影响红曲酒糟发酵物γ—氨基丁酸含量的因子分析

影响红曲酒糟发酵物γ—氨基丁酸含量的因子 影响红曲酒糟发酵物γ—氨基丁酸含量的 因子分析 化学工业 Q:! ScienceandTechnologyInnovationHerald 影响红曲酒糟发酵物Y一氨基丁酸含量的因子分析? 陈豪锋'朱兰琴'朱丹华薛临生'张乃文'王用富'陈铭' (1.义乌市丹溪酒业有限公司浙江义乌322003;2.浙江省农业科学院浙江杭州310021) 摘要:红曲制品含有降血压功能的天然Y一氨基丁酸.增加红曲酒糟的v一氨基丁酸含量可以显着提高制酒和醋的副产品虹曲酒糟的 附加值.本研究对影响缸曲酒糟二次发酵中发酵温度,原料此.料水比,PH值,发酵时问,虹曲霉茵株,金属离子等对发酵物v一氨 基丁酸含量的影响效应进行了分析,确定了虹曲酒糟高天然Y一氨基丁酸二次发酵的各因子参数为:选用"丹溪l号"虹曲霉菌株,红曲/ 酒糟/米皮原料比0.10/2/0.8,料水比128/l00,添加0.12%CaCI,pH4.6,35?恒温发酵72h,79h.结果明,该工艺可使二次发酵 的红曲酒糟v一氨基丁酸含量显着提高,具有很好的应用前景. 关键词:红曲酒糟发酵v一氨基丁酸 中图分类号:TS262文献标识码:A文章编号:1674--098x(2010)05(b)一0137—03 Y一氯基丁酸(GABA)是一种天然非蛋 白质氨基酸,普遍存在于自然界动植物中, 5O年代末发现GABA具有降血压作用,而后 对不同动物的GABA降血压有效剂量进行 研究,发现GABA对不同类型的动物降血 压达20%所需要的剂量各不相同",.随着研 究的不断深入,继而发现GABA还具有其 它许多功能,如健脑,治疗癫痫,改善脂质 代谢,防止皮肤老化,清除体臭,使精神安 定,促进记忆,促进生长激素的分泌,肾功 能活化,肝功能活化,抗疲劳,增加食品风 味等?,t.因此对GABA的研究成了当今 生物和医药界的热点之一.目前已知含天 然GABA的有茶叶,发芽米,发酵大豆,桑 叶,甲鱼,红曲等,但其含量甚微,还不能达 到其显着功能的效果.因此,利用生物技术 生产高剂量的GABA$0品或再加工成新物 品,被认为是现代人最佳的保缝食品与日 常营养补充剂. 红曲产晶在被国已有上千年的历史, 尤以浙江省南部地区和福建省为主.浙江 省主要在义乌一带,据义乌县志记载,金 元四火医家之…朱丹溪先生在《本草衍义 补遗》医中记载了红曲的特性和功能: 甘,温,无毒.消食活血,健脾暖胃,冶赤白 痢,下水谷,陈久者良[8】.1979年日本农工大 学远滕章教授根据元朝医圣朱丹溪先生的 中医理论对红曲的药用功效和中医理论进 行研究,发现利用红曲菌发酵后的产品对 人体具有降血压,降血糖,降胆固醇及防癌 等功效,引起世界医学界的极大兴趣和关 注j.近年来,美国,日本,英国,韩国,泰国, 比利时,法国,捷克和中国等国家对红曲的 研究方兴未艾.经现代科学研究表明,红曲 制品除具有降血脂作用的洛伐它汀 (Lovastatin)~[".还具有降血压作用的v一氨 基丁酸等】.因此通过利用生物技术提高红 曲及其制品的天然Y…氨基丁J酸含量已受 图2发酵物pH值对GABA含量的影响 到极大关注. 红曲主要用于生产红曲酒,红曲醋, 曲色素等.在生产红曲酒醋的过程中,有人 量的制酒后的副产品酒糟,通常简单地作 为饲料副产品,其附加值较低.因此能否通 过特定的技术,提高其附加值是重要的研 究与开发内容之一.本研究报道红曲二次 发酵生产技术及其条件优化,增加红曲酒 糟的天然v一氨基丁酸含量,提高其在医 药应用上价值. 1材料与方法 1.1材料 红曲酒糟:本实验利用同一产地, 批次的有机大米为原料在同一批生产红l{打 酒后的红曲酒糟为二次发酵的主要原料. 红曲霉菌:二次发酵试验所用的红曲 霉菌株为本公司研究中心通过紫外线诱变 筛选申请专利的红曲霉菌株"丹溪1号", "丹溪2号","丹溪3号". 米皮:采用同一批有机稻米加工所得的 米皮用于本实验酒糟二次发酵的添加辅料. 1.2方法 发酵流程:本研究二次发酵工艺参照 常规的发酵红曲制酒工艺.简要流程为:根据 实验,取适量的红曲酒糟,加适量的红 曲,米皮,水,搅拌混匀,装入红曲酒发酵坛 子.