以非磁化及磁化离子交换树脂为载体的果胶酶固定化的研究

以非磁化及磁化离子交换树脂为载体的果胶酶固定化的研究 以非磁化及磁化离子交换树脂为载体的果胶酶固定化 的研究 密级―― 学号 至苎Z垫 ? 硕士学位论文 题目 燮韭熊丝壁壁丝离壬窒塑挝脂 垄载签丝墨膣酶固定丝堑窒 作 者 蓬超塑 指导教师垡盛堂塾蕉 学科专业 盒墨盘鲎 提交日期 三盎生垂月 以非磁化及磁化离子交换树脂为载体的果胶酶固定化研究 陈姗姗 摘要果胶酶是催化果胶物质分解的一类酶的总称。果胶普遍存在于各种水 果中，是水果细胞中层和初生壁的主要成分，果汁中的果胶对其粘度和浊度有较 大影响。在果汁加工中，加入果胶酶进行酶解工艺，可以提高出汁率，加速果汁 过滤，促进澄清。因此，果胶酶成为水果加工中应用最重要的酶。 由于果胶酶的价格相对较高，因此，果胶酶的回收和重复利用对水果加工业 是非常有利的。为了达到这个目的，常常将果胶酶固定到载体上。果胶酶固 定化 技术是实现酶重复连续使用和稳定性改善的有效手段。 许多有机物和无机物都可以用来固定酶，离子交换树脂是工业上使用最广的 载体材料之一，它价格低廉，机械强度好，理化性能稳定，作为固定化载体有着 广阔的应用前景。近年来磁性高分子微球在生物医学、细胞学及生物工程等领域 的应用受到越来越广泛的关注。与其它载体相比，磁性载体更利于分离和回收。 本文以非磁化和磁化离子交换树脂为载体对果胶酶进行固定化研究，确定了 两种载体固定化果胶酶的最适条件，用扫描电镜对固定化酶进行了征，并研究 了非磁化和磁化固定化果胶酶的酶学性质。主要试验结果如下: 1 通过以广泛应用于工业上的十种吸附树脂和离子交换树脂为载体，进行果胶 酶固定化筛选试验，确定固定化的最佳载体为D380大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交 换树脂。 2 对以D380树脂为载体的果胶酶固定化方法及条件进行了研究和优化。最终 确立了最佳固定化参数为:固定化温度36,40?，加酶量0(75mL,1(09树脂，固定 化时间6h，固定化DH值5(5，戊二醛交联浓度0(1,，戊二醛交联温度3。C,4?， 戊二醛交联时间4h，在此条件下，固定化酶活回收率达到81(67,。。 3 对以D380树脂为载体的固定化果胶酶的酶学性质进行了研究，并与游 离果 胶酶进行了比较，研究发现:经固定化后，果胶酶的最适温度较游离果胶酶有所 提高，游离酶的最适温度为50"C，而固定化酶的最适温度为60。C，其热稳定性明 显高于游离酶;固定化果胶酶的最适pH为4(0，游离果胶酶的最适pH为3(5，固 定化酶较游离酶有较宽的pH稳定范围。研究还得知:固定化酶有较好的重复使用 性，在使用10次后，还能保留较高的酶活力，达50,;在4"C下，其贮藏稳定性 较游离酶有明显提高。 4 对以磁化D380树脂为载体的果胶酶固定化方法及条件进行了研究和优化。 脂，固定化时间6h，固定化pH值5(5，戊二醛交联浓度O(01,，戊二醛交联温度 10"C，戊二醛交联时间2h，在此条件下，固定化酶活回收率达到137(5,。 5 对以磁化D380树脂为载体的固定化果胶酶的酶学性质进行了研究，并与游 离果胶酶进行了比较，研究发现:磁性固定化酶的最适温度为70"C，游离酶的最 适温度为50?，在30?,60?的范围内，热稳定性明显高于游离果胶酶;其最适 性固定化酶对pH的稳定性较游离酶有明显提高;其操作稳定性较以未磁化树脂为 载体的固定化酶低，在前6次的重复使用中可以保持较高的酶活力，达61(11,; 在4?下，其贮藏稳定性较游离酶高。 关键词: 果胶酶 固定化 离子交换树脂 磁化 II Studiesonthe ImmobilizationofPectinase and bynon-magnetic magnetic Resin ion-exchange Chen Shanshan ， AbstractPectinaseisa of that various complexgroupenzymesdegrade pectic in substances(Pectin，the themiddlelamellaand majorcomponent cellwallof primary a onthe and of higherplants，has fruit greatimpact viscosity turbidityjuices(Pectinase is usedfor the and mainly clarificationoffluit use increasingyield juices(Therefore， the of inthe offruit is pectinase common( productionjuicesvery Duetothe costof usedinfruit itisoften relativelyhigh pectinase juice processing tohavea inwhich can the be advantageoussystem enzyme recoveredorutilized commonmethodof thisaimisto repeatedly(A achieving immobilizethe ona enzyme solid of isaneffective support(Immobilization measuretoachieve technologypectinase and utilizingrepeatedlyimprovestability( and substanceshavebeenusedasthe Manyorganic materials( inorganic support Ion resin isoneofthemost materials used in thebroad exchange widely has industry(It asthecarrierofimmobilizationforitslow