牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性研究（可编辑）

牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性研究（可编辑） 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性研究 中国海洋大学 硕士学位论文 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 姓名:郭玉华 申请学位级别:硕士 专业:水产品贮藏及加工工程 指导教师:曾名? 20080601牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 摘 要 本论文以牡蛎为原料,系统地研究了牡蛎肉的营养成分、牡蛎酶解液的制备、 牡蛎乳酸菌发酵饮料的制造工艺及其免疫活性,并考察了牡蛎乳酸菌发酵饮 料营养 成分和保质期。 本论文的主要研究内容包括以下个部分: .研究了牡蛎肉的营养成份。牡蛎是~种低脂高蛋白的食品,以湿基计,脂肪 占.%,灰份占.%,总糖占.%,而牡蛎蛋白占.%。除此之外,牡蛎富 含铁、锌、钙和锰等矿物质及微量元素,特别是铁、钙含量较高。 .研究了富含~肽的牡蛎酶解液的制备工艺条件。以牡蛎为原料,以水解 度、蛋白回收率和~肽含量为指标,通过单因素实验、正交实验和色谱分析确 定酶解液的最佳制备,即以菠萝蛋白酶为水解酶,水解工艺及条件为:温度?, .,料水比为:,加酶量/,时间;以蛋白回收率和水解度为指标, 研究发现热处理、超声波处理和微波处理均不利于牡蛎蛋白的水解;采用阴阳离子 树脂脱盐法,以蛋白回收率和脱盐效果为指标,最佳的脱盐条件为:流速为柱体积 的倍/,处理酶解液体积为柱体积.倍。 ,研究了牡蛎乳酸菌发酵饮料的制备工艺。以乳酸菌数、感官评分和~肽 占图谱含量为指标,通过单因素和正交实验确定牡蛎乳酸菌发酵饮料的最佳发酵条 件为:即温度?,白砂糖添加量为%,接种量为%,菌种比例::,时 间,乳糖添加量为%;对牡蛎乳酸菌发酵饮料的稳定性和杀菌温度研究发现, 添加.%.,杀菌温度?,杀菌时间为最佳,产品的色泽、风味和 稳定效果较好。 .研究了牡蛎乳酸菌发酵饮料的免疫活性。研究发现牡蛎乳酸菌发酵饮料可以 提高免疫力低下小鼠脾指数、小鼠腹腔巨噬细胞能力和血清溶血素含量,并可以促 使免疫力低下小鼠足跖显著增厚,明牡蛎乳酸茵发酵饮料具有一定的增强免疫活性的作用。 .研究了牡蛎乳酸菌发酵饮料的营养成份,并进行了贮存实验。牡蛎乳酸菌发 酵饮料营养丰富,蛋白含量为./,脂肪含量为./,灰分含量为 ./,总糖含量为./;其氨基酸组成完善,种必须氨基酸含量较 高,而且还有丰富的牛磺酸。此外,牡蛎乳酸菌发酵饮料富含钙、铁、锌和锰 等矿 质元素和微量元素,特别是钙、铁和锌的含量丰富。贮存实验表明牡蛎乳酸 菌发酵 饮料的适宜贮藏温度为,在此温度下的保质期为 。 关键词:牡蛎;乳酸菌;发酵型饮料;免疫,,,.:. ?. , , .%,.%,.%.% ,,, ,. , ; . ~ . . ,~ . ? ,. ?: 晰 。; :, .,/ , ; ,. /,. . .~ . : ? %, %,%, ::, ?:。 .% . , ..,, . . . . , ./ ,./ ,./ ./,: . . , , , . : ? . ?. : :: : 独 创。声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含 其 他人已经发表或撰写过的研究成果, 也不包含未获得 注翅遗查墓丝盂要挂别直盟的:奎拦丑窒或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》,并通过网络向社会公 众提供信息服务。