四氯化碳毒理学的基础实验设计.doc

四氯化碳毒理学的基础实验.doc 四氯化碳毒理学的基础实验设计 生化系 食品082 200800602052 黄瑞锦 引言:在进行某一种受试物毒理学的基础实验设计前要先认识和了解其有关知 识。所以，要进行四氯化碳毒理学的基础实验设计先认识和了解有关性质。一(理化性质 四氯化碳 (carbon tetrachloride，CCl)，化学式CCl，又称四氯甲烷44 (tetrachloromethane)。是一种比水重，无色、易挥发、不易燃，易流动的液体。具氯仿的微甜气味，并具有一种令人愉快的气味。相对分子量153.84，相对密度 31.595g/cm(20/4?)，沸点76.74?，熔点,22.8?，蒸气压15.27kPa(25?)，蒸气密度5.3g/L。四氯化碳的蒸气有毒，它的麻醉性较氯仿为低，但毒性较高。吸入人体2,4ml就可使人死亡。 四氯化碳在水中的溶解度很小，且遇湿气及光即逐渐分解生成盐酸。易溶于各种有机溶剂，能与醇、醚、氯仿、苯等任意混合。对于脂肪、油类及多种有机化合物为一极优良的溶剂。 四氯化碳用作灭火剂时，不能灭活泼金属的火，因为活泼金属可以与之反应。也会在高温下与水反应生成有毒物质。 遇火或炽热物可分解为二氧化碳、氯化氢、光气和氯气等。 二.污染来源 四氯化碳(CCl)是较常用的有机溶剂。在工业生产中用作萃取剂、清洗剂、脱4 脂剂、制冷剂、灭火剂和驱虫剂等。在医学上用作麻药剂。在日常生活中，用作衣服的洗涤及去脂等。在生产和使用过程中，四氯化碳可释入空气而污染环境。近年来，美国对供水系统中CCl的检测结果发现，约2000万人饮用的水源被 4 CCl污染。据估计美国有近400万人在生产中暴露于CCl中。 44 三.毒性作用 CCl可经消化道、呼吸道和皮肤进入机体。吸入量的20%,35%可被人及动物4 机体吸收。CCl在血液中的浓度与脑中的含量接近，脂肪组织蓄积的量为血液中4 的2,8倍。部分CCl在肝微粒体细胞色素P450的催化作用下，通过脱卤素和氧4 化作用，解离成Cl?和CCl?自由基，后者能使生物膜脂质过氧化，扰乱干细3 胞脂质代谢，引起干细胞坏死。 CCl是典型的肝脏毒物，通过各种途径进入人体后，均可引起肝脏的严重损4 伤，如中心小叶坏死及脂肪变性。同时受损的还有肾脏、肺泡膜及肺血管。肾脏及肺的损伤不及肝脏，通常发生于肝脏损害之后，因全身代谢失调而发生。吸入四氯化碳蒸气时若饮酒、冷冻或提高空气中的含氧量，均可加重毒性作用。另外，四氯化碳可增加心肌对肾上腺素的敏感性，引起严重心律失常。人对四氯化碳的个体易感性差异较大，有报道口服3,5ml即可中毒，29.5ml即可致死。在160, 332OOmg/m浓度下可发生中毒。但也有在1,2g/m浓度下接触3Omin方出现轻度中毒。目前认为四氯化碳无致畸和致突变作用，但具有胚胎毒性。根据IARCl972 及1979年资料，四氯化碳长期作用可以引起啮齿动物的肝癌，被列为"对人类有致癌可能"一类的化学物。 CCl能引起皮炎，也可引起湿疹及麻疹。对皮肤刺激性比苯强。CCl 44可经烧伤皮肤多量进入机体。皮肤与CCl接触30min相当于浓度为0.063mg/L4 的CCl被人体吸入3h. 4 动物实验发现，小鼠、大鼠、豚鼠及家兔急性中毒时血液中蛋白质含量减低、各种蛋白质比例失调、血清多种酶(转氨酶、醛缩酶、精氨酸酶、黄嘌呤氧化酶、谷酰胺酶、氨基移换酶等)活性增加。