applicationprospect mechanical price(good stable properties，and receive physicalperformance(Recently，magnetic particles considerable attentionbecauseoftheir usein widely andSO with bioengineering immobilized on(Comparednon-magneticcarliers，enzyme carrierscanbemore recoveredand bymagnetic easily fromthereaction separated system( Inthis of and ion article，immobilizationpectinase bynon-magneticmagnetic resinwasstudied(Theconditionsof of exchange optimal and immobilizedwere thesis( non―magneticmagnetic enzymemainly inthis investigated external Moreover,the ofimmobilizedWascharacterized configuration enzymes by electron main resultsareasfollows: scanningmicroscopy sEM (Theexperimental researchontenkindof resinandion resin 1 Thron曲primarily absorption exchange used in findthebest fortheimmobilizationof is widely industry,we support pectinase the resin D380( anion-exchange Was resinD380 immobilizedon as 2 Pectinase anion-exchangeusingglutaraldehyde cross―linking of ofthe reagent(Effecttemperature，pH，time，amountenzyme， concentrationof andtimeonthe glutaraldeh【yde(cross-linkingtemperature activity ofimmobilized inthis recovery was thesis(The enzymemainlyinvestigated optimum nI for immobilizationwereas mL conditionsthe follows:40?，PI-15(5，6h，0(75 pectinase(The concentrationof WaS andtimewere4"C glutaraldehyde0(1,，cross??linkingtemperature and4h the conditions，the ofimmobilized respectively(Underoptimal activityrecovery Callreachtomorethan81(67,( pectinase ofimmobilized as withfree characteristics f0Uows: 3 Comparedpectinase，the pectina?were was60"C thefree was the whereas optimumworkingtemperature enzyme50。C;theoptimum 0whereasthefree was3(5(Fromthedataillustrated was4( workmgpH enzyme above， We Candrawtheconclusionthatthethermal oftheimmobilizationhas stability enzyme theimmobilizedhada obviouslyimproved(MoreoveLpectinasewidelypHstability and are toevaluate veryimportant operationstabilitystoragestability targets scope(The whethertheimmobilizationhas andthecommercialization(Itwas enzymepracticability can seenthattheimmobilizationhad still enzymegoodoperationstability(Itkeephigh tentimes ofthe more，thestoragestability activity 50, afteroperations(Further thanthefree whenstoredat4"C( immobilization enzyme enzymeimprovedobviously Wasimmobilizedon resin as 4 Pectinase magneticusingglutaraldehydecross-linking oftheimmobilization time， amount reagent(Temperature medium，pH，immobilization of andtime ofthe temperature enzyme，concentrationglutaraldehyde，cross??linking thesis(The conditions were asimmobilizationinthis optimum investigated parameters mL