置于控温培养箱中,恒温培养.按照实验设 计培养一定时间后,取出发酵物,住72?恒温 条件下,烘干,用于v一氨基丁酸含量测定. 发酵因子分析:为了分析不同的发酵 因子对红曲发酵物Y一氨基丁酸含量的影 响,优化红曲酒糟生产技术,本研究比较分 析了不同的二次发酵培养温度(30?,35 ?,40?,45?,50?,55?),发酵醪值(3.8, 4.1,4.6,5.1,6.0),二次发酵时间(46h, 62h,72h,79h,86h,96h,120h),离子激活剂 (Ca++,Mg++,Mn++,Zn++),料水比(75%. 100%,l28%,140%,150%),红曲菌种(丹溪1 号,丹溪2号,丹溪3号,),原料配比(红曲/ 酒糟/米皮0.08/1.0/0.5,0.09/1.2/0.6,0. 10/1.5/0.7,0.10/2/0.8,0.11/2/1.0)等冈 子对红曲酒糟GABA含量的影响. Y一氦基丁酸含量测定:Y一氨基_r酸 含量测定采用高效液相色谱测定法.以 AQC(6一氨基喹啉基一N一羟基琥珀酰亚氨 基氨基甲酸酯)为柱前衍生试剂,Waters AccQ?Tag氦基酸分析柱为色谱柱,梯度洗 ?基金项目:本研究得到浙江省科技厅项目《酿酒功能红曲的开发与生产应用 (2008Cl2046)的资助. 科技创新导报ScienceandTel~hnologyInnovationHerald]37 垫Q:坐 ScienceandTechnology1nnovationHerald 脱,紫外波长248.0nm. 1.3试验统计分析 所有试验均重复30:以上,以平均数和 标准误差表示,所有分析因子数据采用差 异显着性检验. 2结果与分析 2.1温度的影响 在lOkg酒糟,0.4kg红曲,5kg米皮,6kg 水混匀,调节pH5.1,装入发酵坛,分别在不 同温度(3o~c,35?,40~C,45?,50~C,55?)下 发酵79小时,然后发酵物烘干,测定比较其 v一氨基丁酸含量.结果(图1)表明,在相同 的原料配比,pH5.i条件下,35?恒温发酵 的GABA含量最高. 2.2pH值的影响 以上面相同的原料比,料水比条件下, 调节不同的pH值(3.8,4.1,4.6,5.1, 6.0),在35?条件下培养96小时,然后发酵 物烘干,测定比较其Y一氨基丁酸含量.结 果(图2)表明,在pH4.6时发酵产物Y一氨 基丁酸含量达最大值. 2.3料水比的影响 为了了解料水比对发酵物Y一氨基丁 酸含量的影响,实验在同一固体配料(红 曲:米皮:酒糟=0.4:5:10)条件下,分别加 不同量的水得到不同的料水比(75/l00, 100/100,128/100,140/100,l50/100,w/w), pH4.6,在35?条件下发酵79h,然后发酵 物烘干,测定比较其v,氨基丁酸含量.结 果(表1)表明,在料水比为128/100时, GABA含量最高.但其他的固体配料比,发 酵温度,pH,发酵时间是否也有同样的结 果,尚需进一步优化研究. 2.4原料配比的影响 二次发酵的主要原料是红曲酒糟,米 皮和红曲.试验比较了不同的原料配比对 发酵物的Y一氨基丁酸含量的影响,结果 (表2)表明,在分析的不同原料配比组合中, 以0.10/2/0.8(w/w/w)的配比所获得 GABA的测定值最高(8885mg/kg),而0.11/ 2/1.O配比的结果也较为理想(8340mg/kg). 图3不同发酵时间对GABA含量的影响 表1不同料水比对GABA含量的影响 Table1EffectsofmoistureontheGABAcontent 化学工业 2.5发酵时间的影响 从本项目的第一阶段试验中,发现红 曲酒糟二次发酵的时间对GABA含量具有 一 定的影响.为了更好的确定最好的发酵 时间,试验分析比较了不同发酵时间对发 酵物Y一氨基丁酸含量的影响,结果(图3) 表明,随着发酵时间的增加,发酵物的 GABA含量出现先升后降的现象.发酵79 小时,发酵物的GABA含量达到最高,随 后,随着发酵时间的继续延长,GABA含量 逐渐下降,但其幅度并不是太大. 为了更精确确定发酵时间对GABA的 影响,实验又在79小时左右选取了3个发酵 时间(72h,79h,86h)进行比较(图3).