组织学检查显示，肝脏出现脂肪性肝硬化和肾管状上皮退化等。这些现象与细胞膜渗透性或肝脏本身酶反应过程的破坏有关。 四.临床现 1.急性中毒 急性CCl中毒的病理改变主要在肝脏，同时累及神经系统和肾脏。另外也可4 发生心肌炎、支气管炎以及大脑中毒退行性病变。临床症状有: (1)潜伏期: 一般为1,3天，也有短至数分钟者。潜伏期长短与接触剂量及侵入途径有关。经呼吸道或胃肠道吸收中毒的临床表现类似;均可出现中枢神经系统麻醉及肝、肾损害症状。 (2)神经系统症状: 可有头晕、头痛、乏力、精神恍惚、步态蹒珊、短暂意识障碍或昏迷等。极高浓度吸入时，可因延髓受抑制而迅速出现昏迷、抽搐，甚至突然死亡。 (3)消化道症状: 口服中毒时较明显。可有恶心、呕吐、食欲减退、腹痛、腹泻及黄疸、肝大、肝区压痛、肝功能异常等中毒性肝病征象。严重者可发生暴发性肝功能衰竭。肝损害症状多于发病第2,4天出现。 (4)肾损害症状: 可出现蛋白尿、红细胞尿、管型尿。严重者出现少尿、无尿、氮质血症等急性肾功能衰竭表现。 (5)其他: 少数患者可有心肌损害、心律失常。心室颤动及呼吸中枢麻痹多为致死原因。 (6)吸入中毒者常伴有眼及上呼吸道刺激症状。有时可引起肺水肿。 2.慢性中毒 慢性接触CCl的病变也主要在肝脏。慢性中毒的报道较为少见。长期反复接4 触四氯化碳，可有头晕、乏力、失眠、记忆力减退、食欲不振、恶心、腹泻和腹痛等。可有肝大、肝功能异常。严重者可发展为门脉性肝硬化。少数患者发生球后视神经炎，出现视野缩小，视力减退。 此外，国外还有报道可引起听力障碍、耳蜗前庭系统功能障碍及再生障碍性贫血等。皮肤长期接触，可因脱脂而出现干燥、脱屑和皲裂等。 五.紧急处理 吸入:迅速脱离现场至新鲜空气处。保持呼吸道通畅。如呼吸困难，给输氧。如呼吸停止，立即进行人工呼吸。就医。 误食:饮足量温水，催吐，洗胃。就医。 皮肤接触:立即脱去被污染衣着，用肥皂水和清水彻底冲洗皮肤。就医。 眼睛接触:立即提起眼睑，用流动清水或生理盐水冲洗。就医。 六.治疗方法 目前尚无特效解毒剂，主要按一般急救措施及对症治疗。 (1)急性中毒时，应将患者迅速移出现场。脱去被污染的衣物。皮肤、眼睛受污染时可用清水或2%碳酸氢钠溶液冲洗，至少l5min以上。口服中毒者必须及早洗胃,洗胃前，先用液体石蜡或植物油以溶解四氯化碳。 (2)患者应卧床休息，密切观察3,4 天，要注意尿常规、尿量、血肌酐及肝功能情况，及早发现肝、肾损害征象。 (3)早期给氧，给予高热量，高维生素及低脂饮食。 (4)积极防治神经系统及肝、肾功能损害，治疗原则同内科。出现少尿、无尿时应及早作血液透析或腹膜透析，以防治尿毒症、高钾血症等。 (5)忌用肾上腺素及含乙醇药物。 (6)近年国外曾报道及早应用乙醚半胱氨酸可防止或减轻肝、肾功能损害。还有以高压氧治疗有效的报道。实验结果认为高压氧可减少四氯化碳在肝内自由基的形成，从而降低脂质过氧化作用，减轻肝损害。但国内尚未见报道。 七.基础实验设计 1.四氯化碳急性毒性实验设计 1.1实验目的 为了测试和求出四氯化碳对SD(sprague-dawley)大鼠的致死量(以LD表示)，50提供四氯化碳的急性毒作用性质、可能的靶器官和致死原因、剂量-反应关系，提供四氯化碳的进行中毒资料，初步评价对人体产生损害的危险性，为慢性实验以及其他道路学实验提供接触剂量和观察指标选择的依据。 