保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名: 导师签字: ? \虿 竿 , 日 签字日期: 年 月 日 月 签字日期:沁 年 驴、/、、,牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 第一章文献综述 前言 牡蛎,属软体动物,瓣鳃纲,异柱目 牡蛎科动物,北方称为海蛎子,南方叫耗,是我国四大养殖 贝类之一,也是世界上第一大养殖贝类。目前己发现有多种,中国约有多种, 在广东、福建、浙江、台湾、山东等沿海地区都进行大规模养殖,主要养殖品种有 僧帽牡蛎、近江牡蛎、长牡蛎、大连湾牡蛎等四种。大型牡蛎常栖息固定于低潮线 以下或深至左右的浅海岩石上。小型牡蛎如褶牡蛎,常固着于潮间带中区, 密集生长,虽个体较小,但肉质丰满,味道鲜美,营养丰富,且生长快,分布较广 【】。我国是牡蛎养殖大国,资源极为丰富。据统计,年,牡蛎年产量达万 吨,占我国海洋水产养殖总产量的三分之一。 牡蛎及其食品的研究进展 .牡蛎保健功能的研究进展 人类对牡蛎保健功能的认识已逾千年,早在我国汉代的《伤寒论》、明代的《本 草纲目》中就已有记载。随着食品、医药、生物技术的快速发展,对牡蛎保健功能 的认识越来越深入,其新的功能正在不断地被发掘出来。我国卫生部已批准将牡蛎 列为第一批具有药用价值兼保健功效的食品。 ..降血糖功能 滕瑜等用牡蛎提取物对四氧嘧啶引起的高血糖大鼠进行治疗,发现血糖下降较 明显,胰岛素也有明显提高,表明牡蛎提取物对糖尿病具有一定的疗效作用。经临 床实验证实,它能够较好地改善临床症状嘲。徐静研究了牡蛎提取物降低小鼠血糖牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 的作用,结果表明,牡蛎提取物能阻抑四氧嘧啶诱导的小鼠血糖和丙二醛 水平升高、胰岛素和含量降低及肿瘤坏死因子的异常表达【。 .等通过小鼠实验发现,牡蛎酶解产物能够显著抑制小鼠血糖浓度的升高,具有一 定的降血糖作用【。 ..增强免疫功能 许多研究表明,牡蛎能够增强机体免疫力。等研究了牡蛎提取物对艾滋 病毒感染者和正常人的免疫细胞的影响。发现牡蛎提取物在激活剂白介素..、存 在时,能够促使细胞大量增殖,以减缓艾滋病患者免疫功能下降的趋势【。张冬 青等研究,牡蛎提取物对小鼠的免疫功能有正向调节作用,可以阻碍由 环磷酰 胺所引起的免疫低下反应【】。王俊等研究发现,/牡蛎多糖能有效增加正常 小鼠的脾淋巴细胞转化率,对小鼠、细胞活性、、小鼠腹腔巨噬细胞 吞噬鸡红细胞能力、荷瘤小鼠脾细胞活性起正向调节,表明牡蛎多糖能增强小鼠细 胞免疫、体液免疫功能【。 ..降血压作用 ,在血压调节方面起着 血管紧张素转化酶? 重要作用,当其受到抑制时血压就会降低。于娅等采用酶解制备了对有较 好抑制作用的牡蛎功能短肽,./的牡蛎功能短肽对抑制率为.%【。 欧成坤等通过试验证明,经酸性蛋白酶得到的牡蛎酶解物都具有一定的抑 制活性,水解度为%的酸性蛋白酶酶解产物,蛋白浓度为/时,对的 抑制率为.%【。检测了太平洋牡蛎酶解产物的抑制活性,水解 物对的为/,水解物经过反相高压液相色谱分离收集到种组分, 其中组分的为./。 ..抗疲劳作用 王元勋等发现牡蛎肉的%醇提取液具有抗疲劳作用】。张部昌等以小鼠负 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 重游泳时间、血尿素氮和血乳酸浓度为指标,探讨了以牡蛎酶解液为主要组成的牡 蛎营养液的抗疲劳活性,结果显示牡蛎营养液能显著降低小鼠的血尿素氮和血乳酸 水平,提高血乳酸恢复速率,同时能显著延长小鼠负重游泳时间,表明牡蛎营养液 。 