高效液相色谱法测定蔬菜与水果中拟除虫菊酯类农药残留量

高效液相色谱法测定蔬菜与水果中拟除虫菊酯类农药残留量 摘要：本实验采用超声分散，液相萃取，柱子吸附分离技术，结合高效液相色谱法测定蔬果中拟除虫菊酯类农药的含量可以取得较满意的结果。此操作便捷可广泛应用于蔬果中农药含量的测定。 关键词：拟除虫菊酯 高效液相色谱 农药含量 引言 农药是当前农业生产用于防治病、 虫 、 杂草对农作物危害不可缺少的物质 ，对促进农业增产有极重要的作用。随着农业科学技术 的发展 ， 化学农药的品 种和数量 不断增加 ， 已成 为防 治病虫害 的主要 手 段。农药施用到农作物上 以后 ， 一部分 因多种 原因 而转移到环境水 体 中， 对人 、 畜产 生一定 的危 害。  鉴于此， 为保障我国人民的身体健康、 有效对农药 在环境水体 中的残留量进行监控， 大力开展农药残 留量技术 以及相关的前处理技 术的研究是非 常必要的。  拟除虫菊酯类农药具有高效 、 低毒 以及生物降 解快 的特点 ， 广泛用于蔬 菜、 茶 叶等农作物种植 中 害虫的防治 。已报道 的拟除虫 菊酯类农药残 留量 测定方法主要有气相色谱法( G C ) [ 1 - 4 3 ， 由于一些拟 除虫菊酯具有热不稳定性， 而 G C法需要较高的汽 化温度， 它们会发 生一定 的分解 ， 从而对分析产 生 影 响。 因 此 ， 我 们 考 虑 采 用 高 效 液 相 色 谱 法 ( HP L C ) 分析拟除虫菊酯类农药 。  在我国制定的蔬果中拟除虫菊酯类的农药最高残留量国家为：氯氰菊酯0.2mg/kg(GB 4829.4-1994);氰戊菊酯0.2mg/kg（ＧＢ14928.5-1994）；溴氰菊酯0.2mg/kg（GB4828.4-1994）本实验直接采集新鲜的的蔬菜与水果样品，样品经过制备提取，净化和浓缩等预处理过程制备成为样品测试液以后，用液相色谱外标法（标准曲线法 )测定以上三种拟除虫菊酯类农药的残留量。 正文 1 实验部分 1.1 仪器 高效液相色谱仪，马弗炉，剪刀，电子天平，超声波提取器，离心机，恒温水浴槽。 1.2 试剂 l)有机溶剂:丙酮(农残级)，正己烷(农残级)。 2)层析剂:无水硫酸钠(A. R. )，层析中性氧化铝(A. R.),60~100目佛罗里(Florisil)硅藻土，玻璃棉。以上层析剂均在650℃马弗炉中灼烧4h后保存在干燥器中备用。 3)农药标准品与纯度:氯氰菊酯(cypermethrin) 96%氰戊菊酯(fenvalerate )94. 3%，溴氰菊酯(deltamethrin)97.5%。 4)农药标准溶液的配制。 ①单标准储备液:以市售的氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯农药标准品以正己烷为溶剂配制成适当浓度的单标准储备液。 ②单标准中间液:用正己烷将单标准储备液稀释成适当浓度的单标准中间液。 ③单标准使用液:用正己烷分别将3个单标准中间液稀释成含氯氰菊酯200μg/mL。氰戊菊醋100μg/mL和溴氰菊酯200μg/mL的单标准使用液。 ④混合标准使用液:用正己烷将3个单标准中间液混合稀释成含氯氰菊酯20.0μg/mL,氰戊菊酯10.0μg/mL和溴氰菊酯20. 0μ5g/mL的混合标准使用液。 1.3 实验步骤 1.3.1 样品的制备与提取 称取经剪刀绞碎的新鲜蔬菜与水果样品10g于50mL带盖塑料离心管 中，根据样品含水量多少加入适量的无水硫酸钠除水。