活血化瘀汤对体外培养成骨细胞骨形成功能的影响

活血化瘀汤对体外培养成骨细胞骨形成功能的影响 专 业:中医骨伤专业 研究生:曾勤 导 师:张俐 副教授 摘 要 目的:观察中药活血化瘀汤对体外培养成骨细胞骨形成功能的影响，以探讨活血化瘀汤及活血化瘀法促进骨折愈合的作用机理。 方法:采用胰酶,胶原酶消化法从新生SD大鼠颅骨获取成骨细胞，进行原代、传代培养，取第二代细胞经过鉴定后作为实验模型，将不同浓度的活血化瘀汤提取液和载药血清与分离培养制得的新生大鼠颅盖骨第二代成骨细胞共同培养。提取液直接刺激实验和载 观察对成骨细胞增殖功能的影响(用波长490nm处OD药血清实验均按照设计分别用MTT法 值示)和氨基安替比林测酚法(金氏法)观察对成骨细胞分化功能的影响(用碱性磷酸酶活性表示);提取液直接刺激实验用茜素红染色法(ARS法)观察对成骨细胞矿化功能的影响(用每视野矿化结节数表示)。 结果:采用胰酶,胶原酶消化法，进行体外细胞培养，可以获得比较纯化的成骨细胞。加药培养3d后测定细胞增殖结果显示:一定浓度的活血化瘀汤提取液和载药血清均能促进成骨细胞的增殖。其中提取液实验在100-5000μg/ml浓度范围内的促进作用呈现剂量依赖方式，与对照组相比，100μg/ml和500μg/ml药液即可促进成骨细胞增殖,但与对照组比较差异不显著(P>0.05)，1000μg/ml和5000μg/ml药液与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)，以5000μg/ml浓度最为显著(P<0.01)，10000μg/ml浓度则呈现抑制作用。载药血清实验中10%与20%载药血清与空白血清对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。加药培养5d后测定碱性磷酸酶(ALP)活性结果显示:不同浓度的提取液和载药血清均能促进成骨细胞的分化，其中提取液实验中ALP活性与对照组比较以5000μg/ml浓度差异最为显著(P<0.01)，载药血清实验中10%载药血清与对照组比较有显著性差异(P<0.05)，而20%载药血清与对照组比较有极显著差异(P<0.01)。加药培养18d后矿化结节计数结果显示:各浓度中药提取液组矿化结节形成数与对照组比较差异没有显著性(P>0.05)。 结论:活血化瘀汤促进体外培养成骨细胞早期的增殖与分化从而促进骨形成。促进成骨细胞的骨形成功能是活血化瘀汤及活血化瘀法促进骨折愈合的机理之一。实验结果提示 1 我们在临床骨折的治疗方法上应该分期辨证，活血化瘀汤适用于骨折的早期。 主题词: 活血祛瘀剂/药理学 细胞培养/方法 成骨细胞/药物作用 骨折愈合/药物作用 大鼠 @活血化瘀汤 Effects of Huo Xue Hua Yu (HXHY) Decoction to Bone Formation Function of Cultured Osteoblast in Vitro Major: Orthopedics and Traumatology of TCM Postgraduate: Zeng Qin Tutor: Prof. Zhang Li ABSTRACT Objective: To observe the effects of Huo Xue Hua Yu(HXHY) decoction to bone formation function of cultured osteoblast which was from the skull of newborn SD rat in vitro, in order to explicate the mechanism by which HXHY decoction and HXHY method act on fracture healing. Methods: To obtain osteoblasts from neonatal SD rat’s skull adopting the method of Collagenase,pancreatic enzyme digestion, conduct primary culture and sub-culturing，take the second generation cells as experimental model after identification, and then respectively culture these cells with different concentrations of the HXHY extracted fluid and drug-containing serum fluid together. Both of two experiments took the same method as function of cell proliferation was measured by MTT method(OD value at wave-length 490nm)and function of cell differentiation was measured by Golden’s method(ALP activity). Directly incentive experiment used alizarin red staining method to measure function of cell mineralization (mineralized nodes/field of vision). Results: Relatively rarefied osteoblasts could be obtained by means of cell culture in vitro using the method of Collagenase,pancreatic enzyme digestion. Three days after communal cultivation, certain concentrations of HXHY extracted fluid and drug-containing serum