【doc】肌注导入外源促红细胞生成素基因导致小鼠红细胞生成增加

【doc】肌注导入外源促红细胞生成素基因导致小鼠红细胞生成增加 肌注导入外源促红细胞生成素基因导致小 鼠红细胞生成增加 ' 112'解放军预防医学杂志2008年4月第26卷第2期JPrevMedChinPLAApril2008Vo1.26No.2 寻s0县富 实验技术 $全?岔s岔s岔$全?岔 肌注导人外源促红细胞生成素基因 导致小鼠红细胞生成增加 李殉,李素芝,李淑梅?,薛采芳?,刘忠湘?,谢刚,王洪斌 (西藏军区总医院中心实验室,拉萨850007) 摘要:目的尝试采用活体转基因:肌注导入外源促红细胞生成素(EPO)基因,促使小鼠红 细胞过度生成,为验证有关干预药物的体内效应和探索疾病发病机制提供动物实验对象.方法 取急进高原大鼠肾脏组织用RNeasyMiniKit提取总RNA,通过RT—PCR克隆大鼠EPO编码基 因,构建真核转染质粒,经肌肉途径注射小鼠,对小鼠血液有关指标的变化进行检测.结果DNA 测序结果证实,采用RT—RCR方法成功地克隆了Wistar大鼠EPO编码基因,其编码序列与Gen— Bank发布的序列gi:8393315完全一致,并构建真核转染载体pcDNA3/EPO,经肌内注射后显着促 进小鼠的红细胞生成,与对照组相比,各实验组小鼠全血红细胞压积(Hct),外周血网织红细胞比 例以及血浆红细胞生成素(EPO)水平增加均有显着性(P<0.05,P<0.01),各项指 标值随质粒用 量的增加而上升.结论通过肌注导入外源EPO基因是促进小鼠红细胞过度生成的 有效方法.本 实验方法简单易行,无需特殊设备条件,为在高原实地开展相关研究提供了良好的 基础. 关键词:红细胞增多症;转基因;促红细胞生成素 中图分类号:R135.6,R594.3文献标识码:A文章编号:1001—5248(2008)02—0112— 02 红细胞增多症除了原发于骨髓增生性疾病以 外,更多的是继发于多种慢性缺氧状态,其中,高海 拔(>3000m)长期居留是较为常见的环境致病因 素,低大气压和低氧分压可刺激机体释放造血促进 因子,提高红细胞的数量,高原适应不良个体由于红 系过度代偿造血致使血液粘滞度显着增加,从而引 发疾病状态.迄今为止,国内外有关红细胞增多症 的动物模型研究报道较少,本研究尝试采用活体转 基因:肌注导入外源促红细胞生成素(EPo)基因方 法,促使小鼠红细胞过度生成,从而为验证有关干预 药物的体内效应和探索疾病发病机制提供动物实验 对象.现将结果如下. 1材料与方法 1.1大鼠雄性Wistar大鼠,其体质量约200g,由 作者简介:李殉(1970一),男,研究生,医学博士,副主任,主治医师. 从事分子生物学和高原病研究. ?第四军医大学病原生物学教研室 第四军医大学实验动物中心提供,通过空运至海拔 3658m的拉萨驻地,6h后脱颈处死,取肾脏组织用 QIAGEN公司RNeasyMiniKit提取总RNA,于一20 ?冻存备用. 1.2RT—PCR克隆大鼠EPO编码基因用TaKaRa 公司RNAPCRKit所提供的OligodT—Adaptor引物 和AMV反转录酶,以上述大鼠肾组织总RNA为模 板完成反转录.合成如下引物:EPO—FGCG AAGCITGCCGCCACCA1'GGGGG1'GCCCCACGT CCC和EPo—RGCGGATATCTcACCTGTCCCC TCTCCTGCA,用TaRaLATaq完成PCR,参数设 定为:94oC预变性2min,94oC30S,55oC30S,72oC 1min,共35个循环,72?延时5min.扩增产物经 1.5%琼脂糖电泳分离鉴定. 1.3转染载体切胶回收目的扩增产物,与T载体 pMD18一T连接.经测序确证后用限制性内切酶 HindIII和EcoRV共同消化,琼脂糖电泳分离目的 产物并回收,与经相同酶切的真核转染载体peDNA3 连接,重组载体命名为peDNA3/EPO,用QIAGEN 解放军预防医学杂志2008年4月第26卷第2期JPrevMedChinPLAApril2008Vo1.26No.2'l13' HasmidMegaKit纯化,溶解于无菌磷酸缓冲液(PBS) 中,于一20?