不同冷冻方法对胎儿卵巢组织早期卵泡的影响_25958

不同冷冻方法对胎儿卵巢组织早期卵泡的影响_25958 不同冷冻方法对胎儿卵巢组织早期卵泡的影响 [标签:来源] 作者:王国平，王燕蓉，梁雪云，崔岫，孙静 【摘要】 目的 观察不同冷冻方法对胎儿卵巢组织早期卵泡的影响。方法 分别采用程 序冷冻法(PFG)、快速冷冻法(RFG)、玻璃化冷冻法(VG)冻存胎儿卵巢组织，解冻后进行光镜、 电镜观察。结果 光、电镜组织形态学观察发现冻后各组卵泡结构均存在一定程度的冷冻损伤。 冷冻后的胎儿卵巢内形态正常的卵泡数明显下降，在2 mm×2 mm×1 mm的卵巢皮质内，形态 正常的卵泡数在PFG、RFG、VG及新鲜对照组(FCG)中分别为(992.3?618.2)个、(542.8?202.5) 个、(1604.8?964.0)个和(1888.2?645.3)个。RFG卵泡数显著低于FCG与VG(P,0.05)，但 与PFG间差异无统计学意义(P,0.05)。结论 三种冷冻方法均可有效冻存胎儿卵巢组织，其 中玻璃化法对卵巢内早期卵泡的损伤最小，单位体积内保存的卵泡数最多。 【关键词】 程序冷冻法;快速冷冻法;玻璃化冷冻法;早期卵泡;损伤 Abstract:Objective To distinguish the effects of three different freezing methods on morphology of fetal ovary tissue. Methods The fetal ovary tissue were respectively preserved by program freezing，rapid freezing，and vitrification.After being thawed，fetal ovary tissues in each of these groups were assessed by using both light and electron microscopy. Results The post-thawing follicular structure was found，to some extend，injured when being observed histomorphologically by means of light and electron microscopy.The number of morphologically normal follicles was found significantly reduced in post-thawing fetal ovaries.In an unit volume of 2 mm×2 mm×1 mm dissections，the number of morphologically normal follicles is 992.3?618.2、542.8?202.5、1604.8?964.0 and 1888.2?645.3 in each freezing group and the fresh transplanting group.The number of follicles in RFG was notably lesser than that in FCG or in VG(P,0.05)，but no significant difference was found between RFG and PFG(P,0.05). Conclusion The three different freezing methods can all effectively preserve fetal ovary tissue.Among the three freezing methods， vitrification has the least frozen injury of early follicles，and it preserve the most follicles per unit volume. Key words:program freezing;rapid freezing;vitrificationearly;follicles; injury 卵巢中数以百万计的原始卵泡是卵巢功能的一个巨大储备，卵巢冻存是保存卵巢功能的一个理想的途径。人胎儿卵巢易于获得，卵巢皮质中具有大量均衡的原始卵泡，是进行卵巢组织深低温冻存及效果判断的理想材料。目前卵巢组织冻存方法主要有程序冻存法、快速冻存法、玻璃化冻存法,1,。本文进行了上述三种冻存方法对胎儿卵巢组织形态和卵泡数量影响的研究，希望为卵巢组织保存提供有效的冻存方法。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 胎儿卵巢的获取 胎儿卵巢取自因各种原因药物引产的20,28周死亡女胎，征得家属同意，引产后2h内无菌取材，切除卵巢周围多余的脂肪组织、系膜及髓质，将皮质切成2mm×2mm×1mm大小的皮质块待用。冷冻管为0.5mL的国产塑料麦管，直径0.5cm，长8cm。 1.1.2 卵巢冻存实验分组 新鲜对照组(fresh control group，FCG);?