛋白工艺优化 ..正交试验设计 根据文献资料及预实验结果,选取三氯乙酸的浓度、三氯乙酸的用量、振摇 时间为考察因素,每个因素选择个考察水平,进行正交试验,以多糖量保 留率和蛋白质清除率为指标,优选三氯乙酸除蛋白的工艺,因素水平见表。 表正交试验的因素与水平贵阳中医学院硕士学位论文 ..正交试验 准确称取刺梨粗多糖.,加蒸馏水溶解并定容置的容量瓶中,倒入 .‖ 烧杯中加入.聚酰胺进行脱色小时后,过滤定容至。然后精密量取 份刺梨粗多糖各于具塞试管中,按照正交试验安排进行刺梨粗多糖除蛋 测定各实验刺梨多糖溶液中多糖保留率和蛋白质清除率,以综合 评分综合评分 多糖保留率 %蛋白质清除率×%为指标,试验安排及试验结果见表 及表。 表 ‘正交试验及试验结果 ..正交试验结果分析 从上述实验结果分析表明,因素三氯乙酸浓度对刺梨除蛋白有显著性的影 响,而因素三氯乙酸用量及振摇时间对实验结果影响不是很显著。从试验的结 果可以得出。。最佳,其次是肘泌。方案,最后是。方案,但是从 贵阳中医学院硕士学位论文 最初预实验可以得出方案。:.要消耗大量的试剂,并且预实验中刺梨多糖体 积与三氯乙酸体积比为:。又从综合指标来看,邶;。方案的综合评分为 .%,但是多糖保留率紧为.%,过低。,方案的综合评分为.%与 邶。。方案相差不大且多糖保留率为.%比.%要大,且罱的试剂量最少。 综合各种因素分析,除刺梨中蛋白质的最佳方案为,。 ..验证试验 称取的刺梨粉末三份,分别放入三个烧杯中加入其倍量的蒸馏水煮沸 .小时后,用四层纱布过滤,重复上述过程次。将浓缩滤液至后,加入 .的蒸馏水和的聚酰胺,搅拌、静置小时进行脱色后,离分钟, 抽滤,得到的滤液,按照。的方案加入一定量的%三氯乙酸,振摇分钟, 离心、过滤,再进行浓缩。得到的溶液向其中加入其体积倍量%的乙醇进行醇 沉,得到的沉淀用丙酮洗涤数次,抽滤,真空干燥,称定质量。从上述干燥除蛋 白的多糖中分别称取三份刺梨多糖,用蒸馏水溶解并定容至,得到 .?的多糖溶液,分别从中取,加蒸馏水,的%苯酚,浓硫 酸,混匀、静置分钟于波长下分别测其多糖浓度,结果见表。 表刺梨除蛋白质后多糖的浓度 结果测得的多糖含量与正交实验结果相比较好。 ..结果 多糖常用的除蛋白方法有法、三氯乙酸法、酶法等但它们并不能彻 底去除蛋白质,只能部分除去游离的蛋白质,这些方法在不同程度上都会造成多 糖一蛋白复合物的损失,还可能影响到多糖的得率或活性。本实验通过比较筛选 出了刺梨多糖除蛋白的优选工艺为:以/倍量的%氯乙酸溶液,振摇 离 测得的蛋白质清除率为.%,多糖保留率为.%,综合评分.%。贵阳中医学院硕士学位论文 .刺梨多糖铁的合成 ..实验材料 仪器紫外分光光度仪澳大利亚照生公司, ,“分类号: ;数显恒温水浴锅;型电动沉淀离心机上海分析仪器厂: 一旋转蒸发仪;卜型真空干燥箱上海跃进医疗器械厂;? 型循环水式多用真空泵;型磁力搅拌器型电子天平日本等。 试剂硫酸亚铁铵;邻菲罗啉;抗坏血酸;氢氧化钠;三氯化铁等 材料刺梨采摘于贵州龙里千家卡栽培刺梨基地,经贵阳中医学院王世青 教授鉴定为蔷薇科蔷薇属刺梨干燥果实。 ..