fortheimmobilizationwereasfollows:30"C，PH5(5，6h，0(5 pectinase(The concentrationof was andtimewere 0(01,，cross-linkingtemperature glutaraldehyde and2h the of IO'C conditions，therecovery optimal activity respectively(Under immobilizedcanreachtomorethan137(5,( pectinase characteristicsof immobilizedwere withfree magnetic pectinase 5 Comparedpectinase，the thefree WaS asfollows:lhe was70‘Cwhereas 50"C; temperature enzyme optimumworking 3(5(Inthis can was4(5whereasthefree was the workingpH enzyme research， we optimum thatthethermal theimmobilization concluded stabilityCoetween30,60"C of enzyme oftheimmobilized has stability pectinase obviouslyimproved(Moreover,tllcpH isnotas whenthevalueof isbetween3(5,4(5(The stability improved pH operation wasseenthatthe as on resin(It the immobilized good pectinase non-magnetic can had still highactivity immobilizationa stability(It keep enzymegoodoperation ofthe sixtimes stability more，thestorage 61(11,、after operations(Further thanthefree whenstoredat4"C( immobilization enzyme enzymeimprovedobviously resin magnetization immobilizationion―exchange Keywords:pectinase Y900681 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名:毯:垄塑塑堑日期:迎?:』 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西 师范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文 的电子版和纸质版;有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进 入学校图书馆、院系资料室被查阅;有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索;有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名:登:塑塑 文献综述 l果胶及果胶酶 1(1果胶 1(I(1果胶物质的概念 “Pektos”而来，意思为容易成胶的物质，中文译为“果胶”[1l。 果胶物质存在于高等植物中，是呈胶态的聚合碳水化合物的总称。其基本结 构是D(吡哺半乳糖醛酸以a(1，4(糖苷键连接的线型长链，其中羧基大部分被甲基 化?】。现己证实:果胶类物质，代表高等植物初级细胞壁和相邻间紧密联合的一 组多糖，也代表从植物材料制备的一群复杂胶状多聚体。果胶类物质的化学组成， 要以a( 1，4 (键合的D(半乳糖醛酸为基本结构，其中糖醛酸的羧基，可能不同程 度地甲基酯化，以及部分或全部形成盐型l“。 1(1(2果胶物质的分类 果胶是一种天然高分子化合物，它的相对分子质量为2(3x104,6×105。由于 果胶的来源不同，其分子量有很大的差异，表1-1为不同来源的各种果胶分子量151。 表1-1不同物质中的果胶分子量 来源 分子量 苹果和柠檬 3(0x105,6(0x105 梨 2(5x104,3(5x104 柑橘 2(3x104,7(1x104 向日葵 1(2x105 D(半乳糖醛酸聚糖作为果胶类物质的基本结构，其甲氧基含量或酯化程度变 化的幅度很大，约为0,85,。依据酯化度DE值 酯化的D(半乳糖醛酸残基在总 的D(半乳糖醛酸残基中所占的百分数 的不同，可以把果胶分为高甲氧基果胶 high(methoxyl pectin，缩 写为LMP 两类，低甲氧基果胶的酯化度低于45,。 1944年4月美国化学会正式公布“果胶类物质的修订名称”，对当时常用的几 个名词规定了它的含义[4J: 生果胶酯酸; 2 果胶酯酸 pectinic acid :指甲氧基比例量较大的多聚半乳糖醛酸，它在适 宜条件下能与糖和酸形成凝胶，当甲氧基含量降低时能与某些金属离子形成凝胶。 3 果胶酸 pecticacid :基本上不含甲氧基的果胶类物质，就叫做果胶酸。果 胶酸的金属盐叫做果胶酸盐 pectinate 。 1(1(3果胶的结构 果胶物质广泛存在于植物的根、茎、叶、果实中，是细胞壁的重要组成成分， 与纤维素、半纤维素共同维持植物的构造。未成熟时，原果胶成分含量高，使得 水果和蔬菜具有坚硬的质构;成熟后，植物组织中的原果胶成分逐渐减少，果胶 酯酸和果胶酸成分增多，植物的质构发生相应的变化。果胶是细胞壁与细胞壁及 membrane 、 细胞与细胞之间的连接物质。细胞壁组成 图1 可分为质膜 plasma cellwall 、中层 middlelamella 【6J。中层以果胶物质为主，初 初生壁 primary 生壁以果胶为基质。