疏肝利胆片质控方法研究

疏肝利胆片质控方法研究 疏肝利胆片质控方法研究 508 第15卷3期 2009年9月 天津医科大学 JOURNALOFTIANJINMEDICALUNIVERSITY V01.15.No.3 Sep.2009 疏肝利胆片质控方法研究 刘茂军,房志仲,李锡晶,黄颖瑜 (1.天津市和平区中医医院药剂科,天津300050;2.天津医科大学) [摘要]目的:建立疏肝利胆片质量标准.方法:采用薄层色谱(TLC)法对处方中大黄,黄芩和金钱草进行定性鉴别;黄 芩素HPLC测定采用KromasilC,柱,以乙腈一0.6%磷酸(45:55)为流动相,流速为0.8ml/min,检测波长为274nm;大 黄素HPLC测定采用KromasilC柱,以甲醇一0.1%磷酸(85:15)为流动相,流速O.8ml/min,检测波长275am,柱温 25?.结果:在TLC色谱中,大黄,黄芩和金钱草均能检出;HPLC测定中黄芩素在1-3Ixg/ml内呈现良好的线性关系 (r=O.9997);大黄素在18,42~g/ml范围内呈现良好的线性关系(r=0.9999),平均回收率100.49%.结论:该方法简单, 准确,专属性强,可作为疏肝利胆片质量控制方法. [关键词]疏肝利胆片;高效液相色谱法;黄芩素;大黄素;含量测定 [中图分类号]R927[文献标识码]A[文章编号]1006—8147(2009)03—0508—05 StudyonqualitycontrolofShuganlidanTablets LIUMao-jun,FANGZhi-zhong2,LIXi-jinf,HUANGYing-yu (1.DepartmentofPharmacy,TianjinHepingHospitalofChineseMedicine,Tianjin300050, China; 2.TianjinMemdicalUniversity) ABSTRACTob.1ective:ToestablishaqualitystandardofShuganlidantablets.Metheds:TLCwasused toidentifyRhubarb,RadixscutellariaeandChristinaLoosestrifeHerb;BaicaleinwasmeasuredbyHPLC methodonKromasilC1Rcolumnwithamixtureofacetonitrile一 0.6%H3PO4(85:15)asmobilephaseataflow rateof0.8ml/min.underthewavelengthof274nmatthecolumntemperatureof25?.Emodin wasmea. suredbyHPLCmethodonKromasilC18columnwithamixtureofmethanol一 0.1%H3PO4(45:55)asmobile phaseataflowrateof0.8ml/min.underthewavelengthof275nmatthecolumntemperatureof25?.Re? suits:Rhubarb,RadixscutellariaeandChristinaLoosestrifeHerbcouldbeexaminedbyTLC.Baiealein hadagoodlinearrelationshipintherangeof1,3Ixg/m1.thelinearequationwasY=210127X 一20730. r=0.9997.Emodinhadagoodlinearrelationshipintherangeof18-42t~g/m1.thelinearequationwas Y=11284X+14616.r=0.9999.Theaveragerecoveryratewas100.49%.Conclusion:Thismethodwasae— curateandspecific,whichcouldbeusedforqualitycontrolofShuganlidantablets. KEYWoRDSShuganlidantablets;Bacalein;Emodin;HPLC;Contentdetermination 疏肝利胆片是天津市和平区中医医院传统医院 制剂(津药剂字Z20070344号),该制剂主要由金钱 草,黄芩,大黄,柴胡,枳壳,鸡内金,砂仁,穿山甲等 中药组成,具有疏肝利胆,通络散结,消积化滞之功 效,临床用于治疗肝气郁结型胁痛,胆胀患者有上腹 作者简介:刘茂军(1968一),男,主管药师,研究方向:医院药物制剂; 房志仲(1959一),男,教授,学士,硕士生导师,研究方向:药物制剂与 质量控制. 疼痛,两侧胁肋胀痛,嗳气呃逆,恶心,食后饱闷,大 便秘结或失调,舌苔薄白,脉弦等症候.