具有抗疲劳作用 ..降血脂作用 当血中的总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平单项或多项超过正常 范围时,可称血脂异常,俗称高血脂。高脂血症是动脉粥样硬化和冠心病等疾 病的重要危险因素。刘赛等研究证明,牡蛎提取物能够明显降低高血脂鹌鹑的血浆 总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和载脂蛋白的水平,起到降血脂作用 【】。等研究了牡蛎提取物对小鼠脂质代谢的影响,证实其具有降血脂的作 。 用【 ..抗肿瘤作用 目前,国内外都有牡蛎提取物抗肿瘤活性的报道。美国国立癌中心、法国巴黎 大学药学院、美国迈阿密大学医学院关于牡蛎提取物的共同研究结果表明, .可以使细胞内防癌和防老化功能的谷胱甘肽增殖倍,并能减轻具有强 力抗癌活性的抗癌药物亚德利亚霉素对心脏的副作用。在向试管里培养的人 体细胞.供给后,细胞中的持续增升高达倍提高到%【】。 张辉研究发现,酶解牡蛎脱脂蛋白得到的寡肽在浓度为 /下对市癌细 胞,白血病细胞和人白血病细胞有较明显的细胞增殖抑制作用,抑制 率分别为.%,.%和.%,说明牡蛎寡肽粗品具有较好的抗肿瘤活性【】。 王颖等研究了牡蛎提取物的抗肿瘤作用,发现牡蛎提取物不仅能提高荷瘤小鼠的免 疫功能,还能抑制小鼠肝癌和裸鼠结肠癌的生长。揭示了通过提高天然杀伤 细胞活性来抑制肿瘤细胞生长【埔】。 ..保肝功能 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 等发现牡蛎提取物可以抑制肝损伤引起的草酰乙酸转氨酶和谷 氨酸.丙酮酸转氨酶水平的升高,对肝脏具有一定的保护作用【】。李文立等研 究表明,牡蛎粉可明显降低四氯化碳引起的血清丙氨酸氨基转移酶及天门冬氨 酸氨基转移酶水平的升高。病理学研究证实,牡蛎粉可使四氯化碳所致肝细 胞气球样变动物的发生例数明显减少,病变程度明显减轻,气球样变评分显著降低, 明显促进了肝细胞的再生及肝功能的恢复【】。 .牡蛎产品的开发状况 牡蛎的壳和软体都具有较高的利用价值,充分利用牡蛎软体和牡蛎壳开发功能 牡蛎产品,具有重要的社会价值和经济价值。 牡蛎软体干物质中蛋白质含量高达%,且氨基酸组成完善,为优质蛋白质。 特别值得指出的是,牡蛎中含有丰富的牛磺酸。牛磺酸是一种含硫氨基酸,具有消 炎解毒、保肝利胆、降血脂、促进幼儿大脑发育及安神补脑等作用。糖原含量高是 牡蛎软体组成的一个显著特点,约占牡蛎提取物的%。糖原是组织能源物质的 储备形式,是体力脑力活动效率及持久力的物质保证,能够改善心脏及血液循环, 增进肝脏的功能,具有保肝作用。糖原还可直接为机体所吸收利用,从而减轻胰腺 负担,对糖尿病的防治具有十分重要的意义。此外,牡蛎软体含有大量的二十二碳 六烯酸和二十碳五烯酸等不饱和脂肪酸、维生素及硒、锌等微量元素。 等不饱和脂肪酸具有防止动脉硬化、抗血栓以及抗衰老作用,并有增强免疫功 能和防癌作用;锌参与核酸、酶等合成,具有促进机体发育、性成熟、生血等多种 生理机能,锌的含量是牡蛎保健品的主要指标之一,被誉为“生命之花”】。 近年来,我国研究者已经进行了大量的牡蛎软体研发工作,并有商品上市。海 王集团生产的“海王金牡蛎”是利用自养优质牡蛎为主原料,采用生物提炼技术提取 其精华,再予以科学配方和精细加工而成的,具有调节人体免疫功能,缓解疲劳、 补肾强精、抗衰美颜等功能。新疆世丹药业有限公司研制的阿胶牡蛎口服液是专门 为儿童的补钙产品,本产品以牡蛎、阿胶为原料,不仅营养丰富,而且能为儿 童补充充足的钙质,促进骨胶原的形成,保证钙质在骨骼上的有效沉积。