果胶束缚水的能力很强，且随果胶链的增长，缚水性不断增 强，这给榨汁带来相当大的困难，因此要想提高果汁榨汁率就要设法先降解果胶。 图I-1植物细胞壁简图 果胶物质主要是由D(毗喃型半乳糖醛酸通过a(1,4(糖苷键连接成主链 图 1(2 ，并带有中性糖 D(半乳糖、L阿拉伯糖、D-山梨糖、L鼠李糖等 侧链的高 聚物[7,el。 O 图1-2果胶的化学结构 2 I，鼠李糖能与半乳糖醛酸交替出现在主链中，这段主链区称为鼠李半乳糖醛 性糖再作为侧链连接于鼠李糖上。因此，鼠李糖可使主链发生扭转【10】。主链中的 羧基部分被甲酯化，部分羧基结合了阳离子，部分羟基被乙酰化等，这些结构特 点构成了果胶物质分子结构的差异，并体现了不同的生物活性111,12]。 9 Ara 阿拉伯糖 Me??G踟A 甲酯化一半乳糖醛酸 e K7 @Ac-GaIA 乙酰化一半乳糖醛酸 G矗I 半乳糖 图1(3果胶的结构 (1(4果胶对果汁加工工艺的影响 1 苹果、柑桔、山楂、桃等果实中含有较多的果胶物质，加工中汁液粘度较大， 导致压榨与澄清发生困难，因此，为了制取高质量的清汁必须用果胶酶处理果汁， 使果胶降解，提高出汁率、加速过滤和澄清[2,13-15l。 果胶、蛋白质、淀粉、多酚等大分子物质是造成果汁混浊的主要因素116,17,， 其中，果胶是较主要的影响因素。胶体物质在有氧、光线照射、振动及贮藏时发 生一系列的变化，如化合、凝聚等，使果汁溶液原来的稳定性被破坏，形成混浊 直至出现沉淀【181。控制果汁混浊的方法是合理控制酶解工艺，使果胶完全水解。 果胶酶用来分解可溶性果胶，使其转变为半乳糖醛酸，消除果胶引起的沉淀【19l。 不过酶的加入量、酶解作用时间、温度都要合理控制，过滤后的清汁及时浓缩、 杀菌、灌装，彻底使酶失活，防止后混浊的产生。 3 1(2果胶酶 1(2(1果胶酶及其分类 果胶酶 Pectinase 是催化果胶物质分解的一类酶的总称，它主要包括果胶酯酶 Polygalacturonate lyase，简称PGL 和聚甲基半乳糖醛酸裂解酶 Polymethylgalacturonatrlyase，简称PMGUl2母281。商品果胶酶制剂都是复合酶， 有固体和液体两种，主要由各种曲霉属霉菌制成。它除了含有数量不同的各种果 胶分解酶外，还有少量的纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和阿拉伯聚糖 酶等等。 1 果胶酯酶 PE 果胶酯酶是一种催化果胶分子中的甲酯水解生成果胶酸和甲醇的水解酶。果 胶酯酶存在于植物中，霉菌和一些细菌及酵母也能产生果胶酯酶。在霉菌果胶酶 制剂和番茄中，果胶酯酶和聚半乳糖醛酸酶或果胶酸裂解酶一起组成了活性果胶 解聚体系，因此，在使用商业酶制剂降解果胶物质时，常伴随着甲醇的释出。果 胶酯酶有如下基本性质: ?果胶酯酶作用的最适pH值，根据其来源不同而有所差别。霉菌果胶酯酶 的最适pH约为5(0;细菌果胶酯酶的最适pH则为7(5,8(0。 ?果胶酯酶作用的最适温度在35,50?之间，超过55?，很容易失活。 ?钙离子和钠离子对果胶酯酶有激活作用。 2 聚半乳糖醛酸酶 PG 聚半乳糖醛酸酶分为内切聚半乳糖醛酸酶 endo(P?和外切聚半乳糖醛酸酶 fexo??PG 。 内切聚半乳糖醛酸酶随机水解果胶酸和其他聚半乳糖醛酸分子内部的糖昔 键，生成相对分子质量较小的寡聚半乳糖醛酸。通常所说的聚半乳糖醛酸酶就是 指内切聚半乳糖醛酸酶。 内切(聚半乳糖醛酸酶存在于高等植物、霉菌、细菌和,些酵母中，它能使底 物的粘度快速下降。由于酶只能裂开和游离羧基相邻的糖苷键，因此底物水解的速 度和程度随它的酯化程度增加而快速地下降。许多研究工作证明内切(聚半乳糖醛 酸酶具有多种分子形式和同功酶。例如，在番茄中该酶有两种分子形式，分子量分 别为35，000和85，000。不同来源的内切(聚半乳糖醛酸酶具有类似的分子量和米 氏常数值，但是它们的比活力存在着很大的差异。大多数内切-聚半乳糖醛酸酶 的最适pH值在4~5范围内，其中黑曲霉内切(半乳糖醛酸酶的最适pH值是4(0， 4 因此它在水果加工中得到广泛的应用。 外切聚半乳糖醛酸酶从聚半乳糖醛酸链的非还原端开始，逐个水解a一1，4糖苷 键，生成D(半乳糖醛酸和每次少一个半乳糖醛酸单位的聚半乳糖醛酸。外切(聚半 乳糖醛酸酶存在于高等植物和霉菌中，也存在于一些细菌和昆虫的肠道中。外切 聚半乳糖醛酸酶对溶液的粘度改变不大，但是还原性显著增加。外切聚半乳糖醛 酸酶作用的最适pH值一般为4,5。但也有例外，如欧氏植病杆菌外切聚半乳糖 醛酸酶的最适pH值为7(5。 3 聚甲基半乳糖醛酸酶 PMG 聚甲基半乳糖醛酸酶分为内切聚甲基半乳糖醛酸酶 endo(PMGl和外切聚甲基 半乳糖醛酸酶 exo(PMG 。内切聚甲基半乳糖醛酸酶随机切断果胶分子内部的a(1，4 糖苷键。使果胶的分子变小，粘度迅速下降;外切聚甲基半乳糖醛酸酶从果胶分 子的非还原末端开始，逐次水解a(1，4糖苷键，粘度下降不明显。 4 聚半乳糖醛酸裂解酶 PCL 聚半乳糖醛酸裂解酶，又称果胶酸裂解酶，主要是由细菌产生的，个别由植 9(5，可分为内切聚半乳糖醛酸物病原菌产生，它的最适pH值一般为8, 裂解酶 随机切断果胶酸分子内部的a(1，4糖苷键，生成具有不饱和键的相对分子质量较小 的聚半乳糖醛酸，粘度迅速下降:exo(PGL通过反式消去作用，切断果胶酸分子还 原性末端的a(1，4糖苷键，生成具有不饱和链的半乳糖醛酸，使还原性增加，但粘 度下降不明显。 5 聚甲基半乳糖醛酸裂解酶 PMGL 聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(又称果胶裂解酶。能直接地裂解高度酯化的聚半 乳糖醛酸。霉菌和少数几种细菌都能产生果胶裂解酶，但它不存在于高等植物中。 目前所有已知的果胶裂解酶都是内切酶，它们以随机的方式解聚高度酯化的果 胶，使溶液的粘度快速下降。高度酯化的果胶是果胶裂解酶最好的底物，果胶 裂解酶同底物的亲和力随底物的酯化程度提高而增加。在果汁加工中，特别是 在含高酯化果胶的苹果汁中脱果胶时，果胶裂解酶起着重要作用。