could stimulate the proliferation of the OB, and the former acted in dose-dependent manner in field 2 2 of 100-5000μg/ml. Contrast with the control group, HXHY groups could promote the proliferation of the OB in the concentration of 100μg/ml and 500μg/ml whereas they had 2 insignificant difference with control group(P>0.05).1000μg/ml and 5000μg/ml groups had significant difference (P<0.05),especially the 5000μg/ml group(P<0.01), 10000μg/ml group showed descending tendency .Both of the 10% and 20% of drug-containing sera had significant difference with blank drug serum control group(P<0.05).Five days later, the activity of alkaline-phosphotase was more or less increased in experimental groups which were compared with control group respectively,5000μg/ml group had the striking result(P<0.01).Experiment of Drug-containing serum showed that 10% of drug-containing serum group had significant difference (P<0.05), and 20% of drug-containing serum group had even significant difference (P<0.01).Eighteen days later, there was insignificant difference between the experimental groups and control group according to the effects on mineralization (P>0.05). Conclusions:HXHY decoction can promote bone formation by accelerating the proliferation and the differentiation of osteoblast in vitro in early period. Promoting bone formation function of cultured osteoblast is one of the mechanism by which HXHY decoction and HXHY method effectively promote fracture healing. Results also suggest us that we should differentiate the symptoms and signs by stages while we treat the fracture clinically. HXHY decoction is fit for treating the fracture in early period. MeSH Term: Blood act stasis remove agent/pharmacology Cell culture/methods Osteoblasts/drug eff Fracture healing/drug eff Rats @Huo Xue Hua Yu Decoction 3 活血化瘀汤对体外培养成骨细胞骨形成功能的影响 专 业:中医骨伤专业 研究生:曾勤 导 师:张俐 副教授 前 言 骨折愈合是一种特殊类型的创伤愈合反应，而成骨细胞在骨折愈合过程中对骨组织的损伤修复起关键作用。其合成和分泌I型胶原蛋白和多种非胶原蛋白，在全身和局部细胞 [1]因子调节下，能分泌类骨质和碱性磷酸酶等促矿化物质，从而促进新骨形成。骨折愈合 [2]的关键依赖于成骨细胞的大量增加。骨折愈合又是一个极其复杂的生物学修复过程，虽 [3]然大多数的骨折都能顺利愈合，但仍有5%-10%的骨折发生延迟愈合或不愈合。骨折不愈 [4]合的原因之一可能是骨折端渗出液中成骨细胞生长活力降低所致。因此，如何提高成骨细胞的功能，加速骨折的愈合，是骨科领域研究的重要课题之一。 活血化瘀法是临床常用的骨折治疗方法。中国传统医学理论认为“血不活则瘀不能去，瘀不去则骨不能续”，“瘀去、新生、骨合”是一个连续的过程，这一观点已得到现代病 [5]理学观点的支持。活血化瘀中药能加速骨折愈合也早已被实验和临床所证实。既往的研究显示活血化瘀法及中药促进骨折愈合的机理在于可以加快微循环血流速度,增加毛细血管网的通透性,清除血凝块，使断端产生良好血供，为骨折的愈合提供营养及清除代谢产 [6、7、8]物,从而加速骨折的愈合。但是，其细胞学作用机制还有待于进一步研究。活血化瘀汤是林如高老先生的经验方，由蒲黄、姜黄、当归、泽兰、茜草、三七、红花、莪术、生地、赤芍、紫苏、甘草等组成。方中蒲黄、姜黄、当归、泽兰、茜草、三七、红花、莪术活血通经，散瘀止痛;生地、赤芍清热凉血;“气行则血行”，故用紫苏、甘草行气宽中，以活络筋腱，消瘀退肿。福建省人民医院采用此协定处方广泛应用于治疗骨折疾患，取得 4 了良好的临床治疗效果。其促进骨折愈合的确切作用机理值得探讨。中药促进骨折愈合的机理是一项极为复杂的过程,目前应用现代科学技术手段和方法阐明其机理是探讨中药促进骨折愈合的理想方法,特别是应用细胞生物学和分子生物学的方法,成为一种发展趋势[9]。