该制剂研制 期间,临床观察960例病人,总有效率为97.5%,疗 效稳定.为提高药物制剂质量,控制制剂生产过程, 保证临床用药安全,采用薄层色谱(TLC)对处方中 大黄,黄芩和金钱草进行鉴别,用高效液相色谱法 (HPLC)测定大黄中大黄素的含量和黄芩中黄芩素 进行定量分析.结果明,检测方法简单,灵敏,重现 第3期刘茂军.等.疏肝利胆片质控方法研究509 性较好,可以用于该制剂的质量控制. 1仪器与材料 1.1仪器SP8810型高效液相色谱仪,spectra100 检测器(美国热电公司);Anastar色谱工作站,漩涡 混合器(液体快速混合器YKH—I型.江西医疗器械 厂),超声仪(KQ一100B型超声波清洗器,昆山市超声 仪器有限公司). 1.2药品与试剂大黄,黄芩和金钱草对照药材均 由中国药品生物制品检定所提供(批号分别为: 120984-200301,120955—200607和121187-200302); 黄芩素对照品(批号:110756—200110)和大黄素对照 品(批号:110756—2001lO)均有中国药品生物制品检 定所提供;疏肝利胆片天津市和平区中医医院提供 (批号:20070910,20071113和20071225);乙腈(色 谱纯)由天津市彪仕奇科技发展有限公司提供(批 号:07071301);磷酸(市售分析纯);重蒸水自制. 2方法与结果 2.1定性实验 2.1.1大黄鉴别取本品10片研细,称取粉末1g. 加甲醇20ml浸泡1h,滤过,取滤液5ml蒸干,残渣 加水1Oml使溶解,再加盐酸1ml,加热回流30min, 立即冷却.用乙醚分2次振摇提取,每次20ml,合并 乙醚液蒸干,残渣加三氯甲烷1ml使溶解,作为供 试品溶液.另取大黄对照药材0.1g,同法制成对照 药材溶液.照薄层色谱法(附录?B)试验,吸取上述 3种溶液各4l,分别点于同一硅胶G薄层板上,以 石油醚(30,60?)一甲酸乙酯一甲酸(15:5:1)的上层 溶液为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 rim)下检视.供试品色谱中,在与对照药材色谱相应 的位置上,显相同的5个橙黄色荧光主斑点,置氨蒸 气中熏后,斑点变为红色,阴性对照液在相应的位置 上无相同的斑点 2.1.2黄芩鉴别取本品10片中研细.称取粉末 1g,加乙酸乙酯一甲醇(3:1)的混合溶液30?Il,加热 回流30min,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇5rnl 使溶解,取上清液作为供试品溶液.另取黄芩药材对 照品1g,同法制成对照药材溶液.按处方比例和制 备工艺除去黄芩的阴性样品.按供试品溶液制备方 法提取,作为阴性对照品溶液.照薄层色谱法(附录 ?B)试验,吸取供试品溶液,对照药材溶液及阴性对 照品溶液各4l,分别点于同一聚酰胺薄膜上,以甲 苯一乙酸乙酯一甲醇一甲酸(10:3:1:2)为展开剂,预饱 和30rain,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365rim)下 检视.供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置 上,显相同颜色的斑点.阴性对照液在相应的位置上 无相同的斑点. 2.1.3金钱草鉴别取本品粉末l0片研细.加80% 甲醇100ml,加热回流1h,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣 加水10ml使溶解,用乙醚振摇提取2次,每次10Hll, 弃去乙醚液,水液加稀盐酸10ml,置水浴中加热1h, 取出,迅速冷却,用乙酸乙酯振摇提取2次,每次20n1l, 合并乙酸乙酯液,用水30ml洗涤,乙酸乙酯液蒸干, 残渣加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液.另取金钱 草粉末1g,同法制成对照药材溶液.按处方比例和 制备工艺除去金钱草的阴性样品,按供试品溶液制 备方法提取,作为阴性对照品溶液.吸取供试品溶 液,对照药材溶液及阴性对照液各5l,分别点于同 一 硅胶G板上,以甲苯一甲酸乙酯一甲酸(10:8:1)为展 开剂,展开,取出,晾干,喷以3%三氯化铝乙醇溶液, 在105?加热数分钟,置紫外光灯(365nm)下检视. 供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显 相同颜色的斑点,阴性对照液在相应的位置上无相 同的斑点. 2.2含量测定 2.2.1黄芩素含量测定 2.2.1.1黄芩素色谱条件流动相为乙腈一0.6%磷 酸(45:55),紫外检测波长为274nm,色谱柱为 TIANHE~KromasilC18柱,流速为0.8ml/min,柱温 为25?.