不同来源的 果胶裂解酶的分子量相近，大约为30，000左右，但它们的最适pH值差别较大。 例如，从黑曲霉生产的果胶裂解酶的最适pH是6(0左右(而从镰刀霉菌分离的 酶的最适pH值是8(6。 果胶酯酶、聚半乳糖醛酸酶、聚甲基半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶和 聚甲基半乳糖醛酸裂解酶的作用模式如图1(4所剥;271。 暴胶酯酶 , , + 嚼嚼嚼睡嚼 铎锫聚露卿昏黼母 雉啄黼辱一再一辱商商酶母臁雉潜雉 睫嘬嚼拇铎 聚甲基半乳糖醛酸裂解酶 图1-4果胶酶作用机制 1(2(2果胶酶在果汁加工中的作用 果胶酶是果汁加工中应用的最重要的酶。现在已广泛用于苹果汁、葡萄汁、 柑橘汁等的生产加工中。 食品中常用的果胶酶来源于真菌，20世纪30年代人们已经知道了真菌酶能使 行系统的研究。研究发现苹果汁的混浊是由带负电的部分脱甲氧基的果胶与带正 电的蛋白质核缠绕在一起，-形成以蛋白质为核、果胶为壳的复核结构 图1(5(a ， 果胶酶的澄清机理是破坏果胶外壳使带正电的蛋白质部分外露 图1(5(b ，外部带 负电的混浊颗粒将发生静电攻击，形成大颗粒而沉淀 图1(5(c I?29】。为了获得出 汁率高及澄清效果好的果汁，果胶酶处理已成为加工澄清果汁所必需的步骤[30-33]。 果胶酶在果汁加工中的作用主要可以概括为以下两点13?7】: 1 使细胞间层的原果胶部分分解，降低果汁粘度，改善果浆的压榨性能，提 高出汁率，缩短压榨时间; 2 分解起悬浮稳定作用的果胶，使果汁中的悬浮颗粒絮凝沉降，提高澄清效 J。 果，防止后混浊产生，保证果汁品质[38-41 果胶蛋白质 a b C 图1(5果汁中果胶(蛋白质的絮凝机理 2酶的周定化 2(1固定化酶的发展简史 酶不溶于水而显示催化活性这一现象，虽然早就为人们所熟知，但是并没有 人积极地开展酶的固定化研究工作。真正开始有效地研究、利用并积极开展固定 淀粉酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等结合固定在重氮化聚氨苯乙烯树脂上，第一次 实现了酶的固定化。之后，人们就开始了固定化酶的研究工作，进入60年代，以 大量的研究工作。1969年日本的千烟一郎博士首先将固定化氨基酰化酶应 用于DL- 氨基酸的光学拆分上，实现了酶连续反应的工业化，开创了固定化酶应用的新纪 元【42】。 enzyme 是借助物理方法或化学 eIlzvme 的名称142】。所谓固定化酶( immobilized 方法将酶固定于水不溶性或者水溶性载体而制成的一种酶制剂形式【43删。酶的固 7 of 定化 immobilization enzymes 是指通过某些方式将酶和载体相结合，酶 被载 体材料束缚或限制于一定区域内进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的 一类技术【45郴】。研究证明，很多酶固定化后，更趋稳定，依靠过滤和离心等简单 的方法，就可以将酶和底物分开，这样不仅可以在较长时期内反复使用，而且可 以运用装柱等连续运转方式生产。目前，固定化酶的研究领域已涉及到生物工程、 医药工程、食品工程、生命科学、高分子材料、化学工程等许多相关学科[44,48-54】。 2(2固定化酶的特点 与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同 时，还呈现稳定性高，对抑制剂的敏感性降低，有的酶具有了抗蛋白酶分解的特 性:酶与产物的分离回收容易、可多次重复使用;可以对反应进行精确控制，反 应可随时中止、启动，恒态反应可保证产品的质量稳定;适应多酶系同时反应或 继时连续反应:连续操作及自动化控制、工艺简便，且产品中不会带进酶蛋白或 细胞，提高酶的利用效率，降，氐生产成本等一系列优点。它在应用上和理论上的 巨大潜力吸引了诸多领域的科研机构及企业科技部门研究人员的注意力，成为现 代酶工程领域的研究热点，在固定化载体与固定化方法的研究上都取得了诸多进 展，固定化酶的种类也日益扩展【55‘58J。 2(3酶的固定化方法 酶固定化的方法很多，主要包括吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法等 [42小，56j9】 图2-1 。 露(诵圈 @? 桊 吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法 图2-1固定化酶的方法 互作用而达到固定化目的的方法。根据吸附剂的特点又分为两种:物理吸附 physicaladsorption 和离子交换吸附 ion 键和p一电子亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载体上的方法。常用的 载体有: 高岭土、皂土、硅胶、微孔玻璃、纤维素、赛珞玢和火棉胶等。离子交换吸附法 是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基团的相 互作用而达到酶固定化的方法。常用的载体有:CM(纤维素、DEAE(纤维素、DEAE( 葡聚糖凝胶等。工艺简便及条件温和是吸附法的显著特点，其载体选择范围很大， 涉及天然或合成的无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化; 酶失活后可重新活化，载体可以再生【20,60-63l。吸附法也有许多不足，如酶量的选择 全凭经验，pH值、离子强度、温度、时间的选择对每一种酶和载体都不同，酶和 载体之间结合力不强易导致催化活力的丧失和玷污反应产物等。 covalent 2 共价偶联法 covalent binding 共价偶联法是借助共 coupling，or 价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联制备以固定化酶的方 法144,601。