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甲胎蛋白异质体

2017-10-14 5页 doc 17KB 25阅读

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甲胎蛋白异质体甲胎蛋白异质体 甲胎蛋白异质体(Variants of AFP or molecular heterogenetic of AFP )是一种单链糖蛋白,含糖量约为4,左右。不同组织细胞合成的AFP,其糖链结构有所不同,对植物凝集素的结合能力也不相同,此种糖链结构不同的AFP称为AFP的亚型或变异体,也称为AFP分子异质体。近年来对AFP异质进行了电泳、糖链结构及与植物凝集素结合能力等方面进行了深入研究。有资料表明,AFP异质体存在着分子大小和电荷量的差异。淀粉胶电泳将人肝癌血清AFP分为4种亚型;用SDS聚丙烯酰胺梯度凝胶电...
甲胎蛋白异质体
甲胎蛋白异质体 甲胎蛋白异质体(Variants of AFP or molecular heterogenetic of AFP )是一种单链糖蛋白,含糖量约为4,左右。不同组织细胞合成的AFP,其糖链结构有所不同,对植物凝集素的结合能力也不相同,此种糖链结构不同的AFP称为AFP的亚型或变异体,也称为AFP分子异质体。近年来对AFP异质进行了电泳、糖链结构及与植物凝集素结合能力等方面进行了深入研究。有资料明,AFP异质体存在着分子大小和电荷量的差异。淀粉胶电泳将人肝癌血清AFP分为4种亚型;用SDS聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳发现AFP可分为分子量72kD和kD两种成分;等电聚焦结合交叉免疫电泳可使胎儿AFP分成10种等电点不同的异质体。这表明AFP异质体存在着电泳不无一性,这与其一级结构差异有关。其C,末端结构基本相同,N末端至少有3种不同结构,这能否产生AFP电泳异质性有待于证实。AFP结构中的糖链主要由甘露糖、半乳糖、N,乙酰葡萄糖和唾液酸,并以寡糖单位的形式组成。AFP异质体糖链结构的差异主要表现在分支结构的不同,刀豆素A(ConA)结合型和非结合型AFP异质体的糖链结构模型差异表现在一个分支中有无,GLcNAc-Gal-NeuNAc结构。对人肝癌AFP糖链结构电泳研究发现,其寡糖分为中性(N)、酸性(A,A)三种成分。进一步研究证实12 N两分支末端均由半乳糖组成,A两分支末端分别为半乳糖和N,乙酰神经氨酸,A则均为N12,乙酰神经氨酸。卵黄囊肿瘤的AFP其ConA亲和性组占50,左右,肝癌腹水中与LCA结合的AFP糖链中具有与Asn连接的N,乙酰基葡萄糖胺残基,而在非结合型异质体的糖链中无此成分。 根据AFP与外源性凝集素(Lectin)结合能力的差异,可分为不同的变异体。采用扁豆凝集素(LCA),刀豆素A亲和电泳或层析技术能将AFP分为LCA,ConA非结合型AFP(AFP,N,L,AFP,N,C)和LCA,ConA结合型AFP(AFP,R,L,AFP,R,C)两种。新的Lectin的应用,使AFP在糖链结构上异质体达9种之多。AFP异质体的命名方法为:从阴极开始在LCA亲和电泳上AFP的条带依次为L、L、L;在E,PHA亲和电泳上AFP的条带依次为P、1231P、P、P、P;用ConA时按AFPC、C命名;alloA时按AFPA、A、A命名。AFPL、L完全23451212323不能分离,存在中间成分时按AFPL、L命名,AFPP、P分离不充分时命名为AFP,P,AFP23454,P。因此,AFP对不同的Lectin反应所表现的异质体不同,故可用于疾病的鉴别诊断。5 AFP异质体亲和交叉免疫电泳检测法 【原理】 根据AFP对刀豆素(ConA)或小扁豆凝集素(LCA)结合能力的不同,可区别原发性肝细胞癌与非原发性肝癌引起的AFP升高,提高AFP对肝癌的诊断价值。此法原理是将检样于含LCA的琼脂糖凝胶中电泳,与LCA结合型AFP在电泳时被阻留,而非结合型AFP则向阳极侧泳动。然后,与首次电泳的方向垂直,在含抗AFP的琼脂糖胶中作第二次电泳。此时被首次电泳分离的AFP异质体,将分别于含抗AFP的凝胶板中形成沉淀峰,根据峰的大小即可了解结合型或非结合型AFP所占的比例。 【试剂】 1(小扁豆凝集素(LCA)。 2(抗AFP血清:同ELISA法。 3(10.0g/L琼脂糖:琼脂糖1.0g加0.25mol/L pH8.6巴比妥缓冲液100ml,沸水浴中使溶,加入NaN使达1.0g/L,按需要量分装后密塞,4?保存。 31254(I,AFP。 【试剂】 1(小扁豆凝集素(LCA)。 