蓝白斑筛选

蓝白斑筛选 基因(gene engineering)是20世纪70年代 以后兴起的一门新技术，即用人工的方法，把遗传物 质DNA分离出来，在体外进行基因切割、连接、重 组，然后再转移到生物体内并进行表达的技术。基 因工程中的关键一步是将目的基因与DNA载体连 接成重组DNA，获得重组子，并把重组子筛选出来。 近年来，建立了许多方法来筛选重组子，其中较为常 用的是利用a互补原理，根据菌落的蓝白颜色进行 筛选‘1|。 oL一互补是指E(coli B一半乳糖苷酶的两个无活 性片段(N端片段和c端片段)组合而成为功能完 整的酶的过程。现在使用的许多质粒载体都带有 一个E(coli DNA的短片段，其中含有B(半乳糖苷 酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。在 这个编码区中插入了一个多克隆位点，可在此处 插入外源DNA片段。这种类型的载体适用于可编 码B(半乳糖苷酶c端部分的宿主细胞。尽管宿主 和载体编码的两个片段都没有活性，但他们能够 融合为具有酶活性的蛋白质，在含有底物X—gal的 培养基中形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到 质粒的多克隆位点后，导致N端片段丧失仪(互补 能力，因此，带有重组质粒的宿主细胞将形成白色 菌落。 基因重组与蓝自斑筛选是现代基因工程的关键 技术之一，因此也是目前我国高校生命科学专业开 设的基础实验之一。笔者在教学实践中，针对基因 重组这一实验分别参考了魏群主编的《分子生物学 实验指导》第1版和第2版旧一o，结果却显著不同: 按第一版的，将目的基因和载体用单一酶切后， 简单地沉淀回收，连接转化，在LB平板上长出了 蓝、白斑，取得了预期的结果;而按照第2版方案，将 目的基因和载体用双酶切，产物经电泳分离、切胶回 收，再连接、转化，结果在LB平板上只长出了白斑， 而不能长出如教材中所预期的蓝斑。由此，笔者认 为，有必要对蓝白斑筛选的机制问题进行一次探讨， 诸如:在转化与蓝白斑筛选操作中，线性的载体能否 够成功转化，形成蓝斑的载体从哪里来，重组载体转 化后是否一定会形成白斑，为何有些白斑会变蓝，重 组转化只有白斑出现是否属于正常现象，为了回答 这些问题，了本试验。 1材料与方法 1(1 试剂、质粒及茵株 DNA聚合酶、限制性内切酶Spe I和Nco I、L DNA连接酶等来源于大连宝生物TaKaRa公司，核 酸分子量为TIANGEN公司产品，琼脂糖为上 海Sangon公司产品;LB培养基、氨苄青霉素、IPTG、 X—gal为北京鼎国公司产品;其余试剂均为国产 纯。克隆载体pGEM-T Vector为Promega公司产品; 受体菌E(coli TOPIO为TIANGEN公司产品。杜仲 过氧化物酶Eucommia ulmoides peroxidase a基因 (PODa，AY714072)片段(3’端，长度为630 bp的 一段序列，下同)。重组质粒(PODa片段+pGEM Vector)o 1(2 PODa片段、pGEM(T Vector的重组与转化 利用PCR技术，将目的基因PODa从重组质粒 (PODa片段+pGEM Vector)中扩增出来，经琼脂糖 凝胶电泳分离并切胶回收后，T。DNA连接酶，于 16。C温度下与载体pGEM-T Vector连接过夜。然后 将连接产物转化E(coli TOPl0菌株，在含有IPTG和 x(gal的LB平板上筛选重组子。 1(3 空载体pGEM-T Vector的转化 将商品载体pGEM(T Vector转化E(coli TOPl0 菌株;pGEM(T Vector用T。DNA连接酶作用后，转 化E(coli TOPl0菌株，方法同1(2。 1(4重组质粒的转化 将重组质粒(PODa片段+pGEM Vector)直接 转化E(coli TOPl0菌株，然后筛选重组子，方法同 1(2。待菌落长出来后，提取重组质粒?。 1(5含目的基因PODa的重组质粒的酶切、连接、 转化 将重组质粒(PODa片段+pGEM Vector)采用 Spe I和Nco I双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳分离并 分别回收，获得PODa基因片段和线性质粒。