广东珠海 海洋滋补食品公司生产的牡蛎全营养片,富含蛋白质、糖原、氨基酸、多种 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 维生素、矿物质及、等微量元素,具有养阴润燥、保肝益肾、调节内分泌、预 防心脏病、高血压等作用。山东东营制药厂研制的牡蛎王胶囊,主要成分为牡蛎壳、 鲜牡蛎肉提取物、活性钙、葡萄糖酸锌、牛黄酸和甘草等,此产品辅助治疗慢性肝 炎效果较好。 目前,我国除己上市的牡蛎产品以外,还有一些牡蛎产品已进入中试。如江南 大学、浙江海通食品集团联合开发的牡蛎营养口服液及大连非得生物产业有限公司 牡蛎肽功能制品已进入中试。 在国外,以牡蛎软体为原料开发的牡蛎疗效品、食品添加剂、调味品己纷纷上 市。其中,日本在该领域的开发水平最高,以牡蛎软体提取物为原料生产的食品和 疗效品的品种达多种,研制生产出了胶囊型、片剂型及液体型的食品、疗效品, 产品形式有单一成分产品、配方产品、添加剂型产品,年产值在亿日元以上。在 .等报道, 美国,牡蛎食品和疗效品等营养辅助食品已经成为一大产业【。最近, 在发酵的牡蛎调味料中分离出血管紧张素转化酶抑制剂,该物质可以有效降低小鼠 的高血压,具有较好的降压作用【。 .高新技术在开发牡蛎产品中的应用现状 随着科学技术的发展,超微粉碎技术、超高温瞬时杀菌技术、超声波技术、生 物技术等高新技术已成功地应用到牡蛎产品的开发中,促进了牡蛎产品行业的快速 发展。 ..超微粉碎技术的应用 超微粉碎技术是世纪食品工业十大高新加工技术之一,一般是指将以 上的物料颗粒粉碎至?以下的过程。超微粉体具有比表面积大,孔隙率高, 包容性强,溶解性、分散性、化学活性好及原料吸收、利用率高的特性。王亮等利 用超微粉碎技术从牡蛎壳中提取功能性因子.活性钙【】。江南大学利用超微粉碎技术 进行了牡蛎壳的粉碎和压片工艺研究,在此基础上进行了牡蛎超微钙片产品的中试 研究。 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 ..生物技术的应用 食品生物技术就是通过生物技术手段,用生物程序生产细胞或其代谢物质来制 造食品,改进传统生产过程,以提高人类生活质量的科学技术。现代生物技术主要 包括基因工程含蛋白质工程、细胞工程、酶工程和现代发酵工程技术等。国内外已 报道了发酵工程和酶工程在开发牡蛎产品中的应用。乔向英等利用酶解技术和发酵 技术研制出具有助消化、治疗便秘等功效的保健牡蛎乳酸饮料【。 .等通过发酵 技术研制出具有降血压功能的功能性调味品【】。于娅等利用酶技术制得具有降血压 功效的功能性因子【】。 ..超声波技术的应用 超声波是一种高频机械波,具有溶胀、节能、高效的特点,利用超声波技术强 化提取,可以提高功能性产品原料中的生理活性物质提取率,缩短提取时间,节约 成本,提高产品的质量。陈檬等研究了利用超声波技术提取牡蛎中的牛磺酸等氨基 酸,结果表明,用超声波处理后,氨基酸提取率显著提高,并同时提高了蛋白质、 脂肪、糖元的含量【。 ..超高压技术的应用 目前,微生物数量超标严重阻碍了牡蛎产品的开发、生产,如何减少牡蛎原料 中微生物的数量是牡蛎保健品行业发展亟需解决的问题。食品超高压加工技术被誉 为“食品工业的一场革命”,它不仅能有效地杀灭微生物,而且可以保持产品的质地、 风味和营养价值。等报道了高压处理对牡蛎的影响,指出在适宜的条件 下,高压处理的牡蛎不仅微生物数量大大减少,而且营养价值和风味没有发生改变, 并使牡蛎壳打开,促进了牡蛎工业化的生产。纠】研究了高静水压对牡蛎中 大肠杆菌、假单胞菌、需氧菌、嗜冷细菌的作用,发现牡蛎经高静水压处理后大肠 杆菌、假单胞菌、需氧菌、嗜冷细菌发生明显的变化。