由于酶与载体间连接牢固，不易发生酶脱落，有良好的稳定性及重复使 用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法，其常用载体包括天然高分子 材料 纤维素、琼脂糖、淀粉、葡萄糖凝胶、胶原及衍生物等 、合成高聚物 聚丙 烯酰胺、聚苯乙烯、尼龙、多聚氨基酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等 和无机载体 多孔玻璃等 fM】。 交联法是利用双功能试剂或多功能试剂 3 交联法 crosslinking multi(functional bifunctionalor reagent 在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子 与载体问进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法【44,60】。常用的双功能试剂 有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐等，其中应用最广泛的是戊二醛。戊二醛有两 个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应(形成席夫 schifE 碱，而 使酶交联，制成固定化酶。交联法制备的固定化酶结合牢固，可以长时间使用。 但由于交联反应比较剧烈，酶分子上的多个基团被交联，致使酶活损失较大。为 此，将交联法与吸附法或包埋法联合使用，可取长补短168’7”。 反应条件温和，很少改变酶结构的固定化方法M邡l。其基本原理是单体和酶溶液 混合，再借助引发剂进行聚合反应，将酶固定于载体材料的网格中。固定化时保 护剂和稳定剂的存在不影响酶的包埋产率。这种酶包埋在高聚物内的方法对大多 数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都适用。包埋法又分为凝胶包埋法和微囊 化法。凝胶包埋法是将个别酶分子包在高聚物格子中，可以将块状聚合形成的凝 9 胶切成小块，也可以直接包埋在珠状聚合物中，后者可以使固定化酶机械强度提高 10倍，并改进酶的脱落情况。微囊化法是将酶溶液或悬浮液包裹在膜内，膜既能 使酶存在于类似细胞内的环境中，又阻止酶的脱落或直接与微囊外环境接触。小 分子底物则能迅速通过膜与酶作用，产物也能扩散出来。此法包埋的酶量很多， 。 在医学上具有很大的应用可能性， 因此越来越受到人们的注意f。72。75j。 表2-1给出了这些酶固定化方法间的比较，如交联法与共价结合法因为较剧烈 的共价反应而使酶活力损失较大，包埋法中高分子凝胶或半透膜的分子尺寸选择 性不利于大分子底物与产物的扩散，吸附法中由离子键、氢键、偶极键及疏水键 固定的酶易受反应介质pH、离子强度等的影响而从载体上脱落H4]。这些不足限制 了固定化酶的广泛应用，成为亟待解决的主要问题。因此，开发简便、温和、适 用的固定化方法，合成性能优异且可控的载体，以及应用工艺的优化研究等 使酶的固定化研究目前仍是关注的热点之一。 表2-1各种固定化方法的比较 3离子交换树脂 3(1离子交换树脂概述 离子交换树脂是一类能显示离子交换功能的高分子材料。它是由在交联结构 的高分子载体上以化学键结合着各种离子基团 即所谓固定离子 和其反离子而 组成。反离子在溶液中可以解离，并在一定条件下可与其它符号相同的离子发生 交换反应。因离子交换反应一般是可逆的，在一定条件下被交换的离子可以被再 交换，使离子交换树脂又恢复到原来的离子式，所以，离子交换树脂通过交换和 再生可以反复利用。 离子交换现象的发现至今已有100余年的历史了，最早在十八世纪中期 1948 们仅仅限于天然的钠沸石、磺化煤等材料的应用，随着工农业的迅猛发展， 这些 lo 研究合成了具有离子交换功能的高分子材料，即第一批离子交换树脂――聚酚醛 系强酸性阳离子交换树脂和聚胺醛系弱碱性阳离子交换树脂。六十年代离子交换 聚合新方法，合成了一系列物理结构和过去完全不同的大孔结构离子交换树脂。 这类树脂除具有普通离子交换树脂的交换基团外，同时还有像无机和碳质吸附剂 及催化剂那样的大孔型毛细孔结构，使离子交换树脂兼具了离子交换和吸附的功 能，为离子交换树脂的广泛应用开辟了新的前景【7“。 3(2离子交换树脂的分类 目前，使用的离子交换树脂绝大多数都是以苯乙烯一二乙烯苯共聚体或丙烯 酸及其衍生物与二乙烯苯的共聚体为基体。因交换基团性质的不同，离子交换树 脂可分成两大类:可与溶液中的阳离子进行交换反应的称阳离子交换树脂，其中 的阳离子包括氢离子及金属阳离子;可与溶液中的阴离子进行交换反应的称阴离 子交换树脂，其中的阴离子包括氢氧根离子及其它酸根离子等。因此，离子交换 树脂实际上是一种不溶的高分子酸或碱或盐。和低分子酸、碱一样，根据它们的 反离子解离程度的不同，离子交换树脂又分为强酸型、弱酸型、强碱型、弱碱型 [76，771。 3(2(1强酸型阳离子交换树脂 一”? 这是指在交联结构高分子基体上带有磺酸根的离子交换树脂。若以R代表高分 子基体，这种树脂可用R--S03H表示，它在水溶液中解离如下: R―SOjH―R―so;+H’ 其酸性相当于硫酸、盐酸等无机酸，它在碱性、中性、甚至酸性介质中都显示离 子交换功能【78-SOl。以苯乙烯一二乙烯苯共聚球体为基础的强酸型阳离子交换树脂， 是用途最广、用量最大的一种离子树脂。 3(2(2弱酸型阳离子交换树脂 11 COOH cooH 交换树脂，其中以含羧酸基的弱酸型树脂用途最广。含羧酸基的阳离子树脂和有 机羧酸一样在水中解离程度较弱，在10-5,10_7之间，显弱酸性，其解离如下: R―COOH―R―C00一+日+ 它仅能在接近中性和碱性介质中才能解离而显示离子交换功能。含羧酸基的 弱酸型离子交换树脂常是用甲基丙烯酸甲酯或丙烯酸甲酯与二乙烯苯 DVB 悬 浮共聚而后水解，亦或用水解顺丁烯二酸酐与DVB、丙烯腈与DVB、丙烯酸乙 酯与丙烯腈与DVB等的共聚物的方法178J9】制得。高的交换容量、容易再 生、以 及对二价金属离子具有较好选择性是这种阳离子交换树脂的重要特点。 