在细胞和分子水平上来观察加速骨折愈合的研究,着重于作用机制的探讨,使临床药物 [10]治疗成为促进骨折愈合的有效方法,应是目前主要研究的方向。体外细胞培养是医学研究的重要手段，细胞组织培养技术已成为研究成骨细胞起源、形态、生化特性、分化发育及代谢调节等的重要工具。多年来，用于研究成骨细胞培养模型多采用新生大鼠颅盖骨成骨细胞(2,3代)，对体外培养成骨细胞的研究目前主要集中在活血祛瘀和补肾壮骨这两 [11]类骨科常用中药方面，本研究通过体外培养观察活血化瘀汤对成骨细胞骨形成功能的影响，从细胞水平探讨活血化瘀汤及活血化瘀法促进骨折愈合的作用机理，丰富了活血化瘀法治疗骨折的理论依据，也为临床进一步开发活血化瘀类药物治疗骨折提供实验依据。 材料与方法 1 实验动物 1.1 新生1-2日龄清洁级的SD大鼠2只，用于成骨细胞原代培养。由福建医科大学实验 -010(质)号。医学实验动物设施条件动物中心提供。实验动物合格证书号:医动字第23 合格证号:闽实动条准第2000,01号。 1.2 体重320?10g雄性清洁级SD大鼠20只，用于制备含药血清。由中科院上海实验动物中心提供。实验动物合格证书号:SCXK(沪)2002,0010。医学实验动物设施条件合格证号:闽实动条准第01,13号。 2 实验药物 [12]2.1 活血化瘀汤提取液的制备: 中药购自回春药店(附方:蒲黄9g、姜黄4.5g、当归9g、泽兰6g、茜草9g、三七6g、红花1.5g、莪术6g、生地9g、赤芍9g、紫苏9g、甘草3g)，经过中药系蔡珍华老师鉴定，福建省第二人民医院制剂科加工。将上述各组方药物充分混合后，加水煎三次，纱布过滤。合并三次所得的滤液，加热浓缩至2:1(药材量:药液量)后，加梯度乙醇沉淀2次(第一次为65%乙醇，第二次为70%乙醇)，滤纸过滤并回收乙醇至尽。继续加热浓缩配制成1g/m1的药液，调PH值至7.0，加1%活性碳脱色3次，精滤，分装，除菌，密封备用，使用时与α-MEM液配成一定浓度的活血化瘀汤培养液。 [13] 2.2 活血化瘀汤载药血清的制备 选择体重大约为320?10g雄性SD大鼠20只，中药组和对照组各10只。用氯胺酮0.1g(2ml)/kg，加地西泮5mg/kg腹腔注射麻醉后在胫骨中段造成闭合骨折，用1.0mm克 5 氏针行髓内固定，,线诊断造模成功(图一)。中药组在造模当天麻醉苏醒起灌服活血化瘀汤(灌胃药液由福建省第二人民医院制剂科加工)，每次3ml，每天2次灌胃;对照组每日同时灌服同剂量生理盐水作空白血清对照，连续灌服7天，处死前1小时各灌胃一天量。用氯胺酮0.1g(2ml)/kg，加地西泮5mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉抽血，制备 0含药血清。无菌分离血清，56C水浴同时灭活30min，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，04C保存，备用。使用时与α-MEM液配成一定浓度的载药血清培养液。 3 实验试剂及配制 3.1 α-MEM培养液[所用试剂:新生牛血清(NCS)，α-MEM培养基，HEPES缓冲液，青、链霉素溶液均为Hyclone(USA)公司生产]: 将培养基按照说明书的要求溶于总量1/3的超纯水中，用水冲洗包装袋内表面2-3次以保证干粉型培养基全部溶解，将含有培养液的烧杯放置于磁力搅拌器上搅拌，按要求添加100u/ml青霉素、100u/ml链霉素溶液、2.38 mg/ml HEPES液，调整PH值为7.0-7.2(用1mol/L NaHCO)，加入超纯水定容至1000ml，最后用孔径0.22μm和0.45μm滤膜过滤除3 菌，其中要求滤膜的光面朝上并且0.45μm滤膜位于0.22μm滤膜之上，分装后冰冻保存。使用前加入新生牛血清配成10% NCS-α-MEM或者加入药物血清配成含10%、20%药物血清的α-MEM培养液。 3.2 PBS-平衡盐溶液的配置和消毒(所用试剂均为分析纯): 准确称量Nacl 8.00g, Kcl 0.20g, NaHPO 1.56g, KHPO 0.20g(对含结晶水的物质2424 经过分子量换算后称量)。将它们置于950ml超纯水中混匀，然后用1mol/L NaHCO调节3PH值到7.2-7.4，最后加超纯水定容至1000ml。将新配置的PBS液分装在500ml玻璃瓶 0中，并注明名称、配置时间。最后0.1MPa 30分钟湿热消毒灭菌，4C冰箱保存备用。 3.3 0.25%胰蛋白酶溶液的配置和消毒(Sigma公司生产，北京华美公司分装): 称取胰蛋白酶粉末1g于烧杯中加入少许的PBS液定容至100ml搅拌均匀，置室温4小时或冰箱过夜，并且不时搅拌振动。将其用PBS液稀释成1:4(即1份胰蛋白酶加3份 6 PBS液)即得到0.25%的胰蛋白酶溶液。过滤除菌，分装冻存，使用前再用NaHCO调节PH3值至7.2左右。 3.4 0.1%?型胶原酶溶液的配置和消毒(Sigma公司生产，北京华美公司分装): 称取?型胶原酶粉末10mg于烧杯中加入少许的PBS液定容至10ml并搅拌均匀，即得 0到0.1%的?型胶原酶溶液。过滤除菌，4C冰箱保存。 3.5 MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl,Tetrazolium bromide] 溶液的配制和消毒(Sigma公司生产): 称取MTT粉末5mg于烧杯中加入少许的PBS液定容至5ml并搅拌均匀，即得到5mg/ml 0 的MTT溶液。过滤除菌，4C冰箱保存。 3.6 ALP试剂盒由南京建成生物有限公司提供。 3.7 二甲基亚砜(DMSO)由上海生物工程有限公司生产。 3.8 其余试剂(均为分析纯)由福州市台江化学试剂批发公司一次购入。 4 实验仪器和设备 4.1 荧光倒置相差显微镜(IX70)带显微照相机由日本Olympus公司生产。 4.2 CO培养箱(GBB16)由上海力新实业有限公司制造。 2 4.3 超净工作台(SW-CJ-2FD)由江苏苏州净化设备厂生产。 4.4 精密计量天平(AG104)由德国梅特勒公司生产。 4.5 紫外分光光度计(DU650)德国Beckman公司制造。 