程序法冷冻组(program freezing group，PFG);?快速法冷冻组(rapid freezing group，RFG);?玻璃化法冷冻组(vitrification group，VG)。 1.1.3 实验用液体 ?冷冻保护液 A组液体(用于程序冷冻法和快速冷冻法):A1液:1.5M乙二醇(EG)，100μMβ-ME;A2液:1.5M乙二醇(EG)，100μMβ-ME，0.1M蔗糖。 B组液体(用于玻璃化冷冻法) B1液:1.5M EG;B2液:5.5M EG+30%聚蔗糖+0.5M蔗糖。 ?解冻液 A组液体(用于程序冷冻法和快速冷冻法):0.5M蔗糖+100μMβ-ME;B组液体(用于玻璃化冷冻法):0.5、0.25、0.125M的蔗糖液 1.2 方法 1.2.1 冷冻方法 1)程序冷冻法 冷冻程式参照Oktay等提出的慢冻-速融方法,2,，渗透平衡结束后，放入程序降温仪内，按如下过程开始程序降温，即从4? 以1?/min的速率降至-7??平衡10min后，手工植冰(Seeding)?以 0.3 ?/min降至-40??以10?/min降至-140?，将冷冻保护容器投入液氮罐中在-196?保存。 2)快速冷冻法 采用本实验室摸索出的程序进行,3,，即将胎儿卵巢皮质组织块在2.0 mL 无蔗糖的A1冷冻保护液中4?下渗透平衡20 min后，再放入对应的含0.1M蔗糖的A2冷冻保护液中，此时开始装管，将胎儿卵巢皮质组织块移入A2冷冻管内的冷冻液中，4?条件下继续渗透平衡20 min后开始冷平衡，冷平衡在自制的液氮蒸汽浴槽中进行，将装有胎儿卵巢皮质组织块的冷冻管水平放置在该液氮浴槽中，5 min后将麦管投入-196?的液氮罐中保存。 3)玻璃化冷冻法 将要冻存的皮质块浸入1.5M EG预渗透平衡15min;将预渗透平衡后的皮质块移入EG5.5/30玻璃化液继续渗透平衡，在第二步渗透平衡过程中，将皮质块装入冷冻麦管内，在卵巢接触玻璃化液的5,6min时将麦管投入-196?的液氮罐中保存，全过程在22,24?下进行。 1.2.2 解冻方法 1)程序冷冻法与快速冷冻法的解冻方法 参照Shaw氏法,4,，将麦管从液氮中取出后，迅速置于37?水浴中(速率为100?,min)，剪开麦管两头，组织块连同液体一起流入表面皿中，充分晃动，加入解冻液在37?温箱放置30 min后将组织块移入含20,小牛血清的DMEM中，37?条件下，充分漂洗，中间换液1次。 2)玻璃化法的解冻方法 将麦管从液氮中取出，室温下停留10s，置于37?水浴中20s。剪开麦管一端，卵巢皮质块连同保护液一起流入盛有1mL、0.5M蔗糖解冻液的表面皿中，充分晃动，渗透平衡5min后，在0.25、0.125M含20,小牛血清的蔗糖液内依次洗脱5min，最后入PBS液充分洗涤。 1.3 冷冻效果的判断 主要进行组织切片形态学观察。 1.3.1 光镜观察 新鲜及解冻后的卵巢皮质块制成间断的连续石蜡切片(间隔厚度为1个初级卵泡的直径)，经苏木精-伊红(HE)染色后观察卵泡、卵母细胞和颗粒细胞的结构。计数新鲜及各冷冻组单位体积(2mm×2mm×1mm)内形态正常的卵泡数。 1.3.2 超微结构观察 用透射电镜直观地观察冷冻对卵巢内卵泡的超微结构有无损伤。 1.4 统计学方法 用SPSS 11.5统计软件进行处理，各冷冻组间形态正常的卵泡计数均数间比较采用方差，P,0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 光镜观察结果 新鲜胎儿卵巢，光镜下可见到大量的始基卵泡，体积较小，直径约30,40 μm，卵泡由位于中央的一个卵母细胞和周围的单层扁平卵泡细胞构成。卵母细胞胞质少，核大而圆，核仁清晰。卵泡细胞紧密包围在卵母细胞周围，排列整齐(图1，见封2)。 程序法、快速法、玻璃化法冷冻各组，于解冻后进行了光镜观察，结构完整的各级卵泡形态同新鲜卵巢，但各冷冻组均存在一定程度的冷冻损伤，表现为卵泡结构破坏，出现卵母细胞核、卵泡细胞核固缩深染;卵泡细胞排列紊乱、丢失或从基底膜处脱离。程序法、快速法较玻璃化法冻融的卵巢块，间质组织比较疏松，卵泡周围的基质细胞和胶原纤维失去正常的致密性(图2-4，见封2)。对各组单位体积(2 mm×2 mm×1 mm)皮质块内卵泡数量进行了统计，具体结果见表1。表1 不同方法冷冻前后卵巢组织内形态正常卵泡数的变化(略) 2.2 电镜超微结构的观察 新鲜对照组卵母细胞核膜完整，核仁清晰可见，染色质分布均匀;胞质均匀，见大量线粒体，结构完整，嵴清晰;细胞间连接清晰、完整，以缝隙连接为主;周边围绕着结构正常的扁平卵泡细胞(图5，见封2)。 程序冷冻组电镜下见正常结构卵泡较多。损伤表现为卵母细胞核形态变小，皱缩，异染色质增多，分布均匀;胞质内有空泡，线粒体电子密度增加，嵴结构不清;卵泡细胞核染色质聚集、边集或呈空泡(图6，见封2)。 快速冷冻组电镜下分析:损伤表现为卵母细胞与卵泡细胞胞核结构不清或呈空泡，染色质聚集、边集;胞质呈空泡状，线粒体呈空泡(图7，见封2)。 玻璃化冷冻组电镜下见正常结构卵泡最多。损伤只表现为卵母细胞胞核轻度固缩，线粒体电子密度增加，嵴少见，无空泡，仅在卵泡细胞中见空泡(图8，见封2)。 