3(2(3强碱型阴离子交换树脂 以季铵基为交换基团的离子交换树脂称强碱型阴离子交换树脂，可分 为I型 强碱型阴离子交换树脂和II型强碱型阴离子交换树脂。 cH03c|_ 一C CHa 2 一 Cl 1I型 c爿40H 这种树脂在水中解离如下: R-南锺吖一吣+,毫R„。 其碱性较强，相当于一般季铵碱，它在酸性、中性、甚至碱性介质中都可显离子 交换功能。 3(2(4弱碱型阴离子交换树脂 子交换树脂。这种树脂在水中解离程度很小而呈弱碱型: R―NIX2+H20一R―NH;+OH一 它只在中性及酸性介质中才显示离子交换功能。 常用的阴离子交换树脂，多用苯乙烯一二乙烯苯共聚微球经氯甲基化再胺化 而得。当用三甲胺胺化时，得到I型强碱型阴离子交换树脂:用二甲基乙醇胺胺 化时，得到II型强碱型阴离子交换树脂，它们的碱性都很强，不仅可交换一般无 机酸根阴离子，也可交换吸附硅酸，醋酸那样的弱酸。当用伯胺或仲胺胺化时， 可制得弱碱型阴离子交换树脂。这种树脂碱性较弱，只能交换盐酸、硫酸、硝酸 这样的无机酸阴离子，而对硅酸等弱酸几乎没有交换吸附能力。较高的交换容量 和容易再生是弱碱型阴离子交换树脂的重要特点。 3(3离子交换树脂的功能 离子交换树脂的功能主要有离子交换、吸附、催化、脱水、脱色等181驯。 1 离子交换 这是离子交换树脂的最基本的功能。当离子交换树脂与电解质溶液接触时， 树脂粒子的反离子就会离解，并与电解质溶液中的离子发生离子交换反应。 离子 交换反应通常是平衡可逆的，反应方向受到树脂交换基团的性质，溶液中离子的 性质、浓度、溶液pH值、温度等因素的影响，利用这种可逆平衡性质，可以使交 换饱和的离子交换树脂得到再生而反复使用。 2 吸附作用 离子交换树脂与溶液接触时，还有从溶液中吸附非电解质物质的功能，这种 功能与非离子型吸附剂的吸附行为有些类似，同时这种吸附作用也是可逆 的，可 用适当的溶剂使其解吸。 O 催化作用 离子交换树脂就是高分子酸、碱，所以它和一般低分子酸、碱一样对某些有 机化学反应可起催化作用，已有用离子交换树脂作酯化反应、烷基化反应、烯烃 水合、缩醛化反应、水解反应、脱水反应，以及缩合反应等催化剂181”】。与一般 低分子液体酸、碱作催化剂比较，用离子交换树脂作催化剂的明显优点是:反应 生成物与催化剂易于分离，使反应后的处理大大简化;树脂对设备没有任何腐蚀 性等。 f41脱水作用 离子交换树脂中交换基团是强极性的，有很强的亲水性，因此，干燥的离子 交换树脂有很强的吸水作用。 5 脱色作用 色素大多数为阴离子性物质或弱极性物质，可用离子交换树脂除去。用离子 交换树脂脱色的优点是:反复使用周期长，使用方便。 4磁性高分子微球的研究进展 磁性高分子微球是指通过适当的方法使有机高分子与无机磁性物质结合起来 形成的具有一定磁性及特殊结构的微球。它是近二十年来发展起来的一种新型功 能高分子材料。磁性高分子微球可以通过共聚、表面改性等化学反应在微球表面 引入多种反应性功能基 如羟基、羧基、醛基、氨基等 ，并可进一步通过共价键结 合酶、细胞、抗体等生物活性物质。在外加磁场的作用下，进行快速运动或分离。 因而，磁性高分子微球作为新型功能高分子材料，在生物医学 临床诊断、酶标、 靶向药物 、细胞学 细胞标记、细胞分离 及生物工程 酶的固定化 等领域有着广泛 的应用前景【85-90l。 411磁性高分子微球的结构类型 磁性高分子微球一方面要求具有较强的磁性，另一方面需要表面携带能与亲 和配基共价键合的有机活性功能基团，生物来源的磁性高分子微球一般很难获得， 有机化合物磁性材料尚处在实验室探索阶段，目前普遍采用的是无机磁性超微颗 粒与有机高分子化合物形成的复合材料。磁性颗粒的种类很多，较常用的有金属 和氮化铁 Fe4N 等，其中Fe304是应用最多的磁性颗粒，它很容易在水溶液中沉淀 14 铁盐溶液与高铁盐溶液按一定比例在碱性条件下共沉淀合成的纳米级化aonm Fc304具有超顺磁性。与磁性颗粒复合并提供活性功能基团的有机高分子化合物分 天然的和合成的两种，常用的天然高分子有蛋白质、纤维素、壳多糖、葡聚 糖和 磷脂类等，合成亲水性高分子如聚乙二醇、聚丙烯醛、聚丙烯酰胺等，疏水性高 分子如聚苯乙烯等，此外，硅烷衍生物也是包裹磁性颗粒的一类重要有机硅化合 物。 磁性颗粒与有机高分子形成的复合结构与磁性高分子微球的制各方法有关。 一般可分为以下三种结构: 1 以高分子材料为核、磁性材料为壳层的核,壳式结 f31内、外层皆为高分子材料，中间层为磁性材料的夹心式结构 图4(1c [91,92】。 质 , , 一?一 蝴木一(十|l貅 一穴,一 a b C 图4-1磁性高分子微球的结构类型 4(2磁性高分子微球的制备方法 磁性微球的制备方法主要包括包埋法、单体聚合法、活化溶胀法和生物合成 法四类。 4(2(1包埋法 包埋法是制备磁性高分子微球最早的一类方法，它将磁性粒子分散于高分子 溶液中，通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段得到磁性高分子微球【93,941。 其中， 磁性粒子的制备有两种途径: 1 共沉淀，反应原理为: 2 沉淀氧化，反应原理为:Fe2++20H Fe on 2上 1I+3H20 3Fe OH 2+H202-+Fe304 在反应过程中，向反应溶液中加入高分子，高分子吸附在Fe304粒子表 面，形 成高分子包裹的活性磁粒子。由于高分子的包裹，磁性粒子的表面自由能降 低， 小磁性粒子问的相互聚集受阻，有利于磁性高分子微球的形成。包埋法制 备磁性 高分子微球所需的条件简单，易于进行，但制得的粒子粒径分布宽，形状不 规则， 粒径不易控制，壳层中难免混杂一些诸如乳化剂之类的杂质，极大的限制了磁性 微球的应用。 4(2(2单体聚合法 单体聚合法是在磁性粒子和有机单体存在的条件下，加入引发剂、表面活性 剂、稳定剂等物质聚合而成的核,壳式磁性高分子微球。目前，单体聚合法合成磁 性高分子微球的方法主要有以下几种，如悬浮聚合、乳液聚合 包括无皂乳液聚合、 种子聚合1、分散聚合等。 