4.6 酶标仪(ELX808)由美国Bio-Tek公司制造。 4.7 离心机(L,5,A)由上海安亭科学仪器厂生产。 4.8 精密酸度计由德国Beckman公司生产。 4.9 恒温磁力振荡器(SHA,B)由常州国华电器有限公司生产。 4.10 数码显示恒温水浴锅(HH,4)由常州国华电器有限公司生产。 4.11 自动双重纯水蒸馏器(SZ,93)由上海亚荣生化仪器厂生产。 4.12 MILLI-Q Biocel 超纯水装置由美国Millipore公司生产。 5 成骨细胞的原代、传代培养 5.1原代培养 [14]实验参照王洪复等的酶消化分离法分离培养大鼠头盖骨成骨细胞。取新生SD乳鼠1-2天龄2只，75%的酒精中浸泡并且用薄膜封闭，3-5分钟后取出已经死亡的乳鼠，揭去 7 头顶皮肤，剪下头盖骨，并且将头盖骨置入PBS溶液中。清除骨膜、血管等软组织，再用PBS液清洗3次后将洗净的头盖骨剪成1mm×1mm的小片。将小骨片移入0.25%胰蛋白酶中 0(3-5ml)以覆盖为度，37C预消化20分钟后再将组织块移入0.1%?型胶原酶溶液(3-5ml) 0中37C振荡(60次/分)消化90分钟。将消化过的组织液即细胞悬液在1000r/min的离心机上离心10分钟后吸弃上清液，加入培养液吹打沉淀的细胞团块并且加液至10ml，细胞 0计数后分装25ml的培养瓶中置于倒置相差显微镜下观察后放入37C 5%CO培养箱中，原2代培养结束。 5.2传代培养 分离的细胞培养24小时后第一次换液并在倒置相差显微镜下观察，此时可见部分细胞已经贴壁，以后2-3天换液一次，等到汇合长满培养瓶后就开始传代。将培养瓶中液体悉数倒掉后，倒入0.25%胰蛋白酶约2ml以没过瓶的下壁为度，放入培养箱中约3-5分钟后取出置于倒置相差显微镜下观察，发现细胞间隙变宽后即可用弯头吸管吹打瓶壁，使胰蛋白酶将更多的贴壁细胞消化脱落下来，然后往培养瓶中加入约2ml含10%新生牛血清的培养液终止胰蛋白酶的消化作用，再一次用吸管吹打瓶壁，使更多的贴壁细胞脱落下来。用吸管将吹打过的培养瓶内的液体移入到10ml离心管中在1000r/min的离心机上离心10分钟。离心后倒掉上层2/3液体，再加入培养液到4ml，然后进行吹打。吹打后的液体用移液管移到两个培养瓶中，每瓶大约2ml，然后置于倒置相差显微镜下观察细胞情况后放 0入37C 5%CO饱和培养箱中，传代培养完成。 2 6 成骨细胞鉴定 6.1形态学观察 从原代细胞起，使用由日本Olympus公司生产的荧光倒置相差显微镜每日观察培养细胞的形态以及生长情况。 6.2碱性磷酸酶染色 [15]采用改良Gomori氏钙钴法,从培养瓶中取出长有细胞的盖玻片,95%乙醇固定5min, 0蒸馏水冲洗3次,晾干后置于β-甘油磷酸钠的孵育液中, 37C孵育5h,蒸馏水冲洗,加入20g/L的硝酸钴5min置换钙,蒸馏水冲洗后加入10g/L的硫化铵1min,自来水冲洗,5.0g/L伊红溶液复染，倒置显微镜下观察。 6.3矿化结节染色 [15] 采用茜素红法(ARS法)，培养18天后将培养基吸出，用PBS洗板3次，95%乙醇 0固定10min，0.1%茜素红-Tris-Hcl(PH 8.3)溶液37C染色30min，蒸馏水冲洗，干燥，封片，倒置显微镜下观察。 7 观察指标 [16]7.1 成骨细胞增殖功能测定 取第二代生长旺盛的成骨细胞经过消化后以含10%胎牛血清的α- MEM液稀释，调节 40细胞悬液浓度为1×10/ml。以每孔200μl接种于96孔板，在37C 5%C0培养箱中预培2 8 养24h后(吸弃原培养液，换成每孔100μ1无血清培养液，继续培养24h使各孔细胞同步化。弃去培养液之后提取液实验往每孔加入200μl含10%新生牛血清的不同浓度的活血化瘀汤药液(分别为100、500、1000、5000、10000μg/ml)，对照组只加200μl的10%新生牛血清的培养液。以每六孔为各种浓度的一个平行样本;载药血清实验往每孔加入200μl不同浓度的活血化瘀汤载药血清培养液(分别为10%和20%)，对照组只加200μl对应浓度的空白药物血清的培养液。以每八孔为各种浓度的一个平行样本。72h后，弃原 0培养液，PBS液漂洗2次，每孔加入5mg/m1的MTT 100μ1。于37C孵育培养4-6h, 细胞内出现深蓝色晶体后，终止培养，吸弃孔内上清液，每孔加入150u1的二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min使细胞内结晶体完全溶解，直接于DG 3022酶联免疫检测仪490nm波长处比色，测定各孔光吸收值(OD)。 [17]7.2 成骨细胞分化功能测定 取处于生长旺盛的第二代的成骨细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化。α-MEM培养液漂洗 402遍，然后配成l×l0/ml的细胞悬液。将细胞悬液加到24孔板上，每孔1m1。放入37C培养箱中培养。待细胞贴壁后，吸弃原培养液，换成每孔1ml无血清培养液，继续培养 新生牛血清的24h使各孔细胞同步化。弃去培养液之后提取液实验往每孔加入1ml含10%不同浓度的活血化瘀汤药液(分别为100、500、1000、5000、10000μg/ml)，对照组只加1ml的10%新生牛血清的培养液。以每四孔为各种浓度的一个平行样本;载药血清实验往每孔加入1ml不同浓度的活血化瘀汤载药血清培养液(分别为10%和20%)，对照组只加1ml 0对应浓度的空白药物血清的培养液。以每六孔为各种浓度的一个平行样本。37C培养箱内 [18]继续培养，每两天换一次液，5天后收集上清液，取0.1m1用氨基安替比林测酚法测定碱性磷酸酶(ALP)的活性，碱性磷酸酶的活性用金氏单位/100ml表示。提取液实验另取 [19]0.1m1用考马氏亮蓝法测定蛋白含量，结果以每克蛋白中碱性磷酸酶(ALP)活性金氏单位(U/ g?prot)表示。 [20]7.3 成骨细胞矿化功能测定 4将二代生长旺盛的成骨细胞消化计数，按每孔1x10个将细胞加入24孔培养板，培养基1ml。待细胞贴壁后，吸出培养基，换入1ml含50ug/ml维生素C，1mmol/Lβ-甘油磷酸钠的含药培养基。