1.2实验方法及步骤 通过四氯化碳(CCl)急性毒性实验设计来进行其对机体的毒性效应的研究。CCl44作为外源化合物，它的毒性作用也是通过生物体表现出来的，所以生物体对四氯化碳的吸收、排泄及代谢转化过程和生物体本身的种属品系、年龄、营养及健康等机体状态也是影响其毒性作用的重要因素。因此，对四氯化碳的急性毒性实验设计包括实验动物的选择及分组、四氯化碳进入机体的剂量和方式及时间发布、观察指标和LD50的计算等内容。 1.2.1实验动物的选择及饲养管理 本实验选用SD大鼠作为研究对象。因为大鼠在代谢和毒性反应上与人类较为接近，并且大鼠的繁殖能力较强、价格较低、体积小(占地少、易操作)、寿命短(实验期短)食谱与人相似(杂食动物)及具有便于分析明确的生物指标。因此，我们选用60只雌雄各半，体重为200g左右(相差不超过10g)，未交配和未受孕的健康成年的SD大鼠作为实验对象。而且试验前要进行1~2周的检疫观察和适应期，剔除临床异常者，所选用的饲料要能满足实验动物的营养需求。观察期间的喂养大鼠和小鼠 的室温控制在(22?3)?，相对湿度为30%,70%。饲养密度为每笼2只，无对流风，人工昼夜环境，饮水、饲料清洁，保持室内卫生。 1.2.2实验动物分组 为尽量降低和消除动物的个体差异对实验结果的影响，我们将60只雌雄各半的SD大鼠随机分成6组，1个对照组和5个不同药物剂量组，每组10只SD大鼠(雌雄各半)。 1.2.3染毒方法及周期 将四氯化碳用0.1%,1%橄榄油或精致花生油配制所需浓度，采用灌胃方法(灌药前要隔夜禁食，灌药后2~4h复食),实验组按0.5ml/100g体重1次给受试物，对照组按0.5ml/100g体重一次给0.1%,1%橄榄油或精致花生油。观察期为14d. 1.2.4剂量选择 查相关资料已知四氯化碳的半数致死量为2.92g/kg(大鼠，经口)，本实验以此作为计算四氯化碳对SD大鼠一次灌胃的半数致死量LD的中间剂量。由四氯化50 碳对SD大鼠的半数致死量LD为2。92g/kg(大鼠，经口)可知，四氯化碳属低毒50 物质，剂量选择时组距应较大，所以本实验的组距对数值选lg1.6=0.2，上下各推两个剂量组，则四氯化碳SD大鼠灌胃一次实验的剂量设计见下表。 表1 四氯化碳SD大鼠灌胃一次实验的剂量设计 组别 剂量/(g/kg) 对数值 1 1.16 0.0654 2 1.84 0.2654 3 2.92 0.4654 4 4.62 0.6654 5 7.33 0.8654 1.3毒性观察 1.3.1中毒症状 全面观察中毒的发生、发展过程和规律以及中毒特点和毒作用的靶器官。观察的系统包括: 表2 啮齿类动物急性中毒表现的观察内容 系统和器官 观察项目 中毒后常见表现 中枢神经系行为 体位异常、叫声异常、活动异常、多动或呆卧 统 运动状态 少动、震颤、痉挛、抽搐麻痹、僵直、运动失调 躯体运动系对刺激反应性 易兴奋、反应过敏或迟钝、反应低下或过高 统 脑、脊髓反射 减弱或消失 肌肉张力 松弛或紧张 自主神经系瞳孔 扩大或缩小 统 呼吸系统 鼻 鼻孔流液、鼻翼扇动 呼吸表现 呼吸深缓、过速、困难、衰竭 心血管系统 心区触诊、听诊 震颤、心动过速或过缓、心律不齐等 排便 腹泻、便秘 