然后向离心管样品中加入13mL丙酮:正己烷((3:10，体积比)混合溶剂，混匀后在超声波提取器中提取大于10min，将离心管上层提取液转移至l00mL烧杯中。逐次向离心管样品残渣中加入5mL,3mL混合提取剂，重复以上萃取、离心分离操作两次，合并离心管上层提取液至同一烧杯中。若合并提取液中还存在水分，再加适量无水硫酸钠除水。 1.3.2 柱层析净化与浓缩 在30cm(长)X lcm(内径)玻璃管层析柱底部加少许玻璃棉按顺序分别装上无水硫酸钠、中性氧化铝和60~100目佛罗里硅藻土各约1. 0cm高度，轻轻敲实（也可在实验之前预先做好）先用3 mL丙酮预洗层析柱，弃掉淋洗液。再将烧杯中的祥品提取液全部转移至柱内用3mL丙酮:正己烷((1:2，体积比)混合洗脱剂洗脱3次，收集洗脱液于接液管中。 将接液管置于50℃恒温水浴中用氮气吹脱至洗脱液体积少于0. 30mL，再转移浓缩后的洗脱液至2ml的样品瓶中，用正己烷定容至1mL，加盖密封，置于冰箱（0~4℃)中保存。(如果时间比较紧的话，低温保存这一步可以省略） 1.3.3 测定 1）色谱操作条件 色谱柱 ODS- （250mm*4.6mm,5 ) 检测波长 230nm 流动相 乙腈 流速  1ml/min  进样 20 并且设位置好其它工作条件 还有如柱温，进样口温度，检测其温度，升温速度等。 2）操作方法 ? 仪器开机预热运行稳定后你，在色谱工作站上设置色谱仪参数空运行一次，待色谱基线平稳后即可进样测定。 ? 外标法(标准曲线法)系列溶液的测定 在实验前先准备三个标准系列溶液的测定数据，在实验时，再测定本次实验的数据，记下对应时间下的积分面积。 ? 摇匀待测液体，先用待测液清洗进样器，用进样器吸取10μL的待测液，待色谱就绪后，打开进样阀，将进针头插入进样阀，稳定均匀进样后，拔出针头，扳下进样阀，待绘制完整的色谱图。 3）注意事项 1.新鲜蔬菜与水果样品的含水量较大，因此预处理过程中要注意除水，切不可将含水分的样品制备液进样。 2.在开启色谱仪之前，要先开通载气几分钟。实验结束后要先关仪器，再关闭载气。 2 结果与讨论 2.1数据与处理   浓度/10^-7mol/L 保留 时间/min 峰面积/A 工作曲线 10^5 1.131 26309.9 氯氰菊酯 10^3 1.108 1825.10472 正己烷溶液 10 1.146 78.71239         根据上表绘制氯氰菊酯（正己烷溶液）的工作曲线 根据上图可知氯氰菊酯（正己烷溶液）的工作曲线方程y=3.9117x-3118 2.2样品数据记录 保留时间min 峰面积A 1.124 1200.5     由工作曲线作图得出线性方程再代入本次试验所得积分面积求得蔬菜中拟除虫菊酯的含量为1.578*10^-4mol/L。（氯氰菊酯分子量：416.32） 2.3小结 经计算，样品中氯氰菊酯的含量为0.0657mg/kg,与我国制定的蔬菜中得氯氰菊酯的最高残留量的国家标准：氯氰菊酯 0.20mg/kg(GB 4829.4-1994)相比较，实验测得的样品中的农药残留量小于国家标准值。所以本次实验所用的蔬菜残留量没有超标，符合国家食品安全规定。 我们组的实验得蔬菜中拟除虫菊酯的含量较其他组高，是因为实验中，我们取的近乎都是水果的表皮，而果肉取的较少。 样品的预处理非常重要，其农药残留物的提取效率直接影响到最后测定结果的准确度，比如新鲜蔬菜的含水量较大，因此预处理过程中要注意除水。且净化尽量充分。 