使各组浓度分别为0μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10000μg/ml，每组6孔，隔天换液，培养18天后将培养基吸出，用PBS洗板3次，95%乙醇固定10min，0.1%茜素红溶液染色30min，蒸馏水冲洗，40倍光镜下作矿化结节计数。 7.4 统计学方法 运用SPSS11.0软件包进行数据分析，所有参数均用均数?标准差表示,用t检验检测各实验组与对照组之间的差异。,0.05为差异有显著意义，,0.01为差异有极显著意PP 义。 结 果 9 1 活细胞观察以及ALP和矿化结节染色定性 1.1 一般形态观察: 倒置相差显微镜观察原代培养的细胞在接种4h左右可见部分细胞贴壁，伸展呈现三角形、星形、短梭形或纺锤形等多种形态(图二)，24h左右形态相似的细胞成堆出现。细胞胞浆向外伸展出2-4个突起，有的突起已相互连接(图三)。培养4-5d后细胞融合为单层。细胞形态多为单核、多边形及长梭形，呈“铺路石”样排列(图四)，这些表现均符合成骨细胞的形态特征。 1.2 ALP染色定性: 原代培养7d后,细胞染色显微镜下呈ALP染色阳性反应。细胞膜以及细胞外分泌颗粒因含有大量碱性磷酸酶而被染成灰黑色或黑色(图五)。 1.3 矿化结节染色定性: 培养细胞18d后,茜素红染色显微镜下呈现大小、形态不一的洋红色阳性结节(图六)。 2 对成骨细胞增殖的影响 2.1提取液实验结果显示: 加药培养3d后,100-5000μg/ml浓度范围的活血化瘀汤药液均能促进成骨细胞的增殖，并且呈现剂量依赖方式，与对照组相比，100μg/ml和500μg/ml药液即可促进成骨细胞增殖,但与对照组比较差异不显著(P>0.05)，1000μg/ml和5000μg/ml药液组与对照组比较均有显著差异(P<0.05)，以5000μg/ml浓度差异最为显著(P<0.01),而10000 表1) μg/ml浓度呈现抑制作用。( _表1加入不同浓度的活血化瘀汤提取液对成骨细胞的增殖功能的影响(?S，n=6)x 浓度 (μg/ml) MTT(OD值) 100 0.463?0.339 500 0.467?0.277 *1000 0.496?0.181 **5000 0.527?0.197 10000 0.446?0.195 对照组 0.459?0.263 ***(注:与对照组相比表示P<0.01，表示P<0.05) 2.2 载药血清实验结果显示: 10%与20%载药血清与空白血清对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。(表2) _表2 不同浓度的活血化瘀汤载药血清对成骨细胞的增殖功能的影响(?S，n=8)x 10 MTT(OD值) 组别 10% 20% 空白血清组 0.336?0.022 0.385?0.048 **载药血清组 0.382?0.015 0.420?0.032 ***(注:与对照组相比表示P<0.01，表示P<0.05) 3 对碱性磷酸酶(ALP)表达的影响 3.1提取液实验结果显示: 不同浓度给药组培养5d后，ALP活性均呈不同程度提高，其中1000μg/ml浓度与对照组比较有显著差异(P<0.05)，5000μg/ml浓度与对照组比较差异最为显著 (P<0.01)。(表3) _表3 加入不同浓度的活血化瘀汤提取液对成骨细胞的分化功能的影响(?S，n=4)x 浓度 (μg/ml) ALP (U/g?prot) 100 19.104?0.597 500 19.054?1.494 *1000 19.746?0.369 **5000 20.371?0.328 10000 19.260?0.354 对照组 18.403?0.280 ***(注:与对照组相比表示P<0.01，表示P<0.05) 3.2 载药血清实验结果显示: 10%载药血清与空白血清对照组比较有显著性差异(P<0.05)，而20%载药血清有极显著差异(P<0.01)。(表4) _表4 不同浓度的活血化瘀汤载药血清对成骨细胞的分化功能的影响(?S，n=6) x ALP(金氏单位/100ml) 组别 10% 20% 空白血清组 8.059?0.731 11.244?1.315 ***载药血清组 12.878?1.046 16.535?0.870 ***(注:与对照组相比表示P<0.01，表示P<0.05) 4 对成骨细胞矿化功能的影响 11 各浓度的给药组培养成骨细胞18d后均可见矿化结节的形成，茜素红染色后呈现大小、形态不一的洋红色阳性结节。100-5000μg/m1浓度组的结节形成数与对照组比较差异没有显著性(P>0.05)(表5)。 _表5 加入不同浓度的活血化瘀汤提取液对成骨细胞的矿化功能的影响(?S，n=6)x 浓度 (μg/ml) 矿化结节数 100 17.33?2.066 500 17.67?3.011 1000 18.17?2.137 5000 17.50?2.258 10000 16.17?2.317 对照组 16.83?2.927 ***(注:与对照组相比表示P<0.01，表示P<0.05) 讨 论 1 成骨细胞体外培养和实验方法中的几个问题 1.1 关于成骨细胞体外培养实验 体外实验和体内实验是不可分割的两个方面,体内实验存在许多复杂因素的干扰,不 [21]便于直接观察复方药物的药理作用。体外实验因其需时短、实验条件和因素易于控制、便于进行相对复杂的实验设计等优点,在医学研究中占有举足轻重的位置,并成为许多重大发现的来源。体外细胞培养对于中医药研究具有重要价值,一是可进一步验证和评价药物的疗效,进行有效药物和/或药物的有效成分的初步筛选;二是可以对药物的作用机理进 [22]行更深入的研究。目前利用此方法来研究中药复方正越来越受到重视。采用离体成骨细胞培养技术可观察到药物对成骨细胞的直接作用，这一方法简便易行，结果可靠。体内骨形成包括成骨细胞增殖分化，骨基质分泌，钙盐沉积。已有学者证实体外分离培养的大鼠 [23、24]成骨细胞的成骨过程与体内骨形成过程相同，使应用大鼠成骨细胞为模型的实验的准 确性和可靠性得到了保证。 1.2 关于成骨细胞原代培养方法 [25]60年代初，Peck首次分离培养新生的大鼠成骨细胞，目前这种方法已成为一种重要的实验方法。