1 悬浮聚合Tsurutal951首先制得了磁流体、单体、引发剂、分散剂的悬浮液， 在搅拌的同时施加低频超声波分散，然后聚合得到粒径范围为O(1至数十个微米的 磁性高分子微球，其粒径大小随超声波的频率而变化。Daniel[96】等采用微悬浮聚合 得到了粒径范围为0(O弘m,私m的磁性高分子微球，但所得磁性微球中的磁性无 机微粒倾向于迁移至微球的四周。 2 乳液聚合乳液聚合是目前应用较多的一种制备磁性高分子微球的方法， 它包括无皂乳液聚合、种子乳液聚合等方法。sold95】在分散有磁性粒子的水相体系 中乳化单体，得到稳定的乳化体系，然后应用乳液聚合得到了胶体尺寸的疏水磁 性高分子微球。邱广明等I97]对乳液聚合法进行了改进，采用吸附(溶胀 的方法得到 了单分散性好，具有良好机械稳定性和耐酸性的磁性高分子微球。 3 分散聚合分散聚合是指一种由溶于有机溶剂 或水 的单体通过聚合生 成不溶于该溶剂的聚合物，而且形成胶态稳定的分散体系的聚合方式。李孝红等【98】 利用分散聚合法，以水,乙醇为分散介质，合成了含有(COON、(OH、(CHO等不同 表面功能基的核(壳型磁性复合胶乳微球，并研究了分散介质、引发剂、聚合单体、 种子粒径等因素对复合微球形成的影响。随后，其课题组还制备出热敏性的磁性 聚苯乙烯,N(异丙基丙烯酰胺 P St,NIPAM 微球【魄100】。 4(2(3活化溶胀法 。 活化溶胀法 activated 制备混合结构型单分散超顺磁性聚合物微球的有效方法[91,9Zl。Ugelstad法制备磁性 聚合物微球一般包括四个步骤:n 采用种子聚合技术制备单分散大孔型聚苯乙烯 微球; 2 对微球孔内、外进行磺化 (s03 或硝化 (N02 以使其具有亲水性界面; 3 浸泡微球于铁盐水溶液中，在适当的反应条件下使超顺磁性Fe304在孔内合成; 4 选用一种含活性功能基团的单体对微球进行溶胀、聚合、包被，使微球孔道封闭， 表面功能化。重复第三步操作可以使微球中的磁性颗粒含量达到需要的水平。用 上述方法处理后可得到粒径均匀、悬浮性好的磁微球。 4(2(4生物合成法 自然界中存在一些趋磁微生物，它们沿着地球磁力线移动时可以在体内合成 生物膜包被的直径为20,100nm的超微磁粒体。将其从菌体中分离出来用于固定 化酶可以获得很高的酶活性，也可连接抗体用于免役检测【91，21。细菌磁性粒子具 有形状小、均匀、机体适应性好的特点。生物来源的磁性分离载体由于大规模发 酵、培养尚存在一些问题，分离也比较困难，目前主要应用于分析研究。 4(3磁性高分子微球的应用 由于磁性微球粒径小，比表面积大，因此偶联容量大，悬浮稳定性好，便于 与目标产物高效地偶联:又因磁性高分子微球具有磁性，在磁场作用下可定向运 动到特定部位，或迅速从周围介质中分离出来。这些性能使其具有极广阔的应用 前景，因而在细胞分离、固定化酶、靶向制剂、生物传感器等诸多领域有着广泛 的应用【101。103】。 4(3(1细胞分离 磁性微球作为不溶性载体，在其表面接上具有生物活性的吸附剂或其它配基 如抗体、外源凝结素等 ，利用它们与目标细胞的特异性结合，可在外加磁场的作 用下将细胞分离分类【1呻1吲。 细胞的标记与分离是磁性高分子微球最早的应用研究之一，自70年代 以来便 有众多的学者致力于该领域的研究。Molday等191l将平均粒径为4?J1】的磁性微球用 于脾脏细胞中B细胞的分离。另外，Rembaum等四将磁性聚戊二醛微球标记分离人 血红细胞。可分离除去超过95,的未标记细胞。 (3(2固定化酶 4 运用磁性高分子微球作为固定化酶的载体，具有以下优点【1叫: 1 有利于固定 化酶从反应体系中分离和回收，操作简便。对于双酶反应体系，当一种酶的失活 较快时，就可以用磁性材料来固载另一种酶，回收后反复使用，降低成本; 2 磁 性载体固载酶放入磁场稳定的流动床反应器中，可以减少持续反应体系中的 操作， 适合于大规模连续化操作; 3 利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方 式和方向，替代传统的机械搅拌方式，提高固定化酶的催化效率。De(ShengJiang 等【埘】采用反相悬浮聚合法制得磁性壳聚糖微球，并以此为载体，戊二醛为交联剂 对漆酶进行固定化，研究发现，磁性固定化漆酶的热稳定性、操作稳定性及贮藏 稳定性有极大提高。邱广亮等【1聃1采用乳化复合技术制得磁性淀粉复合微球，并以 此微球为载体，采用溴化氰共价结合法、戊二醛交联法、物理吸附法固定a一乙酰 乳酸脱羧酶，并将其用于啤酒发酵具有明显降低双乙酰的效果，而且由于其具有 磁性，可通过施加外磁场方便简单地与酒液分离，而不影响啤酒风味，缩短生产 17 周期，大大降低成本。 4(3(3靶向制剂 磁性药物微球是磁性药物制剂的一种类型，是靶向给药系统的新剂型。在磁 性纳米粒子表面涂覆高分子，再与蛋白质相结合。以这种磁性纳米粒子作为药物 的载体，然后静脉注射到动物体内，在外加磁场下通过纳米微粒的磁性导航，使 其移向病变部位，就可达到定向治疗的目的。磁性微球给药载体的特点:f11将药 物随着载体被吸附到靶区周围，使靶区很快达到所需浓度，在其它部位分布量相 应减少，因此可以降低给药剂量; 2 药物极大部分在局部作用，相对减少了药物 对人体正常组织的副作用，特别是降低对肝、脾、肾等造血和排泄系统的损害;f3 加速产生药效，提高疗效。 4(3(4生物传感器 核酸杂交技术是分子生物学研究中最常用和最基本的检测方法之一，因此， 围绕该技术的新方法研究一直是人们感兴趣的问题。近年来，随着电子学、微电 子学及计算机技术的发展，相继有一些新的核酸检测方法的建立。杨清娟等【1091报 道了用戊二醛将氨基修饰的寡核苷酸探针固定于氨基磁珠表面制成核酸传感器。 传感器与生物素标记的DNA杂交，再利用亲和素(生物素偶合系统，偶联上亲和 素标记的碱性磷酸酶。碱性磷酸酶催化底物a(萘酚磷酸酯水解形成具有电化学活 性的a(萘酚，再用示差脉冲伏安法测定杂交结果，此法测得短链DNA片断的浓度 线性范围为lO,1000ug,L，最低检测限为3ug,L。 5(利用离子交换树脂固载果胶酶的提出和研究内容 20世纪70年代，出现了磁性高分子微球，磁性高分子微球是指通过适当的方