大鼠无血预充体外循环伴心脏停跳模型的建立

大鼠无血预充体外循环伴心脏停跳模型的建立 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 大鼠无血预充体外循环伴心脏停跳模型 的建立 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 作者,宋丹丹,高光洁,孙莹杰,张铁铮,周锦,张瑜,姚婧 【摘要】 目的 摸索建立大鼠无血预充体外循环伴心脏停跳模型的实验方法。 方法 以雄性SD大鼠为实验动物,经右颈静脉引流、右股动脉灌注建立体外循环模型。采用6%羟乙基淀粉进行无血预充,经右颈动脉穿刺置入冷灌管至主动脉根部,正中劈胸骨,阻断主动脉,灌注心脏停搏液使心脏停跳,15 min后开放主动脉,心脏自主复跳,体外循环1 h后停转流。停转流2 h后大鼠血压心率稳定视为模型成功。结果 模型死亡率5%(2/40只)。心脏自主复跳成功率为94.7%(36/38只)。34只顺利停转流,模型成功率85%。结论 本实验建立的无血预充大鼠体外循环伴心脏停跳模型,操作简单,费用低廉,成功率较高,是研究体外循环期间全身炎症反应、脏器保护机制及评估相关保护措施的良好实验工具。 【关键词】 大鼠;体外循环;心脏停跳;无血预充;动物模型 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 Establishment of a Rat Model of Cardiopulmonary Bypass withCardioplegic Arrest Primed without Blood Abstract: OBJECTIVE To establish a rat model of the cardiopulmonary bypass (CPB) with cardioplegic arrest primed without blood. METHODS Adult male Sprague-Dawley rats (400, 500g, n = 40) were used for all experiments. Blood was drained from the right atrium via jugular vein catheter into the CPB circuit and return to the right femoral artery. The miniature cardiopulmonary bypass was primed with 6% hetastarch without blood. A catheter through the right carotid artery was inserted into the aortic root for administration of cardioplegic solution. After median sternotomy aortic arch was clamped. Cardioplegic arrest was accomplished by a cardioplegic solution. After 15 min of cardioplegia, the aortic cross-clamping was released. CPB was weaned after 1 hr. It is a validation criteria of the animal model that the arterial blood pressure and heart rate of rats were stable at 2 hrs post CPB. RESULTS Mortality rate was 5 percent. The rate of heart spontaneous re-beating was 94.7 percent. Blood pressure and heart rate were stable in 34 of 40 rats at 2 hrs post CPB. Success rate of model was 85 percent. CONCLUSION The rat model of CPB with cardioplegic arrest primed without