骨组织中分离成骨细胞由于细胞种类较多、骨组织钙化、骨髓造血组织混杂等因素的影响而导致其分离较为困难。由于新生l-3天鼠颅骨所含细胞数目多、骨组织尚未钙化及骨髓组织尚未形成等优点，因此选用新生1-2天鼠颅骨作为分离材料最为合 [26][27]适。Sanali等研究证实骨组织中各种细胞耐受消化酶能力依成纤维细胞、破骨细胞、骨生成细胞、成骨细胞的顺序而依次增强，因此成纤维细胞、破骨细胞、骨生成细胞在消化过程中首先脱落而存在于第l群细胞之中，而以后消化所得的细胞则以成骨细胞为主， 12 这是本方法采用酶溶液消化分离成骨细胞的基本原理。本实验中培养的细胞具有典型成骨细胞的形态特征，表达高ALP活性，钙化结节染成鲜艳的洋红色，说明用本方法获得的新生大鼠颅盖骨成骨细胞不仅成骨活性好，而且细胞纯度高。完全适合于成骨细胞体外实验的研究。 1.3 MTT法检测细胞增殖原理和意义 在细胞水平上研究细胞的存活和增殖情况，目前主要的检测方法有活细胞计数法、同 [28、29]位素掺入法、MTT分析法。前二种方法易受主观因素影响或使用放射性同位素易造成环境污染，在应用上有一定的局限性。噻唑蓝比色法(MTT法)是一种检测细胞生长和细胞存活情况的新方法。目前认为此法在生物学和医学的许多研究领域中是一种有效的技术手[30]段。其基本原理是在被检测的细胞培养系统中加入MTT,活细胞线粒体中的脱氢酶将MTT分子还原,产生紫色结晶,结晶物的形成量与活细胞数呈正比。二甲基亚砜可以将紫色结晶溶解产生有色透明溶液,通过对有色透明溶液进行比色就可以了解结晶物形成的数量,间 [28]接测定活细胞的数量。不同时间对培养的细胞进行MTT检测有助于了解培养细胞的增殖情况和影响因素。MTT比色分析法测定细胞增殖率，能准确、灵敏地反映药物对成骨细胞 速度增殖和分化功能的影响，进而反映药物对骨形成能力的影响。此方法不受外界干扰, [31]快、精度高、结果稳定,已经广泛应用于药物对细胞增殖影响的研究。在实验中，采用无血清培养基配制药物，且正式实验前，细胞先用无血清培养基培养24h，目的是使细胞回复到G期，保证大多数细胞在给药前处于同一细胞分裂相，既排除了细胞分化状态不0 [32]同而可能引起的增殖差异，又排除了胎牛血清中复杂成分可能对结果所产生的影响。 1.4 关于中药复方现代化药理研究方法 中药复方是指在辨证审因决定治法以后，选择合适的药物酌定用量，按照组成原则妥善配伍而成的一组药物。其所含化学成分复杂、药理作用具有多靶点、多层次的特点，而 [33]且干扰因素众多，因此中药复方药理的研究难度颇大。对于中药复方体外药理研究来说，复方提取物直接添加和制成含药血清间接添加各有优缺点。在实验研究中如把二者紧密结合起来，不仅能够揭示中药复方在胃肠内处置过程中活性成分的转化与改变，而且有利于 [34]中药真正有效活性部位、有效成分的发现，为开发药物奠定基础。因此，我们在采用将 [35]中药提取液直接加入细胞培养液中的方法的同时应用了血清药理学方法，既观察活血化瘀汤原液对成骨细胞的作用，又观察了活血化瘀汤进入体内后的吸收成分对成骨细胞的作用，使实验结果更具说服力。 2 中药活血化瘀汤以及活血化瘀法促进骨折愈合的细胞学机理探讨 骨折愈合是一种特殊类型的创伤愈合反应，能通过骨再生，其中主要是成骨细胞的增殖、分化和矿化从而恢复骨的完整性。骨折后，在血肿吸收后期即开始有新生毛细血管长入，吞噬细胞逐渐为成骨细胞所替代，因此，影响成骨细胞生物学功能的药物无疑对促进骨折愈合具有积极的意义。促进骨折愈合的关键就是促进成骨细胞的骨形成过程。本研究 13 以成骨细胞的增殖、分化以及矿化功能为指标观察活血化瘀汤对体外培养的成骨细胞骨形成功能的影响，对于探讨活血化瘀汤以及活血化瘀法促进骨折愈合的机理有着重要意义。 2.1 对成骨细胞增殖的影响 本研究采用体外细胞培养的方法从细胞水平探讨活血化瘀汤以及活血化瘀法的作用机制。在观察活血化瘀汤对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响时，发现培养3d后一定浓度的活血化瘀汤提取液和载药血清均能促进成骨细胞的增殖。其中提取液实验在100-5000μg/ml范围内呈现剂量依赖方式，当活血化瘀汤提取液浓度为100μg/ml和500μg/ml时，对成骨细胞增殖与对照组比较没有显著性差异。当活血化瘀汤提取液浓度为1000μg/ml和5000μg/ml时，与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)，以5000μg/ml浓度最为显著(P<0.01)，而当提取液作用浓度达到10000μg/ml时出现了抑制细胞增殖的效应。提示活血化瘀汤提取液促增殖作用与药物浓度有关，浓度为5000µg/ml时促增殖作用达到最高峰。载药血清实验中含量为10%和20%的实验组有刺激成骨细胞数量增加的显著作用，已知增殖期是成骨细胞处于恢复代谢和生长的最活跃的时期。成骨细胞增殖率能反映成骨细胞的数量变化。只有成骨细胞数量的不断增加才能产生丰富的骨胶原蛋白和 [36] 非胶原蛋白,从而进一步形成更多的骨组织。活血化瘀汤能够促进体外培养的成骨细胞数量增加，提示我们活血化瘀汤以及活血化瘀法促进骨折愈合的作用部分是通过促进成骨细胞的增殖而实现的。 2.2 对成骨细胞分化的影响 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP或AKP)是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白， [38][37]，碱性磷酸酶在细胞中表达的多少，特异性很高,为成骨细胞分化成熟的重要标志之一 能够反映成骨细胞的分化程度和功能状态。当成骨活动增强时，碱性磷酸酶活性升高，碱 [39]性磷酸酶活性的高表达是成骨细胞分化成熟的早期标志。实验发现活血化瘀汤以及含药血清作用于细胞5d后均可不同程度地促进成骨细胞分泌碱性磷酸酶，提高成骨细胞碱性磷酸酶活性，1000μg/ml和5000μg/ml浓度的药液以及10%和20%的载药血清与对照组相比存在统计学差异。表明活血化瘀汤以及活血化瘀法可以促进成骨细胞早期的分化，从而促进骨折愈合。 2.3 对成骨细胞矿化的影响 [37][40]矿化是细胞进一步分化成熟的功能表现。