结果表 明,发酵控制在72h,79h之间为最佳发酵 时间,其红曲发酵物的GABA含量达最大 值,并趋于相对稳定. 2.6菌株的影响 为了探讨红曲霉菌株对发酵物v一氨 基丁酸含量的影响,实验对通过诱变选育 的3个红曲霉菌株(丹溪1,2,3号)进行了比 较.结果(表3)表明,在相同的条件下,丹溪 1号红曲作为二次发酵的添加菌种,所产生 的GABA含量显着超过了其他2个菌株所 制成的红曲.说明丹溪l号菌株制成的红曲 较适合于高含量天然v一氨基丁酸红曲酒 糟发酵生产. 2.7金属离子激活剂的影响 微生物分泌的不同酶的反应速度受到 不同酶激活剂(某些金属离子等)的影响.试 验选用Ca++,Mg++,Mn++,Zn++(分别用 0.12%CaC1,MgSO,MnSO,ZnC1)作为激 活剂,比较了其对发酵物GABA含量的效 应,试验结果(表4)表明,Ca++的使用使发 酵物GABA的含量从对照的8500mg/kg提 高到9385mg/kg.而其他的金属离子 Mg++,Mn++,zn++的添加反而使GABA 的含量下降. 最后,综合以上实验结果,试验选出了 最佳高含量天然v一氨基丁酸红曲酒糟生 表2不同原料配比对GABA得率的影响 Table2EffectsofmateriaIratiOontheGABAcontent 表3不同红曲霉菌株对发酵物GABA含量的影响 Table3EffectsofMonascustuberontheGABAcontent 表44种金属离子激活剂对GABA得率的影响 Table4Effectsof4positiveionsontheGABAcontent 激活剂的种类CaMgM1lzn"l对照 GABA含量mg/kg9385?516710n-t-91,7n1+,17965+64I8500_+339 138科技创新导报ScienceandTechnologyInnovationHerald 化学工业 鱼: ScienceandTechnoIogyInnovatIonHerafd 产技术工艺:采用丹溪红曲1号菌株,添加 米皮.原料配比为红曲/酒糟/米皮=0.10/ 2/0.8,料水比128/100,Ca++(0.12%CaC1) 作激活剂,pH4.6,35?恒温发酵72-79h. 该工艺可使红曲酒糟发酵物的GABA含量 比原对照lr艺提高10倍左右. 3讨论 本试验针对调控技术的诸多因素进行 不断深入优化,获得GABA含量显着提高 的红曲酒糟二次发酵生物调控技术体系 (包括配方,温度,pH值,料水比,原料配比, 发酵时间,菌株,激活剂等生产工艺因子). 使之人量富集和增DNGABA. GABA是麸酸经谷氨酸脱羧酶(简称 GAD)脱羧形成的代谢产物.在有效的作用 温度范围内,温度低,酶的催化作用小,酶 解速度随着温度的升高而加快.但温度过 高又使酶变性而失活.在一定的温度下,酶 的催ft作用很大,活力最强,酶促反应最 快,这个温度就是这种酶在该条件下的最 适温度.本实验结果表明在PH4.6的条件 下,35?恒温发酵的GABA含量最高.说明 GAD在以红曲酒糟为主要基质的情况下35 ?时其酶活力最强或能合成最多的酶. 红曲酒糟中的麸酸是以它的酸酉f(吡咯 羧酸)的形式存在.在酸性条『牛下,它易水 解成麸酸,而且这是一个可逆反应.另外,麸 酸转化成GABA是通过GAD的催化而进行 的,而【H+】对酶的影响很大,因此红曲酒糟 的二次发酵过程中控$11pH值就显得相当重 要.本试验在35?恒温条件下pH4.6时,发 酵产物GABA的含量达最大值,这可能是住 这pH条件下,GAD的酶活力最强.同时,实 践中对发酵进行观察,可见PH4.6的试样发 酵产生的一:氧化碳最多,如不及时不耙搅 拌,就会发生发酵醪溢出发酵容器的现象. (上接136页) 2.3.1HAc$1]淀枷指示齐Jj溶液的配芾Jj 准确称取一定量的HAC和淀粉,分别 配$112mo1.IHAc{N5g.I淀粉指乐齐1.溶 液. 2.3.2I2标准溶液的配制及标定 将配制好的0.05too1.I..I2的标准溶 液,采用基准物AsO进行标定. 2.4维生素C含量的测定 准确量取,?