blood is easy to be performed with low cost and higher success rate. This model DOC格式论文,方便您的复制修改删减 is suitable for the investigation of the pathophysiological changes concerning CPB-related multiple organ dysfunction and possible protective interventions. Key words, Rat; Cardiopulmonary Bypass; Cardioplegic arrest; Primed without Blood; Animal Models 体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)可引起全身性炎症反 应、心肺缺血再灌注损伤,严重影响心血管手术成功及预后,一直是 心脏外科关注的热点。以往研究多应用并行循环建立大鼠CPB模型 [1-3],CPB期间心脏无停跳复跳过程,与临床实际有很大差距。本 实验旨在建立一种简单实用、价格便宜的大鼠CPB伴心脏停跳模型, 为研究CPB期间脏器损伤、全身炎症反应机制及评估相关保护措施 提供实验工具。 1 材料与方法 1.1 实验材料 健康成年雄性清洁级SD大鼠40只,体重400, 500 g,由沈阳军区总医院动物实验科提供。小动物呼吸机(江西省特 力麻醉呼吸设备公司,TKR-200C型),恒流蠕动泵(保定兰格恒流泵 有限公司,BT00-300M型),大鼠专用膜式氧合器(表面积0.05 m2, 预充液3 ml,广东科威医疗器械有限公司),配套硅胶泵管(内径4 mm)及管道,多功能监测仪(日本光电公司),全自动温血仪(美国BIGGER公司),心脏停搏液(冷灌液),HTK溶液(商品名,康斯特HTK溶液, 德国克勒化学制药),一次性静脉套管针(美国BD公司)。 1.2 麻醉方法 10%水合氯醛300 mg/kg、阿托品30μg/ kg腹 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 腔内注射,透光法气管插管(16G套管针)接小动物呼吸机行机械通气(FiO2=1.0),潮气量3 ml/100g,频率60次/min,吸呼比1?1.5,气道峰压9.0 cmH2O。麻醉维持采用间断腹腔注射水合氯醛,静脉注射哌库溴铵0.1 mg/kg。 1.3 CPB方法 ? CPB建立,经右颈静脉腔房引流,右股动脉灌注方法建立大鼠CPB模型。? CPB各部分,主要由静脉引流管、贮血器、恒流蠕动泵、膜式氧合器(膜肺)、动脉输注管、温血仪及滤器组成。贮血器由10 ml注射器制成,安装于蠕动泵前,低于大鼠心脏水平约40 cm,由内径4 mm的硅胶管道与静脉引流管连接,有助于血液重力引流。膜肺安装于泵后,通过管道经过温血仪与右股动脉灌注端连接,贮血器与膜肺之间有管道连接,有助于CPB开始前排出气泡。? 预充液,采用无血预充15 ml,由6%羟乙基淀粉12 ml、5%碳酸氢钠2 ml、20%甘露醇1 ml及肝素钠150 IU/kg组成。? 心脏停搏液(冷灌液),4 ? HTK溶液。 1.4 手术方法 左股静脉穿刺(22G套管针)建立静脉通路,通过微量输液泵输注6?羟乙基淀粉0.5 ml/h;经尾动脉穿刺(24G套管针)通过压力传感器连接于监测仪,实时监测动脉压;右股动脉穿刺(22G套管针),CPB灌注备用;右颈动脉穿刺置管(20G套管针)至主动脉内,冷灌备用;右颈动脉穿刺成功后经静脉给予肝素钠300 IU/?;右颈静脉穿刺置入腔房引流管(18G套管针,头端多孔),测ACT 400,500 s,建立CPB。正中劈开胸骨,切除胸腺,主动脉根部套带(7号丝线,升主动脉阻断备用),同时直肠温降至34 ?,用动脉夹阻断主动脉, DOC格式论文,方便您的复制修改删减 4 ? HTK溶液0.5 ml,10,15 s内注入主动脉根部。心电图示电活动时追加,灌注量为首次剂量的1/2。开放前5 min应用温血仪及加热灯进行复温,复温至36 ?时开放主动脉,自主复跳,逐层关胸。复温至37 ?,CPB辅助维持1h后停转流。CPB示意图见图1。 图1 大鼠CPB示意图 1.5 术中管理 CPB开始时流量35 ml/(kg?min),逐渐增加至100,120 ml/(kg?min);维持贮血器中血液量1,2 ml。