肠胃系统 腹部外形 膨隆、凹陷 粪便硬度与颜不成形、黄色、灰白色 色 泌尿生殖系阴道口、乳腺、肿胀、分泌物增多、会阴部污秽、脱出、遗精 统 阴茎 皮肤和被毛 颜色、张力 皮肤松弛、皱褶、发红、皮疹、溃疡、被毛蓬松 黏膜 结膜、口腔 分泌物增多、充血、水肿、苍白、紫绀 眼睑 上睑下垂 眼睛 眼球 眼球突出、震颤、充血 角膜 角膜混浊、血腥分泌物 直肠温和脚爪、升高或降低 其他 皮肤温 一般情况 姿势异常、消瘦等 1.3.2死亡与死亡时间 给药后立即观察并记录动物的中毒表现，症状出现和消失的时间及死亡时间，重点观察和记录每只动物的死亡时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。给药当日应连续观察，其后，每日至少观察2次，观察期为14d. 1.3.3体重 给药前、死亡时各称量以体重、观察期间每3d称量一次。 1.3.4病理检查 及时剖检死亡动物，肉眼观察主要脏器的大小、外观、色泽、有无充血、出血、水肿或其他病变，对有病理变化的组织及脏器应做组织病理学检查。试验结束时，对各剂量组存活动物和对照组动物也应该进行病理学检查。根据文献，本实验需进行的病理学检验项目有: (1)检测、比较不同染毒剂量组及对照组之间反映肝坏死损伤的指标如血清丙氨酸氨基转换酶(ALT)活力和反应脂肪变性损伤的指标如肝甘油三酯(TG)的含量。 (2)检测、比较不同染毒剂量组及对照组之间肝脏抗氧化指标如氧化物歧化酶(SOD)活力和还原性谷胱甘肽(GSH)含量及肝脏过氧化指标如脂质过氧化(LPO)含量。分析脂质过氧化指标变化与肝损伤指标变化之间的关系。 (3)检测、比较不同染毒剂量组及对照组之间血液中蛋白质含量、各种蛋白质含量、血清多种酶(转氨酶、醛缩酶、精氨酸酶、黄嘌呤氧化酶、谷酰胺酶、氨基移换酶等)活性。 1.4实验数据记录及LD的计算 50 根据各组的大鼠死亡数，用改良寇式法法计算动物半数死亡剂量(LD)及其95,50的可信限。当最大剂量死亡率为100%,最小剂量的死亡率为0;各组动物数相等;各 剂量组的组距等比或剂量对数差相等时，用(4-1)公式计算LD: 50 -1LD=lg[Xm - ?(?p-0.5)] (4-1) 50 当不含0和100%死亡率时，用下面公式: 3,pm,pn-1LD=lg[Xm - ?(?p- )] (4-2) 504 pqS=i (4-3) lgLD50,n -1LD 的95,的可信限= lg(lg LD?1.96xS) (4-4) 5050lgLD50 以上公式中:i为组距，即相邻两组剂量对数剂量之差;Xm为最大剂量对数;p为各剂量组死亡率(用小数表示);Pm为最高死亡率;q为各剂量组存活率;p为最低n死亡率;?p为各剂量组死亡率之和;n为各组动物数;S为lg LD标准误。 lgLD5050 假设四氯化碳对SD大鼠一次灌胃染毒急性毒性试验结果如表3所示。计算LD 50。 