再将 二者用T。DNA连接酶重新连接、转化后，筛选重组 子，方法同1(2。 1(6线性质粒的转化 将1(5中双酶切后获得的线性质粒转化E(coli TOPl0菌株，方法同1(2。 2结果与分析 2(1 目的基因PODa与载体pGEM—T Vector的重组 转化 基因PODa与载体pGEM(T Vector重组后，在 LB平板上筛选重组子。结果显示，在平板上长出两 种颜色的菌落。重组质粒转化子为白斑，而未重组 质粒转化子为蓝斑。 2(2栽体pGEM(T Vector的转化 将商品载体pGEM-T Vector转化E(coli TOPl0 菌株，结果显示，只在LB平板上长出少数几个蓝色 的菌落。说明商品载体pGEM(T Vector中存在着非 线性的环化载体。在T(DNA连接酶作用后，蓝斑 显著增多，说明部分载体发生自连环化。 2(3重组质粒的转化 重组质粒(PODa片段+pGEM Vector)的转化 效率要比连接产物的转化效率高，涂板16 h后， E(coli TOPl0菌落出现白斑，几乎长满了整个平板， 继续培养至40 h，菌落中有些白斑变为蓝斑，说明培 养基中有少量的X(gal被降解。 2(4含目的基因PODa的重组质粒的酶切、连接、 转化 __重组质粒经Spe I和Nco I双酶切后，获得 PODa基因片段和线性质粒(图1)。将二者对应 的条带进行切胶、回收、纯化，再连接、转化后培 养，在LB平板上长出白色的菌落，但无蓝色菌落 出现。 2(5线性质粒的转化 将1(5中双酶切后获得的线性质粒转化E(coli TOPl0菌株，在LB平板上没有长出任何菌落，说明 线性质粒不能成功转化。 万方数据 3讨论 在基因工程技术中，将外源基因DNA插入到质 粒载体上，构建重组质粒时，外源DNA片段与质粒 载体的连接以及转化过程都存在一定的效率，因此 最后生长出来的菌落并不是都带有目的基因的。这 就需要采用特殊的方法筛选出可能含有目的基因的 重组体克隆。 本试验通过5种方案来研究质粒的转化过程及 Q(互补与蓝白筛选机制。试验结果证明: (1)线性质粒载体转化不成功。经双酶切的质 粒载体自身不能环化，也不能成功转化。在大肠杆 菌中尚未发现线性质粒的存在，酶切后的线性质粒 载体如果进入大肠杆菌后有可能遇到自身复制上的 障碍，或者被宿主细胞中的酶所降解，因而其转化菌 在筛选培养基上不能长成菌落。 (2)蓝斑是环状质粒转化子形成的。pGEM(T Vector载体是在pGEM载体的基础上改造而成，两 个3’端都有突出T，很多DNA聚合酶在进行PCR扩 增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一 个突出的碱基A，刚好能与pGEM—T Vector 3’端的T 互补连接，可以提高PCR产物的连接和克隆效率。 进行转化后，在含有IPTG、X(gal的平板上培养时， 可以通过蓝白筛选，判断载体中有无DNA片段的插 入。理论上讲，末端带有T碱基的载体是无法自我 连接成环状的，而试验又证明线性质粒又不能成功 转化，所以，蓝斑只能是环化质粒转化子形成的。由 此，可能的接近合理的解释是商品pGEM(T Vector 载体中存在少量环状质粒和平末端的线性载体(末 端无突出的T碱基，在L连接酶作用下少数可以自 连成环状);在参考魏群的方法旧一1进行基因重组 时，单酶切方案中有蓝斑出现，是由于载体自连;而 双酶切方案中，只有白斑而不能长出蓝斑的原因是: 双酶切后的载体无法自连，非重组的线性载体又不 能转化。 (3)一般转化后的重组子会形成白斑，有些情 况下这些白斑会逐渐转变成蓝斑。白斑是由于外 源DNA插入LacZ基因中，造成?-互补失败，以至 于不能降解生色底物X(gal;对于时间长了白斑会 变成蓝斑的现象，这里给出一个合理的解释:DNA 插入后，LacZ会表达并合成出融合蛋白，在一定条 件下(如插入DNA序列不长，且不改变LacZ的读 码框)，融合蛋白还有着较低的酶活性，经过较长 时间后，也会有少量X(gal被降解，释放出蓝颜色 来。在试验中，有些白色菌落并不一定是真正的 重组子，因为载体自身的缺失或非目的基因的插 入，都有可能使转化的细胞获得相同的特征，所 以，重组质粒转化宿主细胞后，对转化菌落必须进 一步筛选和鉴定。