CPB开始后停用呼吸机,氧合器供氧(FiO2=1.0)。α稳态血气管理,根据血气分析调整用药,维持MAP60 mmHg(1mmHg=0.133 kPa),pH值7.35,7.45,PaCO2 35,45 mmHg,碱剩余(BE),-3,3 mmol/L。CPB 1 h后,恢复机械通气。红细胞比容(Hct)达0.25以上,逐步减流量并停机。依次拔除心脏内各管道,持续机械通气,维持直肠温36.5 ?,37.5 ?之间。缓慢输注贮血器中的余血,根据情况给予适量多巴胺或补血补液,维持循环稳定。根据足底反射实验监测麻醉深度,必要时腹腔注射10%水合氯醛150 mg/kg。 1.6 监测指标 大鼠四肢连接心电图导联,接多功能监测仪行心电监测,直肠温探头插入肛门2 cm行直肠体温(RT)监测。尾动脉置24G套管针,通过压力传感器连接于监测仪,实时监测动脉压。术中各时点采动脉血0.1 ml行血气分析,CPB开始前(T0)、阻断主动脉(T1)、开放主动脉(T2)、停CPB后(T3)及停CPB后2 h(T4)。血气分析造成的失血量由相当体积的6?羟乙基淀粉补充。 1.7统计学处理 所有数据以均数?标准差( ?s)表示。采用 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 SPSS 13.0统计软件行统计学处理,各时间点与基础值,T0,之间采用独立样本t 检验进行比较。P0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 大鼠CPB停止后血压、心率稳定2 h视为存活表1 大鼠各时点MAP、HR、直肠温及血气分析注,与T0比较*P0.05 模型成功。本研究40只大鼠,均顺利建立CPB,2只因开胸后出血导致死亡。其余38只大鼠中有36只自动复跳,成功率为94.7%。2只未能自动复跳,给予少量肾上腺素,直视下心脏按摩后均自行复跳。34只顺利停机,成功率85%。各时点MAP、HR、直肠温及血气分析见表1。MAP在CPB开始后明显下降,P0.05,,停CPB 2 h后恢复原来水平;HR在开放主动脉时降低,P0.05,,很快恢复;PaCO2和PaO2在CPB前后维持稳定,与T0时点比较差异无统计学意义,P0.05,;Hct在CPB开始后由于血液稀释明显下降(P0.05,;pH值在转流后保持稳定。血K+水平在CPB期间保持稳定。这些变化过程与临床实践基本相符。 3 讨 论 良好的体外循环动物模型是研究CPB脏器损伤机制及评价各种保护措施不可缺少的实验工具。本模型具有以下特点,? 目前CPB伴心脏停跳动物模型主要采用猪、狗[4-5]等大动物,存在着一些不足之处,这些动物没有纯系,个体差异大,实验费用大、需要多科室人员合作,不便于大样本研究。鉴于大鼠的心血管系统解剖及主要生理指标与人体相似,且具有种系纯、个体差异小、价格便宜、易 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 于操作、便于检测、可以增强实验的准确性和可信性等优点,被公认为研究CPB脏器损伤的理想对象。? 心脏停跳、复跳模型完全贴近临床,此模型国内未见报道。在主动脉阻断期间,心肺血流被阻断,存在缺血缺氧现象。当主动脉开放后,心脏和肺脏再次灌注体循环血,大量白细胞被扣押在肺脏和心肌的微血管床内,这些白细胞与炎性物质相互影响,释放出氧自由基等毒性物质,不但导致缺血脏器的损伤并加剧全身炎症反应。以往研究大鼠心脏停跳复跳模型多为离体实验,主要依赖于离体心脏Langendorff模型[6-7]。然而,此模型与临床实际相差太多,研究范围受限。Gourlay等[1,8]建立的大鼠CPB模型为并行循环,不进行心脏停跳复跳,使CPB期间心肺损伤研究受限。? 无血预充,避免异体血液对机体造成危害,可以更好地消除异体血液预充对实验结果的影响。? 预充量小,采用特制膜肺与体外循环管道,预充量仅15 ml,不超过正常大鼠全身血容量(70 ml/kg)的1/2,使转流流量达到了正常大鼠的心排血量(50 ml/min)。较小的预充量还可以缩短体外循环管道,避免了CPB期间过度血液稀释,减少血液与人工管道接触,减少炎症反应。CPB期间血液与人工管道接触,使血浆蛋白被吸附于人工材料表面,激活体液成分和细胞成分,分泌大量炎性介质,引起全身炎症反应。? 简单方便,价格低廉,便于推广。