刺梨多糖铁的制备 称取精制多糖.,溶解于蒸馏水中,加入柠檬酸三钠.,置磁力 搅拌器上水浴溶解,在不断搅拌过程中,先滴加%氢氧化钠溶液调节, 然后缓缓加入?三氯化铁溶液,控制二者滴加速度和滴加量,使一直 保持在左右,至溶液中出现不再溶解的沉淀时停止滴加,继续搅 拌反应小时, 反应结束后离心,上清液加入无水乙醇,静置过夜,抽滤,得到滤 渣于真空下 烘干,得到固体即为刺梨多糖铁。 ..方法学考察 ...最大吸收波长的确定 铁?标准溶液的配制:称取.硫酸亚铁铵溶于蒸馏水,并移至 容量瓶中,加.盐酸,用水定容至刻度即得铁?标准溶液,其含 铁量为 .一,备用。 精密吸取铁?标准溶液.,浓度为.‘的刺梨多糖铁溶液 .,分别置于比色管中,再分别加入%抗坏血酸.,.%邻菲罗 啉显色剂.,加水稀释至摇匀。常温下放置,分别于~贵阳中医学院 硕士学位论文 处以试剂溶液为空白进行测定,测定结果如图和图所示: ‖ \ / / \ / 』 / ? 萄? ? ? ? ?? ? ?.. ? 四 . ? 。。图铁标准溶 液最大吸收波长扫描图? ? ? ?. 柏 ? 扣 ? 图刺梨多糖铁溶液最大吸收波长扫描图 标液和样液两个结果对比一致,均在处有最大吸收,故选为 测定波长。 ...绘制标准曲线 精密移取.、.、.、.、.、.铁标准溶液于个 比色管中,分别加入%抗坏血酸.,.%邻菲罗啉显色剂.,加水稀 释至刻度摇匀。常温下放置,以试剂溶液为空白,于处测定 溶液吸光度。见表。 表标准曲线结果表 以铁?浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,结果如下 图 所示:贵阳中医学院硕士学位论文 图铁?标准溶液标准曲线图 结果:得到回归方程为:..,.。 ...精密度试验 精密吸取样品多糖铁溶液.,各份,每份加入到比色管中,再 分别加入%抗坏血酸.,.%邻菲哕琳.,蒸馏水稀释至。摇匀 室温下反应,在处测定吸光度。结果见下表。 表精密度试验结果表 结果得到%.%,表明仪器精密度良好。 ...稳定性试验 精密吸取样品多糖铁溶液.,置于比色管中,加入%抗坏血酸 .,.%邻菲哕琳.,蒸馏水稀释至。摇匀室温下反应后每 测一次吸光度,在处测定吸光度。结果见下表。 表稳定性试验 结果得到%.%,表明仪器在后达到稳定。 ...重复性试验 精密称取样品多糖铁份,将个样品定容于容量瓶中,得到的多糖 铁溶液,备用。分别各自从中取,分别依次加入%抗坏血酸.,贵阳 中医学院硕士学位论文 . . . . . . 样品/ . . . . . . .% .% 慨 .% .% .% .% 结果得到%:.%,说明此方法可行。 .:.加样回收试验 精密称取已知含量为.%的样品,分别按一定比例精密加入与其含 铁量 有一定比例的铁?标准储备液,按照溶液的制备方法制备供试液,按照样品 含量测定项的相同条件下,测定吸光度,计算回收率。结果见下表。 表加样回收试验 ..刺梨多糖铁中铁含量的测定 精密称取多糖铁样品.,加蒸馏水定溶于容量瓶中待用,平行 份样,分别各自从.中取,分别依次加入%抗坏血酸.,.%邻菲。 哆琳.,蒸馏水稀释至刻度线。放置小时,在.处测定吸光度。 结果下表。