表3 四氯化碳对SD大鼠一次灌胃染毒急性毒性试验数据记录 组别 动物数剂量剂量对死亡数死亡率存活率p.q n /(g/kg) 数 n p q 1 10 1.16 0.0654 0 0.0 1.0 0.00 2 10 1.84 0.2654 2 0.2 0.8 0.16 3 10 2.92 0.4654 4 0.4 0.6 0.24 4 10 4.62 0.6654 8 0.8 0.2 0.16 5 10 7.33 0.8654 10 1.0 0.0 0.00 i=0.2 ?p=2.4 -1将上表结果代入4-1式得LD=lg[0.8654 – 0.2(2.4-0.5)] 50 -1 =lg0.4854 =3.058(g/kg) pqS=i = 0.0473 lgLD50,n -1-1LD 的95,的可信限= lg(lg LD?1.96xS)=lg (0.4854 ?5050lgLD501.96x0.0473)=2.46,3.79(g/kg) 因此，四氯化碳SD大鼠的灌胃LD为3.058(g/kg)，其95,的可信范围为2.46,50 3.79(g/kg)。 1.5结果评价 SD大鼠灌胃给药按改良寇式法算得LD为3.058(g/kg)，按国内通用的毒性分50 级系统(表4)表明四氯化碳属低毒级。 表4 毒性分级标准(以大鼠一次经口的LD) 单位:mg/kg 50 微毒 低毒 中等毒 高毒 剧毒 5000, 500, 50, 1, <1 1.6注意事项 (1)不同受试物其染毒剂量不同，根据其LD或其他因素综合考虑或通过预实验确50 定染毒剂量。 (2)四氯化碳具有挥发性，可由呼吸道吸收，对人体有一定毒性，操作时应注意。 (3)四氯化碳与溶剂橄榄油或植物油必须充分搅拌，需完全均匀溶解后方可染毒。 2.四氯化碳慢性毒性实验设计 2.1实验目的 为观察SD大鼠连续口服四氯化碳所产生的毒性反应及其程度，以提供毒性反应的靶器官及其损害的可逆性，确定无毒性反应剂量，为临床安全用药提供参考剂量。 2.2实验方法及步骤 2.2.1实验动物的选择及饲养管理 我们选用120只雌雄各半，体重为60g左右(组内动物个体体重相差应不超过平均体重的10%，组间平均体重相差不超过5%)，出生3,4周，健康的初断奶的SD大鼠作为实验对象。所用饲料能满足实验动物的营养需求，严格控制有毒、有害物质对饲料的污染;动物饲养房中不得使用消毒剂、杀虫剂等药物。实验期间大鼠是采用单笼饲养，且各组动物饲养条件(笼具、温度、光照、饲料等)严格一致。 2.2.2实验动物分组 为尽量降低和消除动物的个体差异对实验结果的影响，我们将120只雌雄各半的SD大鼠随机分成4组，1个对照组和3个不同药物剂量组，每组30只SD大鼠(雌雄各半)。 2.2.3染毒方法及周期 将四氯化碳用0.1%,1%橄榄油或精致花生油配制所需浓度，按照没天一次，经灌胃染毒，连续6个月。 2.2.4剂量选择与分组 根据四氯化碳对SD大鼠一次灌胃急性毒性试验计算所得的LD为3.058g/kg，50确定本实验的染毒剂量的分别为LD的1/10、1/20、1/40，即实验组的高、中、低剂50 量分别为0.3058、0.1529、0.07645g/kg。给药方式均采用等容量不等浓度给药，连续6个月经口灌胃染毒，1次/d;对照组给予等体积的0.1%,1%橄榄油或精致花生油灌胃。 2.2.5观察指标 (1)实验期间每周用电子秤称量大鼠体重，每日观察大鼠的活动、进食情况、中毒症状、毛色、对外反应、粪便等方面的变化，并进行详细记录。 (2)每周称量一次体重。 (3)在用药期(4个月)各组随机处死8只(雄雌各4只)进行病理剖检以及各项指标检测。