见图1. O.16 0.14 O.12 0.1O 渣0_08 鹫0.06 0.04 0.02 O.o0 05l0l520 时间(rain) 图1黄芩素对照品HPLC色谱图fA.黄芩素对照品RtA=10.107min} 2.2.1.2黄芩素对照品储备液的配制精密称取黄 芩素对照品0.001g,置于10n1l容量瓶中,用甲醇溶 解,至刻度,配成浓度为0.0001g/ml的标准储备液, 置冰箱保存. 2.2.1.3疏肝利胆片样品预处理取疏肝利胆片20 片,研细,取细粉约1g,精密称定,置于250ml具塞 锥形瓶中,加入甲醇10rIll,称重,超声处理1h,放置 510天津医科大学第15卷 冷却,再次称量,滤过,弃去初滤液,滤液再次用微孔 滤膜过滤,精密吸取2m1,加甲醇稀释定容到10m1, 取20l进样.在2.2.1.1项下的色谱条件下,黄芩素 保留时间与相邻成分达到基本分离,见图2. 值 鹫 时『司(rain) 图2疏肝利胆片样品HPLC色谱圈(A.黄芩素RtA=10.473rain) 2.2.1.4疏肝利胆片阴性样品处理预处理按处方 比例称取黄芩外的其他药材,按照疏肝利胆片制备 工艺制备疏肝利胆阴性对照片,依2.2.1.3项下同方 法制成阴性样品溶液,取20l进样.在2.2.1.1项下 的色谱条件下,在黄芩素峰位置无任何峰型出现,与 相邻 时间(min) 图3疏肝利胆片阴性对照样品HPLC色谱图 2.2.1.5线性关系考察分别精密量取黄芩素对照 品储备液0.1,0.15,0.2,0.25和0.3ml,用甲醇稀释 定容至10ml,吸取2Ol进样,测定,以黄芩素的峰 面积对黄芩素浓度作图,进行统计学处理,得出回归 方程:Y=210127X一20730,r=0.9997,结果表明1,3 Ixg/ml内呈现良好的线性关系. 2.2.1.6精密度以中浓度点30t~g/mt,一天内平行 进样6次,按峰面积计算,RSD分别为1.1284%,结 果见表1. 表1黄芩素精密度实验结果 编号123456RSD(%) 峰面积4083264133354025154049644063954100801.1284 2.2.1.7稳定性以中浓度点30g/ml,分别在0, 2,4,6,8,10,12和24h进样,按峰面积计算,RSD为 1.8309%,结果见表2. 表2黄芩素稳定性实验结果 小时(h)02461224RSD(%) 峰面积4194934179384135554285524297924110171.8309 2.2.1.8加样回收率按照2.2.1_3项下疏肝利胆片 样品预处理方法制备样品,分别作为对照,加样 80%,加样100%,加样120%,吸取20l进样测定, 计算回收率,结果见表3. 2.2.1.9样品含量测定按照2.2.1.3项下疏肝利胆 片样品预处理方法制备样品,测定每个批号含量,结 果见表4. 表3加样回收率测定结果 表4不同批号疏肝利胆片中黄芩素的含量测定结果图4-6. 2.2.2大黄素含量测定 2.2.2.1色谱条件流动相为甲醇一0.1%磷酸(85: 15),紫外检测波长为275nm,色谱柱为TIANHE~ KromasilC培柱,流速为0.8ml/min,柱温为25?,在 此色谱条件下,大黄素与相邻成分达到基本分离,见 0 0 恒0 髫0 0 O51O152O253O3540 时间(min) 图4大黄素对照品(A.大黄素对照品RtA=13.980n】 m傩? OOOOOOOOO 第3期刘茂军.等.疏肝利胆片质控方法研究5l1 0.032 0?O24 旧0.016 鹫O .oo8 051O152O253O354O 时间(min) 图5疏肝利胆片样品(A.大黄素Rt^=13.940) 0.032 0.024 孽0_o16 O.008 0510l52UZ5303540 时间(min) 图6阴性对照样品 2.2.2.2大黄素对照品储备液的配制精密称取大 黄素对照品0.0020g,置于10ml量瓶中,用甲醇溶 解并定容至刻度.配成浓度为0.0002g/ml的标准储 备液,置冰箱保存. 2.2.2.3疏肝利胆片样品预处理取疏肝利胆片20 片,研细,取细粉约0.3g,精密称定,置于250ml具 塞锥形瓶中,加人甲醇1Oml,称重,超声处理2h, 放置冷却,再次称量,滤过,弃去初滤液,滤液再次 用微孔滤膜过滤.精密吸取2ml,加甲醇稀释定容 到10ml,取20l进样. 2.2.2.4疏肝利胆片阴性样品处理预处理按处方 比例称取大黄外的其他药材,按照疏肝利胆片制备 工艺制备疏肝利胆片阴性片,依2.2.2.3项下同方法 制成阴性样品溶液. 2.2.2.5线性关系考察分别精密量取大黄素对照 品储备液0.09,0.12,0.15,0.18,0.21ml,用甲醇稀释 定容至1OInl,吸取20l进样,测定,以大黄素的峰 面积对大黄素浓度作图.