促进骨矿化的主要细胞是成骨细胞。骨基质矿化的途径为成骨细胞合成并分泌骨的有机质，主要为骨的I型胶原，大量的钙盐沉积在胶原基质内，出现钙化的骨质即矿化结节，矿化结节的形成是成骨细胞体外成骨的早期标志。实验结果显示药物作用于成骨细胞18d后矿化结节的形成与对照组比较差异不具有显著性。表明活血化瘀汤在成骨细胞的矿化期内促矿化作用不明显，对成骨细胞形成矿化结节的直接作用有限。分析原因可能是长期使用活血化瘀药影响了成骨细胞的进一步增殖和分化从而影响了钙盐的沉积。目前研究发现在成骨细胞矿化的早期能检测到成骨细胞 14 因子45(OF45)的表达，在骨组织中OF45的表达可促进基质成熟和提高细胞的矿化能力。 [41]Donna等认为OF45控制着成骨细胞的矿化能力，OF45的表达可作为成骨细胞矿化期的一个重要指征。活血化瘀汤在成骨细胞的矿化期内促矿化作用不明显是否与其影响OF45的表达从而影响了成骨细胞的矿化能力有关,这还有待于今后进一步的研究。总之，实验结果表明虽然中药活血化瘀汤体外对成骨细胞的矿化功能没有明显促进作用，但仍能通过促进成骨细胞的早期增殖与分化来促进成骨细胞的骨形成功能。因此，这可能是活血化瘀汤以及活血化瘀法有效促进骨折愈合的细胞学机理。 3 评价和进一步研究的问题 本实验采用胰酶,胶原酶消化法从新生SD大鼠颅骨获取成骨细胞，进行原代培养、传代培养，取第二代细胞作为实验模型。在采用将中药提取液直接加入实验模型中的方法的同时应用了血清药理学方法，既观察了活血化瘀汤原液对成骨细胞增殖、分化以及矿化功能的影响，又观察了活血化瘀汤进入体内后的吸收成分对成骨细胞增殖、分化功能的作用。实验结果证实其具有促进成骨细胞的早期增殖与分化的作用。实验结果也提示我们在临床骨折的治疗方法上应该分期辨证，活血化瘀汤适用于骨折的早期。如果能够通过体外培养的方法进行筛选，找出对成骨细胞增殖分化有促进作用的药物，则有希望得到促进骨折愈合的更好方法。近年来，骨髓的成骨能力已被许多实验所证实。自体骨髓单独注射在骨折周围。在治疗骨折延迟愈合和不愈合方面已取得了一定的效果。能否利用经过活血化瘀药联合培养的成骨细胞制成悬液再注射于患处。用于骨折早期的治疗，更快更好地促进骨折愈合，还有待于临床进一步开发应用。 结 论 本实验观察了中药活血化瘀汤提取液以及载药血清对体外培养成骨细胞骨形成功能的影响。实验结果表明: 1. 活血化瘀汤促进体外培养成骨细胞早期的增殖与分化从而促进骨形成。 2. 促进成骨细胞骨形成功能是活血化瘀汤及活血化瘀法促进骨折愈合的机理之一。 3. 提示在临床骨折的治疗方法上应该分期辨证，活血化瘀汤适用于骨折的早期。 参考文献 [1] Lavine LS,Grodzinsky AJ.Electrical stimulation of repair of bone.Bone Joint Surg(J), 1987,69(4):626-630. 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[5、6]合。蓝旭等研究认为中药可以抑制骨折后血液粘度升高并增加骨折局部血流量，改 [7]善全身血液流变状态和骨折局部微循环障碍，从而促进骨折的愈合。彭汉士等动物实验研究表明肢伤三方具有刺激大白兔骨折局部新生毛细血管网的形成，改善骨折局部的血液循环，加快新陈代谢，从而有效地促进骨折愈合。总之，活血化瘀中药能通过以上机理，使断端产生良好血供，为骨折的愈合提供营养及清除代谢产物,从而加速骨折的愈合。 2. 促进血肿的吸收和机化 中医认为骨折后“瘀不去则骨不能接”。恶血留内，瘀滞不散是骨折后的必然结果。加速骨折局部血肿吸收和机化是骨折愈合过程中的重要 [8]环节。陈超鹏等跌打接骨片能在骨折愈合早期促进骨折处血肿机化吸收、软骨钙化、骨痂生长及外骨痂桥接的作用，而桥梁骨痂早期出现是促进骨折提前愈合的一种表现。 [9]罗毅文等研究发现局部注射脱钙狗骨粉能使骨折断端的血肿吸收和机化加快，促进骨 [10]折愈合。赵宏铸等研究发现服用骨快愈胶囊在骨折后一周血肿完全吸收，而空白对照 19 组仍有大量的血块残余。这说明骨折后愈合的速度与血肿的吸收快慢有关。 3(增加胶原的合成 胶原的合成是钙盐形成和沉积的重要保障。钙盐的沉积必 [11]须在胶原纤维形成的基础上进行。羟脯氨酸是胶原蛋白的重要成分之一，在骨折愈合 [12][13]过程中，当骨痂中羟脯氨酸含量增加，可加速骨折愈合。顾坚毅等研究表明新伤续断汤不但能促进胶原的合成，而且能改善胶原的排列，从量和质两个方面来影响骨折愈 [14]合中胶原的合成，从而加速了骨折的愈合。赖建豪等使用补阳还五汤，实验动物骨痂中羟脯氨酸含量明显高于对照组。由此推测本方可能激活了骨修复细胞的活性，促进了 对胶原的合成和分泌，使骨折断端胶原的生成增加，对骨折愈合提供了良好的基础。 4(促进钙盐沉积 骨折的修复不同于其他组织修复，突出地表现在钙盐结晶的沉积，但在改建过程中，钙盐的沉着逐步变为较均匀的。此时在较成熟的骨组织中，胶原和粘多糖紧密结合，钙化除在胶原中完成外，也在基质中形成，最后形成较均匀光滑的 [15][16]骨组织。新骨组织的机械强度与基质钙化的程度密切相关，何赞厚等认为中药能促进成骨细胞、破骨细胞碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的合成和释放，增加骨折断端钙、磷的 [17]沉积;刘季兰等实验表明中药通过改善血管壁的通透性，加快血液循环有利于离子交 [18]换与小梁骨改建和再吸收，把更多的钙动员出来。陈希等认为驳骨煎剂能够通过促进再吸收作用，把骨折临近部位的钙动员出来。钙盐沉积的加速，增加了断端骨痂的强度，缩短了骨折的愈合周期。 5(提高骨痂质量 虽然骨痂是骨折愈合所必需的。但骨折愈合的快慢不在骨痂 [19]体积与范围的大小，而在于骨桥的形成，骨痂质量是骨痂成熟的体现。中药通过提高外骨痂、矿化骨痂、桥梁骨痂、联接骨痂的体积密度，从而增加骨骼强度，使骨痂的力 [20][21]学性能明显增强。杨益等实验骨痂评分结果显示，驳骨丸组明显优于空白组。而与接骨片组无明显差异。但生物力学监测结果显示，在最大载荷和弹性模量两方面驳骨丸 [22]均优于接骨片，说明驳骨丸组骨痂愈合的质量较好。