在最后一次给药后24小时，各组随机处死16只(雄雌各8只)动物，进行血液学指标检查:红细胞计数(RBC)，血红蛋白(Hb)，血小板计数(BPC)、凝血时间(CT)，白细胞总数(WBC)及其分类:中性白细胞(N)、淋巴细胞(L)、嗜酸性白细胞(E)、单核细胞(M)。血液生化检查:天冬氨酸氨基转移酶(AST)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)，碱性磷酸酶(ALP)，尿素氮(BUN)，总蛋白(TP)，白蛋白(ALB)，血糖(GLU)，总胆红素(T-BIL)，肌酐(Crea)，总胆固醇(CTHO)。 (4)系统尸检和病理组织学检查: ?系统尸检:全面细致的尸检，为组织学检查提供依据; ?脏器系数:心、肝、脾、肾、肺、脑、肾上腺、甲状腺、睾丸、卵巢、子宫、前列腺; ?组织学检查:心、肝、脾、肾、肺、脑及视神经、骨髓、垂体、肾上腺、甲状腺、胰腺、胃、十二指肠、回肠、结肠、胸骨(骨和脊髓)、胸腺、淋巴结、膀胱、子宫、卵巢、前列腺、睾丸(连附睾)。 (5)各组剩下6只(雄雌各3只)大鼠继续观察2个星期后处死，剖杀，同样进行上述各项目检查，以便了解所出现短线反应的可逆程度以及可能出现的延迟性短线反应。 2.3结果评价 查阅相关文件可知，四氯化碳是典型的肝脏毒物，所以，四氯化碳对大鼠的毒性主要表现在肝脏部位，除此之外，肾脏及肺也有一定的损伤。四氯化碳慢性中毒时，与对照组比较后，如果观察到:低剂量组没有出现任何的有害作用，则相当于NOAEL;中剂量组出现轻微的毒性作用，相当于LOAEL;高剂量组出现明显的有害作用，但不会引起动物死亡,即使有，也不超过10%。有害作用主要表现有: 对照组:大鼠毛色有光泽,饮食、饮水正常,活动正常,随时间延长体质量逐渐增加,实验期间无死亡;肝脏、肾脏及肺颜色鲜红,有光泽,质地柔软,边缘锐利,表面光滑细腻。血液学指标检查、血液生化检查的各项指标无明显变化。 实验组:高、中剂量组的大鼠给药后状态逐渐转差,在实验过程中出现精神萎靡、饮食、饮水和活动减少、被毛蓬松失去光泽、进食量减少、尿黄、体质量增加缓慢等;肝脏逐渐肿胀,颜色变为暗红,以后体积缩小,颜色较正常变浅,随给药时间延长,肝脏颜色由暗红转为灰白,肝脏失去光泽,质地变硬,肝脏体积萎缩,表面凹凸不平,呈小颗粒状改变;肾脏、肺也出现一些较明显的病变。血液学指标检查和血液生化检查的有些指标与对照组相比会有有明显变化，特别是高剂量组。如: (1)血清ALT、AST活性升高明显，可作为四氯化碳中毒急性期肝功能损害的主要诊断指标。血清肝胆酸、血清前白蛋白等测定亦为敏感指标。严重受损时，血清胆红素、凝血酶原时间明显升高， 而血清白蛋白明显降低。 (2)血尿素氮、肌酐增高、内生肌酐清除率降低等尿液成分的改变是提示肾功能损害的早期证据。 八(参考文献 [1] 中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南[J].中华 肝脏病杂志,2005,13 [2] 曾林,王慧芳,曹永成等.四氯化碳诱导家兔肝纤维化模型的建立[J].动物医学进 展,2003,24(5) [3] 严卫星，丁晓雯.食品毒理学.北京:中国农业大学出版社，2009.8 [4] 毛跟年，许牡丹，黄建文.环境中有毒有害物质与分析检测.北京:化学工业出版社， 2003.11 [5] 王心如.毒理学基础.北京:人民卫生出版社，2007