定体积的浸取液于250mL 锥形瓶中,为防l卜维生素C的氧化,迅速 加入10mI2mo1.I醋酸溶液,加入淀粉指 示剂,搅匀后立即刖I2标准溶液进行滴定 至稳定的蓝色(15s内兰色消失),每个样 品平行测定二三次.维生素c的百分含量可按 下式计算: C,×,X176.12×1O0 Vc%= 式【}J:C,,:碘标准滴定溶液的浓度, mol/I; V测定时所用碘标准溶液的体积, mI; 176.12:Vc的摩尔质量,g/mol; M:测定时所取橙汁的质量,g. 红曲酒糟二次发酵所用的重要原料是 生产红曲酒的下脚料一一红曲酒糟,加上 适量的米皮,红曲和水.酒糟里含有吡咯羧 酸一一麸酸的酸酐,米皮里含有活性较强 的GAD,二者共同作用于红曲酒糟,使红曲 酒糟经过二次发酵,提高GABA的含量.因 此,三者之间的配比以及水分含量对GABA 含量的影响较大.它决定了底物的浓度和酶 的浓度,影响了发酵过程中菌的生长.在本 实验条件下,红曲/酒糟/米皮以0.10/2/0.8 的配比,含水量为l28%时,能产生较高的 GABA含量.一般来讲,当酶的浓度一定时, 底物浓度决定酶反应的速度,随底物浓度 的增加而增加,当底物浓度增加到一定值 之后,反应的速度就不再增加.而当底物浓 度充足时,如果其它条件不变,则酶反应速 度在一定范围内是随着酶浓度的增加而加 快,但到一定程度时则会处于稳定状态,而 当底物中可作用物被酶解完之后,则酶的 作用就停止. 在红曲酒糟=次发酵研究和产业化开 发中,如何得到效益最大化是f分重要的 课题.本研究结果表明,红曲酒糟二次发酵 时间对GABA的得率具有一定的影响.在二: 次发酵过程中,GAD将麸酸脱羧生成 GABA,GABA的含量也随着发酵时间的延 长而增加,但并不是无止境的.这可能是随 着底物浓度的减少,在位时间里GABA 的生成量也会逐渐减少,最后停止.另外, 氨基酸脱羧酶在一定的条件卜也会催化相 应的氯基酸脱羧而生成相应的胺,形成尸 碱.因此,正确制定二次发酵工艺,确定发 酵时间,既能节约能源,又能提高GABA得 率.从本实验结果还可以看出,发酵时间控 制在72h,79h之间为最佳发酵时间,在这 段时间里GABA的含量可达最人值,埤趋 f相对稳定. 3结果讨论 3.1测定结果 分别移取不同体积的浸取液,采用碘 最法进行测定,橙皮粉中维生素C的含最测 定结果如表1,2示. 3.2影响Ve提取的因素分析 3.2.1食用酒精提取与水提效果比较 食用酒精的提取率将近为水提取率的 5倩.因此,笔者认为,虽然采用食用酒精提 取维生素C成本比水提高,但采用食用酒精 提取率高,而且在维生素c的分离步骤,要 比采用水提的能耗低,而且食用酒精还町 以回收利用,所以应选取食用酒精作为橙 皮中维生素C的浸取齐Ij. 3.2.2固液比对维l,1:素C提取的影响 考虑到干鲜橙皮粉浸取过程中的溶 胀作用使其体积膨夫,要保持固液充分的 接触,且有利于采用直接碘量法进行维生 素C的含量分析,通过实验确定最佳固液比 为I:10. 3.2.3浸提次数对维生素c提取率的影 响 提取橙皮粉中维生素C时,第一次提取 率均达到5O.5%以上,第三次提取率明显降 红曲霉菌株在生长过程中分泌较为齐 全的酶系:有淀粉酶,蛋白酶,糖化酶,麦芽 糖酶,脂肪酶,果酸酶,谷氨酸脱羧酶及其 它脱羧酶等等.不同的酶其发酵底物和产 物各不相同.在红曲酒糟二次发酵工艺中, 红曲霉菌株的优劣是影响GABA含量的主 要因子之一.本研究表明,紫外诱变先选育 的丹溪1号红曲霉菌株制作的红曲在二次 发酵中GABA含量最高,是高含量天然Y 一 氨基丁酸红曲酒糟生产技术的适合菌 株.另外,在二次发酵过程中,添加Ca++ 对GABA含量也具有显着效应,可能是 Ca++影响了微生物的生长或者微生物分 泌的同酶的反应速度. 参考文献 [1】StantonHCandWoodhouseFH,J PharmacolExpTherl960,128:233 242. 【2jAbeY.eta1.AmericanJournalof Hypertension,1995,8(1):74—79(6). 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