2(抗AFP血清:同ELISA法。 3(10.0g/L琼脂糖:琼脂糖1.0g加0.25mol/L pH 8.6巴比妥缓冲液100ml,沸水浴中使溶,加入NaN使达1.0g/L,按需要量分装后密塞,4?保存。 3125 4(I,AFP。 【操作】 1(将10.0g/L琼脂糖融化后,在6cm×12cm洁净玻板之一侧浇注2cm×12cm(厚1.6cm)凝胶条(约需3.84ml凝胶液),凝固后于距内缘2,3mm处切割一0.5cm×10cm的槽。 2(用巴比妥缓冲液将LCA稀释成2mg/ml(,20?可保存1个月),取80μl加入冷至56?的已融化琼脂糖凝胶1ml中,混匀后浇注于上述槽中。待凝固后,于此胶条上距阴极端0.5cm处打一直径0.2,0.3cm的孔,距此孔4.5cm处打第二个孔(第二份检样)。 3(两孔内各加一份待测血清,加样量5,10μl。以1.0g/L溴酚蓝为指示剂,10V,cm稳压电泳,至白蛋白泳出4cm时关闭电源。 4(将抗AFP血清按效价与融化并冷至56?的琼脂糖胶液混合(琼脂糖最终浓度为9.0g/L,抗AFP达最适浓度),并浇注玻板的其余部分(4cm×12cm),约需含抗血清胶液7.68ml,使凝固。 5(于LCA胶条下1.5mm处空白凝胶内切割一0.2cm×10cm的细槽,槽内注入混有1.0g/L 125溴酚蓝5μl的I,AFP 20μl(约6万,7万cpm)。如混入0.35ml融化的10.0g/L琼脂糖胶液中浇注更好。10V,cm稳压电泳,电泳方向与第一次电泳垂直。至白蛋白泳出4cm时终止。 6(电泳结束后,用滤纸覆盖于凝胶板表面,置37?干燥后,于暗室覆盖X光底片,室温曝光48h,显影,定影后观察。 【结果判断】 将X光胶片置坐标纸上,以峰两侧水平线作基线,峰形下总面积(小格数)为100,,各所占面积(小格数)与总面积的百分比即AFP异质体的百分比。 AFP异质体亲和电泳免疫印迹法 【原理】 将含AFP的待检血清置于含LCA的琼脂糖凝胶中电泳。LCA结合型AFP泳动速度慢,而CA非结合型AFP泳动速度快,形成前后2条区带。用吸附有抗人AFP抗体的硝酸纤维素(NC)膜进行免疫印迹,再依次与酶标记抗人AFP抗体和酶底物反应则显色。NC膜上可呈现2条着色区带,透明后用光密度计扫描,得出结合型与非结合型AFP所占百分比。 【试剂】 1(小扁豆凝集素(LCA)。 2(马抗人AFP抗体。 3(兔抗人AFP,HRP。 4(结合马抗人AFP抗体的硝酸纤维素膜(简称马抗人AFP,NC膜);将NC膜剪裁成与凝胶板相同大小,浸于最适稀释浓度的马抗人AFP抗体溶液中,5min后取出,电吹风吹干,4?保存,4周内稳定。 5(洗涤液:150mmol/L NaCl溶液,含0.05% Tween-20。 【操作】 1(用25mmol/L Tris-巴比妥缓冲液(pH 8.6)配制10g/L琼脂糖凝胶(内含2.0g/L LCA), 浇注玻板。凝胶厚度为1.0mm,长8cm,宽度视标本数而定,一般为1cm宽,每份标本。在负极侧0.5cm处,切一条7mm长、1mm宽的加样槽,槽内加待检血清4μl。电压15V,cm,电泳45min。电泳毕,取下琼脂糖凝胶板。 2(将马抗人AFP,NC膜先用蒸馏水浸湿,仔细地覆盖于琼脂凝胶板上,再在NC膜上加 2数层滤纸,上面置10g/cm的重物。约经30min,凝胶板上AFP电泳区带即转印至NC膜上。 3(将免疫印迹的NC膜浸入用20g/L牛白蛋白溶液最佳稀释的兔抗人AFP,HRP溶液中,37?,经1h后取出。NC膜用洗涤液洗3次。最后将NC膜浸入酶底物溶液(DAB,HO)中,22待显现出二条棕黄色区带后,用蒸馏水冲洗数次,终止反应。 4(在阴极侧的区带为LCA结合型AFP;阳极侧的区带为LCA非结合型AFP,NC膜在空气中干燥后,用十氢萘透明,用光密度计在波长490nm扫描,打印出二条区带的百分数。 【参考值】 阴性 【临床意义】 1(AFP是一种糖蛋白,其寡糖链有多样性,AFPV与植物血凝素中的小扁豆以集素(Lens culinaris agglutinin, LCA)亲和力不同,而分为LCA亲和的(LCA,R)和与LCA非亲和(LCA,N)的两部分,原发性肝癌的AFP糖链中存有异质体。 2(AFPV检测能鉴别良恶性肝病,如LCR,R?25,者多数(80,以上)为原发性肝癌。LCA,N高者为良性肝病,如急慢性肝炎,肝硬化等。 3(对病程预后的判断:如肝癌切除后,AFPV随AFP转阴而消失,若AFP未转正常,但甲胎异质体含量明显下降的患者复发的危险性少,而AFP含量下降,AFPV含量相对恒定者,则术后容易复发。
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