进行统计学处理,得出回归 方程:Y=Il284X+14616,r=0.9999,结果表明18, 42g/ITll内呈现良好的线性关系. 2.2.2.6精密度以中浓度点30~g/ml,ld内平行 进样6次,按峰面积计算,其RSD为0.55%,结果见 表5 表5大黄素精密度 编号123456RSD(%) 峰面积3397493364243375453366893376083341040.55 2.2.2.7稳定性以中浓度点30I~g/ml,分别在0, 2,4,6,8,1O,12,24h进样,按峰面积计算,其RSD 为1.68%.结果见表6. 表6大黄素稳定性 小时(h)02461224RSD(%) 峰面积35821l3473133501563523073478703405271.68 2.2.2.8加样回收率按照2.2.2.3项下疏肝利胆片 样品预处理方法制备样品,分别作为对照,加样 80%,加样100%,加样120%,吸取20l进样测定, 计算回收率,结果见表7. 表7加样回收率测定结果 2.2.2.9样品含量测定按照2.2.2.3项下疏肝利胆 片样品预处理方法制备样品,测定每个批号含量,结 果见表8. 表8不同批号疏肝利胆片中大黄素的含量测定结果=3) 3讨论 3.1黄芩素提取方法尝试过回流?,更换提取试 剂的方法,但是分离效果不理想,回收率也低于本实 验中甲醇超声提取的回收率. 3.2黄芩素色谱条件选择文献记载的流动相配 比有许多种[3,5,61.但经过实验,确定以乙腈一0.6%磷酸 (45:55)为流动相,分离效果理想,稳定. 3.3大黄素提取方法尝试过回流,萃取以及酸 化处理[81,更换提取试剂的方法,但是分离效果均不 理想.回收率低于甲醇提取所得回收率. 3.4大黄素色谱条件选择文献记载的流动相配 比有许多种[9],但经过实验,确定以甲醇一0.1%磷酸 (85:15)为流动相",分离效果理想,稳定. (下转第524页) 524天津医科大学第15卷 临床分期,结合病理分期及影像学表现以确定治疗 方式.术中病灶刮除要彻底,合理选择辅助治疗方 式,同时正确合理使用填充物(自体骨,异体骨或 PMMA),以防临近组织受累及.瘤段切除对大多数 患者是没有必要的.术后严格制动及密切复查,开始 2年每3,4个月复查1次,2,5年问,每6个月复查 1次,5,10年后,每年复查1次,同时要严密观察胸 x线片以防出现肺转移.每年检查1次,至少要随防 10年.对于复发病例要仔细检查复发部位的情况, 软组织侵袭的程度.复发部位距离关节的远近以确 定二次手术的.本组病例中4例复发,首次手术 均采用局部病灶刮除+自体髂骨植骨术,经随访后发 现病灶复发,依据复发病灶距离肩关节的远近,软组 织受侵袭的程度分别采用扩大瘤段切除十同种异体 骨植骨重建+绞锁髓内针内固定术及采用扩大瘤段 切除+人工肱骨头假体置换术.但是人工肱骨头假体 置换术所导致的左肩三角肌萎缩及不全脱位是较棘 手的问题. 参考文献: [1]SungHW,KuoDP,ShuWP,eta1.Giantcelltumorofbone:analysisof 208casesinChinesepatients[J],JBoNeJointSurg,1982,64(5):755 [2]EnnekingWF.MuscuioskeletalTumorSurgery[M].NewYork:Churchill Livingstone,1983:87-88 [31CampanacciM.Giant-celltumorandchondr0sarc0ma:grading, treatmentandresults(studiesof209and131c~ses)[J].RecentRe— suitsCancerRes,1976,54(5):257 [4]李慎江,蔺大伟,刘德斌,等,cR,CT,MRI在骨肿瘤诊断中的临 床价值[J].中国矫形外科杂志,2006,14(9):39 [5]SaizP,VirkusW,PiaseckiP,eta1.Resultsofgiantcelltumorofbone treatedwithintralesionalexcision忉.ClinOahop,2004,424(7):221 [6]LackmanRD,HosalkarHS,OgilvicCM,eta1.IntralesionalCuret— tageforGradelIandnlgiantcelltumorsofbone[J1.ClinOahop, 2005,438(9):123 『7]MankinHJ,HomicekFJ,RaskinKA.InfectioninmassiveboneaUo. grafts[JJ.ClinOnhopRelatRes,2005,432(8):210 [8]BrigmanBE,HornicekFJ,GebhardtMC,eta1.Allograftsaboutthe kneeinyoungpatientswithhigh-gradesarcoma.