王军跃等研究接骨七厘片对实验性骨折愈合的影响，X光片显示药物组较对照组骨折断端有明显的骨膜反应及骨痂生长。抗折力试验结果表明，药物可使骨痂质量提高，抗折力增强。组织学检查发现，药物组外在性骨痂与内在性骨痂生长完整而有规律，骨性骨痂比例高，骨痂断端桥接较快。 6(促进生长激素的分泌 生长激素(GH)由垂体前叶嗜酸性细胞产生，是胶原生长的一种重要调节剂，在骨的生长及骨折愈合时起着重要作用。骨折后血清GH浓度增高、 [23][24]促进骨生长，促使骨折愈合。隋艳华等研究显示康骨胶囊促进GH合成与释放，促进骨细胞分化，促进骨生长，同时促进钙吸收，使游离钙减少，血清钙降低，沉积在骨断端钙增多，使新骨生长。 20 [25]7(与微量元素的关系密切 骨基质胶原蛋白合成需要微量元素的参与。刘献祥 3+2+等认为胶原蛋白合成时，从本胶原合成溶胶原需要Fe、Mn参与。骨痂中锌的含量自13d后，用药组一直比对照组要高(P<0.05)，说明锌在骨折部位积聚，进入急需补充的 [26]酶系统而起作用。孙之镐等实验结果显示:用药组骨痂中锌、铜、锰、镁的含量明显高于对照组，大多数时相点呈现显著性差异(P<0.01)。这可能与组成接骨紫金丹的中药(如自然铜)富含多种金属元素，而能增加家兔对金属元素的净吸收有关，还可能与活血化瘀中药能加强从血清或邻近正常骨组织中调节更多的金属元素参与骨折修复反应有一定关系。 8. 增加细胞数量，促进细胞活性 骨生成细胞是骨折修复过程中骨组织形成、 [27][28]塑形的重要组织结构，中药能促进各类骨痂修复细胞数量和活性。陈奕等综合研究结果表明昆山接骨片I号具有促进成骨细胞的增殖、分化与矿化、成骨细胞的骨形成功 [29、30]能，从而发挥其促进骨折愈合的作用。董海辉等研究结果表明在骨折修复的早期，中药是通过促进成骨细胞数量的增加来促进骨痂生长，而在后期是通过提高成骨细胞的活性来促进骨痂的生长。 [31]汤耿民等观察了中药补肾活血方对实验性骨折 9. 对骨形成调节因子的作用 愈合过程中血清1GF-I的影响，分别于药后14天、28天检测血清IGF-I浓度，结果表明血清IGF-I浓度2周和4周时明显高于对照组，说明补肾活血方促进骨折愈合作用部 [32]分是通过提高IGF-I产生而介导的。郑智勇等的实验结果表明:骨痂细胞DNA含量高峰在骨痂形成第1周;用药组细胞DNA含量高于对照组。骨痂组织BMP含量高峰在第2—4周，用药组BMP含量高峰比对照组提前l周。用药组软骨骨痂少，骨性骨痂形成及成熟比对照组提前1周。说明DNA含量与骨痂组织增生状态有关，BMP含量与骨性骨痂 [33]形成相关。接骨冲剂能促进骨痂组织增生，使纤维骨痂直接向骨性骨痂转化。汤耿民等探讨中药补肾活血方对成骨细胞转化生长因子TGF-βmRNA表达的影响。实验结果表1 明随着骨愈片药液浓度的增加，成骨细胞内TGF-βmRNA表达明显高于对照组，说明补1 肾活血方刺激成骨细胞TGF-βmRNA的分泌和合成，有利于新骨生长。1 [34]10.促进骨胶原基因的表达 史炜镔等用原位杂交法观察骨痂组织中前胶原和TGF-βmRNA的表达。研究结果显示骨折后第3天，丹参有效部位组与三花接骨散组的1 骨折端TGF-βmRNA的表达明显高于空白组，并已出现?型胶原基因的表达。骨折第l1 周末，成纤维细胞和软骨细胞样细胞的?型前胶原基因表达占主导，丹参有效部位组与三花接骨散组?、?型前胶原与TGF-βmRNA的表达较空白组呈同步增强趋势。骨折第1 2周末，?型前胶原基因表达明显增加，丹参有效部位组和三花接骨散组中肥大软骨细胞明显多于空白组，?型前胶原基因的表达呈现显著的衰落趋势。同时证实共有表型表达现象的存在，尤以丹参有效部位组与三花接骨散组更为明显。骨折第4周末，软骨骨痂基本上被骨组织替代。丹参有效部位组和三花接骨散组骨组织替代更趋完全，偶见I 21 型前胶原基因表达阳性的成骨细胞和肥大软骨细胞。结论:丹参有效部位与阳性对照药三花接骨散均可调节骨折愈合过程中有关前胶原基因的表达，以促进骨折愈合，此作用可能与其对TGF-βmRNA表达的调控有关。 1 [35]11(其他方面 王维佳等通过实验认为补肾活血方通过补肾可以减少骨折后负氮平衡，减少肌肉消耗，减轻氮的分解代谢，有利于骨折愈合。 12(存在问题及展望 通过中药干预能促进骨折愈合已被临床所证实。其干预的机理虽然用各种方法进行了深入的研究且取得了一定的成果。但是，中药促进骨折愈合的疗效机理是一项极为复杂的过程，尤其是复方的研究方面，由于成分复杂，有效成分很难分离提取，究竟哪种有效成分起作用，在疗效机理上无法形成系统理论来诠释。同时由于中医理论体系治疗骨折采用三期辩证论治原则，不同阶段采用不同的治则。这就给阐明其机理带来更大的难度。开发研制符合三期辨证用药的复方的研究已成为今后发展的趋势。近年来分子生物学理论与技术的发展介入，使我们从细胞和分子水平来研究和探讨骨折愈合的机理成为可能。因此，在今后的研究中，应坚持中西医结合的道路，使中医药治疗骨折的理论得到不断的创新。 [参考文献] [1] 刘润田。中药接骨丹对骨折愈合作用的研究。天津医药 1962;4(8):457 [2] 胥少汀，葛宝丰，徐印坎，主编。实用骨科学，1999;2版，349 [3] 江树连，丁锷，李保泉，等。消瘀接骨散外敷对家兔骨折愈合影响的实验研究。中医外治杂志 2000,9(3)6 [4] 张建国，陈良金，蒋文跃，等。外敷中药对骨折愈合微血管重建的影响。中国骨伤2000;13(2):86 [5] 蓝旭，刘雪梅，葛宝丰，等。中药接骨片对骨折愈合的影响。微循环杂志 200l;11(2):38 [6] 周正新，丁锷，李保泉，等。消瘀接骨散对骨折肢体血液循环的影响及其与骨折愈合的关系。中医正骨 1997;9(4):5 [7] 彭汉士，贝美莲，吴清和，等。中药肢伤三方促进骨折愈合的实验研究。广州中医药大学学报 2001;18(2):163 [8] 陈超鹏，谭子贤，董海辉，等。跌打接骨片促进家兔骨折愈合的实验研究。中国中医药科技 2001;8(4):229 [9] 罗毅文，孙之镐，段戡，等。局部注射脱钙狗骨粉对兔实验性骨折愈合的促进作用。中医正骨 1999;11(8):7 [10] 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