3结论 本实验采用高效液相色谱法测定蔬菜中得拟除虫菊酯类农药，且利用线性回归拟合方式处理数据，实验方法方便快捷，具有较高的准确度和精密度。 虽然氯氰菊酯分解快，残留少，但在使用时也应该严格执行农药规定的施药量、施药次数及用药浓度、农药安全间隔期，才不会对蔬菜和水果造成农药残留超标、污染。本实验仅就部分蔬菜中氯氰菊酯残留量进行测定，其他地区、其他蔬菜和农药残留是否存在健康危害，还需要大范围的采样调研和评估才能确定。蔬菜、水果管理部门应加强对外调水果的质量监测，经分析有农药超标的果蔬应禁止调运，确保食用者安全。 4 思考题 1、样品预处理过程非常重要，其农药残留物的提取效率直接影响到最后测定结果的准确度，应该怎样来评估农药残留物的提取效率? 答 首先实验所用的时间不能太长，所制得的待测液，颜色应该比较浅，因为纯粹的该类农药溶液是无色的，颜色越多说明混入的杂质的量越多，虽然大家可能认为只是叶绿素骗多了，但事实上叶绿素的偏多可以间接证明实验操作并不规范，一定还有很多杂质混入，这对结果的影响是很大的，结果图谱中在相应的时间所出的峰越独立，如尖峰是比较好的，如果是没有很多杂质峰连在一起的锯齿状峰，则所造成的误差就很大了。须知，农药的含量本身就是微量，如果与杂质峰相连，那么误差一定很大！这对于要求十分严格的农药测定来说是非常不符要求的。所以操作前提一定要严谨！ 2、用外标法一标准曲线法测定蔬菜与水果中菊酷类农药残留量，应特别注意哪些事项? 答 外标法一标准曲线法须配制一组不同浓度的标准溶液,分别测出它们的吸收度,然后以标准浓度(C)为横座标,以吸收度(A)为纵座标,即可绘出标准曲线图,如符合朗巴-比尔定律,则工作曲线为一通过原点的直线。供试品亦经过同样处理,测出它的吸收度,即可从标准曲线查出样品的浓度,再由稀释倍数或样品重量求出样品中被测组分的含量。适用于常规分析工作(因工作曲线绘成后,可以较长时间使用.在此期间内测定样品时,无需再配制标准溶液).并且朗白-比尔定律只适用于稀溶液,浓度较大时,吸收度的浓度不成正比。一般情况下,只要工作曲线的重现性好,测定结果较吸收度法准确. 3、如果农药残留物的色谱峰有重叠不能完全分开，可以通过调节哪些参数来改善色谱分离效果? 答 峰连在一起的原因有：仪器来来不及检测，相邻的物质性质十分相似等。 除了基本的仪器与处理操作外，可以通过设置扩大进样延迟的时间，降低升温速度，在某一处分比较集中地区域设置停止升温的缓冲时间（程序升温），降低流动速度，降低柱压，另外还有一些非参数调节如更换流动相，换极性不同的管子等。 参考文献： [1]宋玉峰，高磊等 蔬菜中氯氰菊酯残留的风险评估研究 农业环境科学学报 2010,29（12）：2293-2298 [2]余正萍 水果中氯氰菊酯残留量的测定 化学工程与装备2009：11. [3]范志金，刘丰茂，钱传范。氯氰菊酯的名称和组成及光学异构体 [J].农药科学与管理，1999,20（2）：9-11，17. [4]国家技术监督局.中华人民共和国国家标准GB/T14929.4-94食品中氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯残留量测定方法. [5]邵华，刘肃，杨锚，等．石墨化碳黑分散固相萃取-气相色谱-质谱法测定蔬菜中农药多残留[J]．农业质量标准，2008，(3)：43-45. [6]吕进锋．GC/MS外标法检测蔬菜中农药多残留的实验研究[J]．中国卫生检验杂志，2006，16(8)：937-938.