们.ClinOrthop RelatRes,2004,421(5):232 [9]ZhenW,YaotianH,Son~ianL,eta1.Giantcelltumourofbone:the long—termresultsoftreatmentbycurettageandbonegraft册.JBone JointSurg(Br),2004,86(2):212 [103BCampanacciM,BaldiniN,BorianiS,eta1.Giant—celltumorof bone[J].JBoneJointSurg,1987,69(1):106 [11]MalawerMM,BickelsJ,MellerI,eta1.Cryosurgeryinthetreatment ofgiantcelltumor:along—termfollow-upstudy叨.ClinOrthop, 1999,359(2):176 [12]PerssonBM,WoutersHW.Curettageandacryliccementationin surgeryofgiantcelltumorsofbone【JJ.ClinOrthop,1976,120(10): 125 [13]VidalJ,MimranR,AllieuY,eta1.Plasticdecomblementpar metaerylatedemethyletraitmentdecertainestumeursosseusesbe— nignes[J].MontpellierChir,1969(15):389 [14]BiniSA,GillK,JohnstonJO.Giantcelltumorofbone.Curettage andcenlentreconstruction[J].ClinOrthop,1995,321(12):245 [15]Quintu,VanhoferU,HamtrickA,eta1.Cytotoxicityofphenolto muscuioskeletaltumours[J].JBoneJointSurg,1996,78(6):984 [16]McGoughRL,RutledgeJ,LewisVD,eta1.ImpactSeverityoflocalre— cu~enceingiantcelltumorofbone叨.ClinO~hop,2005,438(7):116 (2008—10—28收稿) (上接第511页) 3.53批样品测定结果其中黄芩素20070910为 43.38822(txg/片),20071l13为41.31724(Ixg/片) 和20071225为43.67931(g/片),平均RSD为 0.9458%;3批样品中大黄素测定结果20070910为 1959.15(片),200711l3为1419.85(片), 20071225为1531.24(g/片),平均RSD为0.75%, 达到中药制剂中药物分析的,说明疏肝利胆片 生产工艺稳定,本实验方法可以用于对该制剂的质 量控制. 参考文献: [1]杨立新,刘岱,冯学锋,等.高效液相色谱法测定不同产地黄芩 中黄酮化合物的含量【J】.中国中药杂志,2002,27(3):166 [2]冯有龙,余伯阳,董小平.高效液相色谱法同时测定三黄片中的 蒽醌类,黄酮类及生物碱类化合物【JI.药学,2006,41(3):285 [3]中华人民共和国药典委员会,编.《中华人民共和国药典}2005 年版(一部)『M1.北京:化工工业出版社,2005:17,212 [4]周晓宁,杨滨.高效液相色谱一电化学检测法测定黄芩中3种有 效成分的含量『Jl_中国中药杂志,2006,1(1):47 [5]刘太明,蒋学华.HPLC同时测定肠循环液中黄芩苷,黄芩素和 酚红的浓度[J1.华西药学杂志,2005,20(5):390 『6]乔春峰,韩全斌,宋景政,等.RP—HPLC测定半枝莲药材中4种 主要黄酮类成分的含量[J】_中国药学杂志,2006,41(17):1342 『7]黄莎莎,李萍,周娟,等.HPLC测定解毒降脂片中大黄素的含量 [J1.华西药学杂志,2007,22(2):233 『8]于秀华.反相高效液相色谱法测定前列片中大黄素和虎杖苷的 含量[中国实验方剂学杂志,2007,13(10):6 [9]孙业成.HPLC法测定牛黄清火丸中大黄素和大黄酚的含量fJ1. 中国药师,2007.10(9):873 [1O]魏尊喜.HPLC测定熊胆丸中大黄素,大黄酚的含量fJ1_中成药, 2007,29(9):附5 [11]徐成志.HPLC法测定接骨七厘片中大黄素,大黄酚的含量[J1.安 徽医药.2007.11(9):806 (2008一l1一O5收稿)