冻存. 1.4小鼠体质量18,20g雄性BALB/c小鼠被 随机分成5组,每组5只,按75mg/kg剂量腹腔内注 射0.75%戊巴比妥麻醉,用PBS调整质粒溶液浓 度,用BDUltra—FineTM(29G)胰岛素注射针于双侧 股四头肌和胫前肌进行注射,每点50止.1周后摘 除眼球放血,用EDTAK2抗凝.取少量血液用煌焦 油蓝染色后涂片,计数网织红细胞比例.温氏法测 定血细胞压积.分离血浆用华英公司(JL京)放免试 剂盒测定EPO含量. 1.5统计学处理采用方差分析和多个样本均数 两两比较的q检验(Newman—Keuls法)对结果进行 统计学处理. 2结果 2.1大鼠EPO编码基因DNA测序结果证实,采 用RT—PCR方法成功地克隆出Wistar大鼠EPO编 码基因,其由576个碱基编码192个氨基酸,其中前 23个氨基酸构成信号肽序列,而后166个氨基酸组 ,比对显示本文克隆的EPO编码 成成熟的EPO多肽 序列与GenBank发布的序列gi:8393315完全一致. 2.2EPO基因转染小鼠采用不同剂量的pcD— NA3/EPo质粒对小鼠进行肌内注射,1周后小鼠外 周血液有关指标的变化见1.与对照组相比各实 验组小鼠全血红细胞压积(Hct),外周血网织红细胞 比例以及血浆促红细胞生成素(EPO)水平增加均有 显着性(P<0.05,P<0.01),各项指标值随质粒用 量的增加而上升. 表1肌注外源EPO基因后小鼠外周血有关指标的变化(元4-s) 注:1,4组分别注射25Pg,50Pg,100Pg,200PgpeDNA3/EPO.与对照组比 较:P<0.05,一P<0.01 3讨论 为了维持充足的血氧容量以确保组织供氧,机 体通过肾脏分泌的糖蛋白EPO对红细胞的生成进 行调控,EPO具有阻止骨髓红系祖母细胞凋亡并促 进其增殖和分化的作用.高原红细胞增多症患者 多伴有慢性组织缺氧,在缺氧信号的持续刺激下, 肾脏分泌较多的EPO导致红细胞的过度生成,由此 引发一系列与血流动力和血流变相关的病理变化. 目前,文献报道的红细胞增多症动物模型有2类, 第1类是EPO转基因鼠(1-2~,第2类是对缺氧敏感 的HilltopSD大鼠l3J,2类模型各具特点,前者EPO 转基因鼠能够很好地模拟红细胞增多单因素对心 血管系统,运动耐量和个体寿命的影响,后者对缺 氧敏感的Hilltop大鼠在缺氧环境下的红系增生反 应则近似于人类慢性高原病.但是由于转基因小 鼠及大鼠模型制备需要较高的技术设备条件,花费 高昂,而缺氧敏感的大鼠品系目前仅局限于国外个 别实验室,国内尚无引进,并且实验工作需在低压 舱内进行,因此2类模型均不利于推广应用.本文 采用活体肌内注射DNA成功地将EPO编码基因导 人小鼠体内,在短时间内即观测到显着的生物学效 应,其长期效应也已列入后续实验观察. 本研究方法简单易行,无需特殊设备条件,从 而为今后在高原实地开展相关的实验研究提供了 良好的基础. 参考文献: [1]KLAUSFW,DORTHEMK,JOH,eta1.Chronicinbom erythrocytosisleadstocardiacdysfunctionandpremature deathinmiceoverexpressingerythropoiefin[J].Blood,2001, 97(2):536. [2]MARUYAMAH,HIGUCHIN,NISHIKAWAY,eta1.High — levelexpressionofnakedDNAdeliveredtoratlivervia tailveininjection[J].JGeneMed,20O2,4(3):333. [3]OULC,SALCEDAS,SCHUSTERSJ,eta1.Polycythemic responsestohypoxia:molecularandgeneticmechanisiTisof chroniciTlountainsickness[J].JApplPhysiol,1998,84(4): 1242. (收稿日期;2006—09—04;修回日期12006—12—28)