3 讨论 卵巢功能衰退造成的雌激素不足是促成老龄妇女并发问题的因素，其治疗已被看作有关公共健康的重要问题;目前，对化疗所致的卵巢早衰的防治仍处在研究阶段，借助于卵巢冷冻移植技术，可达到纠正内分泌失调和保存女性生育力的目的,5,。胚胎卵巢抗原性弱，富含大量原始卵泡，能够耐受冷冻过程，是进行卵巢移植治疗卵巢早衰的理想供体;要实现利用冻存卵巢的移植恢复卵巢功能，研究冻存方法对卵泡的影响就成为一项基础性工作。 常规形态学是观察细胞损伤最直观的方法。本研究光镜、电镜观察发现各冷冻组均存在冷冻损伤，经不同方法冻融后的单位体积胎儿卵巢组织中正常形态的卵泡数明显下降。采用程序冻存时，细胞脱水靠冷冻过程中细胞外冰晶的形成，未冻液体渗透压增高而使组织、细胞达到脱水，但这样的脱水程度有限，因此在其后的快速降温过程中，细胞内有冰晶形成。光镜显示经程序法冻存的卵巢皮质块，间质组织比较疏松，卵泡周围的基质细胞和胶原纤维失去正常的致密性，推测这些区域的细胞内都有较大的冰晶形成，导致细胞结构的破坏。因为需要控制降温速率，必须使用精确的控温仪器，在操作成本上无疑对病人来说是一个沉重的经济负担。因此经济、快速、有效的冷冻方法成为研究的焦点。我实验室通过大量实验研究已摸索出了与程序冷冻法效果近似的快速降温法来冻存小鼠和大鼠的卵巢组织和器官,3,。 在本研究中，我们运用这种快速冻存法将2 mm×2 mm×1 mm大小胎儿卵巢皮质块进行冻存，通过形态学观察发现，在光镜下解冻后的胎儿卵巢组织形态保存完好，卵泡结构存在，单位体积内保存的卵泡数与程序法相比差异无统计学意义。尽管采用此种方法冻存新生鼠卵巢器官取得了较好的冻存效果,6,，但我们也观察到该方法保存的单位体积卵巢皮质块内卵泡数远远低于新鲜组，电镜下见卵泡中有较多空泡。分析原因我们认为，?采用快速冻存所使用的冷冻保护剂(cryoprotective agents，CPA)与PFG的浓度相同，对于快速冻存法来讲浓度尚不够高，没能在进入快速降温前达到充分脱水的要求;?通过产生大量的液氮蒸汽对麦管内的卵巢组织降温，其降温速率尚不够快，细胞内产生的冰晶对细胞造成损伤，因此并没有达到预期的效果。玻璃化法作为一种新的冷冻保存方法，能较好保存有生命的细胞、组织和器官的生物活性，是近年低温生物学领域发展最快的研究方向之一,7,。本研究采用我实验室摸索出的玻璃化液EG 5.5/30,8,，用于胎儿卵巢组织的冻存，单位体积卵巢皮质块内保存的卵泡数多于程序冷冻组与快速冷冻组，与快速冷冻组差异有统计学意义，接近于新鲜组;同时，电镜下见正常结构卵泡数最多，卵泡中空泡少见。我们认为，优质的玻璃化液的组成是产生好的玻璃化冻存卵巢的前提;适宜的渗透平衡时间是防止高浓度冷冻保护剂毒性损伤的关键，这就要使卵巢组织在高浓度冷冻保护剂的时间尽可能短，又能够提供足够的时间使细胞内CPA处于一个适宜浓度，才能在冷冻过程中较好地形成玻璃化，有效地克服冰晶在细胞内外的形成，获得优质的冻存效果。 综上所述，程序法、快速法、玻璃化法均可有效冻存胎儿卵巢组织，形态学观察示玻璃化冷冻法对卵巢内早期卵泡的损伤最小，单位体积内保存的卵泡数最多，是一个极富发展潜力的卵巢组织冻存法。 【参考文献】 ,1,王燕蓉.女性生育力体外保存技术,M,.银川:宁夏人民出版社，2007:159-171. ,2,Oktay K，Newton H，Aubard Y，et al.Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue-an emerging technology ,J,.Fertil Steril，1998，69:1. ,3,庞龙，王燕蓉，沈新生.小鼠卵巢组织的超速冻存法研究,J,.中国实验动物学报，2001，10(3):142-147. ,4,Shaw JM，Bowles J，et al.Fresh and cryopreserved ovarian tissue samples from donors with lymphoma transmit the cancer to graft repients,J,.Hum Reprod，1996，11:1668. ,5,王燕蓉.人类卵巢的冻存与移植研究进展,J,.生殖与避孕，2007，27(12):786-789. ,6,Wang Y，Wang P，Shen X，et al.Endocrine function and lymphocyte infiltration of newborn rat ovaries after ultrarapid freezing and allotransplantation ,J,.Fertility and Sterility，2007，87(6):1438-1443. ,7,LI Yu-bin，ZHOU Can-quan，YANG Guo-fen，et al.Modified vitrification method for cryopreservation of human ovarian tissues,J,.Clin Med J，2007，120(2):110-114. ,8,王红燕，王燕蓉.玻璃化液对乳鼠卵巢的渗透反应及冻存效果研究,J,.解剖学杂 志，2006，29(增刊):47.