Fellery等[9]通过颈静脉置入带球囊导管进行阻断主动脉和冷灌,置入后需超声定位,压力泵注气充气囊,所需设备复杂,费用高、操作难度大,且存在潜在风险,如导管置入过深,气囊充气后可损伤主动脉瓣或左心室;导管过浅,则可造成头臂干内膜撕裂, DOC格式论文,方便您的复制修改删减 很难广泛推广应用。? 心脏停搏液为HTK溶液,国内外首次应用于大鼠CPB模型,以往研究多采用高钾停搏液[9-10]。本实验结果表明,0.5 ml HTK溶液冷灌后心脏停跳及自主复跳效果好。仅2只大鼠需要追加1次,自主复跳率为94.7%。CPB期间电解质稳定。目前我国普遍使用的停搏液是高钾去极化停搏液,主要是ST.Thomas -?液(K+ = 20 mmol/L)。但有研究[11]显示高钾停搏液使心肌易发生钠超载、钙超载,高钾可导致血管内皮细胞和血管的自主调节功能受损,加重心肌损伤。HTK溶液是基于高钾停搏液研制的相对低钾的停搏液(K+ = 9 mmol/L),同时调整了胶体渗透压和缓冲对,心肌保护效果肯定,是目前临床长时间心脏手术和小儿心脏手术最佳的心脏停搏液。? 该模型可复合应用不同动物模型,如原有疾病(老年、糖尿病、高血压、肺高压)研究,CPB后的相应的病理生理变化及器官损伤程度,还可转染不同载体行基因治疗。 本模型成功经验与注意事项,? 颈静脉引流通畅是CPB成功的前提,颈静脉引流管头端多孔利于引流,一般达右房水平引流效果最好。颈静脉壁很薄,穿刺过程中忌用暴力,也不可插入过深,以防刺破心脏、静脉窦或下腔静脉造成心包填塞。? 开胸位置,第二肋水平,正中劈开胸骨,可用骨蜡及电刀止血。大鼠血容量占体重的7%,避免因出血过多导致实验失败,此步骤要求熟悉大鼠解剖并经过预实验反复多次练习。? 冷灌管位置非常重要,是实现心脏顺利停跳与自主复跳的关键。开胸后游离主动脉时可直视下适当调整冷灌管尖端位置,将其置于主动脉根部,不可伤及主动脉瓣。此外,阻断 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 主动脉要确切。本实验中2只大鼠心脏未能自主复跳,原因可能为阻断不完全,阻断过程中一直有心电活动。? 心脏停搏液输注速度,4 ? HTK溶液0.5 ml,10,15 s内注入主动脉根部。速度不宜过快,否则可造成心脏过度充盈,心肌损伤。?温度控制,CPB开始,大鼠血液迅速被引流至体外循环管道,通过降低室温、局部酒精擦浴很快使大鼠直肠温降至34 ?,此时阻断主动脉,立即用4 ? HTK溶液冷灌,心脏停跳。主动脉开放前5 min,通过提高室温,使用温血仪、100W加热灯及热水袋复温,使直肠温缓慢升至36?,开放主动脉阻断钳,心脏复跳。? 转流过程中根据血气分析及时纠正酸碱平衡和电解质异常变化,必要时应用血管活性药来保证循环的相对稳定。? 关胸前,彻底止血,逐层关胸。避免造成血气胸。 总之,只要熟悉大鼠生理解剖、熟练掌握插管和开胸技术、管理,建立无血预充大鼠CPB伴心脏停跳模型是完全可行的,且比大动物模型简单,两人即可完成,还可降低费用,同时还便于进行大样本的动物模型研究,其优势非常明显。无血预充大鼠CPB伴心脏停跳模型更符合临床,是进行CPB心肺损伤机理及评估保护措施研究的最佳实验工具,可用于体外循环和脏器保护的研究。 【参考文献】 [1] Dong GH, Xu B, Wang CT, et al. A rat model of cardiopulmonary bypass with excellent survival [J]. J Surg Res,2005,123(2):171-175. DOC格式论文,方便您的复制修改删减 [2] Fabre O, Zegdi R, Vincentelli A, et al. A recovery model of partial cardiopulmonary bypass in the rat [J]. Perfusion,2001,16(3):215-220. [3] Grocott HP, Mackensen GB, Newman MF,et al. Neurological injury during cardiopulmonary bypass in the rat [J]. Perfusion, 2001,16(1):75-81. [4] Khan TA, Bianchi C, Araujo E,et al. 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