需氧菌明显降低;假单胞菌、 大肠杆菌完全消失;嗜冷细菌在和下完全消失,在和 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 下数量明显减少。 .牡蛎产品开发的前景及问题 我国是牡蛎养殖的大国,牡蛎产量占养殖贝类的%左右,资源极为丰富。然 而,随着牡蛎养殖技术的快速发展,牡蛎产业已出现供过于求和价格下跌趋势,实 现牡蛎高值化利用是牡蛎养殖业健康持续发展的先决条件之一。目前,消费者对于 牡蛎的保健功能了解甚少,可以想象,一旦更多消费者了解了牡蛎的营养及保健功 能,功能性牡蛎产品的消费量将大大增加。目前大部分牡蛎都被直接食用,而包括 功能性牡蛎产品在内的牡蛎制品还比较少;生物技术等高新技术在牡蛎产品的开发 和活性研究中的应用正在逐渐扩展。由此看出,开发牡蛎产品具有巨大的发展前景。 但是,从我国目前牡蛎产品开发现状分析,有些问题亟待解决。 我国牡蛎产品的研发大多只关注牡蛎中牛磺酸的生理功能及营养价值或牡 蛎的全营养功能,而忽略其它成分的独特功能。国内外已经有人对牲蛎其它 成分的 生理功能进行了研究,如我国的王俊等发现牡蛎多糖具有抗肿瘤和增强免疫功能【, .等研究了牡蛎肽的抑制活性】。对这类物质进行深入研究,并以这类物 质为主,生产功能性牡蛎产品,将为牡蛎功能性产品开发开辟新途径。 牡蛎中钾、钠盐含量较高,有人研究发现牡蛎肉中钾、钠的含量分 别为、,这与医疗保健业提倡的低钠膳食相矛盾。因此,在开发功能 性牡蛎产品时,在不影响产品质量和风味的情况下,需进行脱盐处理。 寡肽的吸收和营养特征及其在食品工业领域的应用前景 在对蛋白质的深入研究过程中,人们发现了一类由氨基酸残基构成但又不同于 蛋白质的中间物质。这类具有蛋白质特性,但比蛋白质分子结构简单,分子量小, 由氨基酸残基通过肽键相连的一类化合物就叫做肽。通常情况下,含有氨基酸残基 数少于个的称为寡肽:超过个但少于个的称为多肽;氨基酸残基数在 个以上的就是人们熟悉的蛋白质【。 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 .寡肽的吸收和营养特征 现代生物代谢研究发现:人类摄取的蛋白质经过消化道的多种酶水解后,不像 以前认为的那样仅以氨基酸的形式吸收,更多的是以低肽的形式直接吸收。 蛋白质 的水解产物是在小肠中被粘膜细胞吸收的。小肠的刷状缘上存在着肽的转运系统, 小肽尤其是二肽和三肽可完整地被小肠粘膜细胞吸收,而且肽转运系统的吸收速率 比?的更高。等人用“氨基酸吸收强度”综合了吸收速度和程度这个指标, 比较了鸡蛋白酶解产物和相应氨基酸混合物的吸收情况,研究表明,肽的吸收强度 比游离氨基酸要高.%。等【】报道,乳清蛋白的部分酶解产物主 要成分是小肽,其氨基酸吸收率和吸收程度比类似乳清蛋白的氨基酸混合物更高。 肽的吸收还可以避免氨基酸之间的吸收竞争。等人【】研究发现,小肽与 游离氨基酸不相互影响彼此的吸收。等【】报道,当与以游离形式存 在时,两者相互竞争吸收位点,游离有降低肝门静脉水平的倾向;而当后 者以肽的形式存在时,前者对其吸收则无影响。 某些寡肽不仅能提供人体生长发育所需的营养物质,且同时具有重要的生理功 能,如促进矿物质吸收、促进氨基酸的吸收、促进蛋白质合成、提高动物的生产性 能、防治肝病脑病、抗菌、抑制血管紧张素转化酶活力、降低血液胆固醇含量、提 高人体免疫力的功能等【。 .寡肽在食品工业领域的应用前景 寡肽转运系统具有转运速度快、耗能低、不易饱和、易吸收的特点.而吸收 慢、吸收耗能高、载体易饱和。寡肽作为肠腔的吸收底物,还能提高刷状缘氨肽酶 活性、氨基酸和二肽的载体活性和数目。寡肽直接作为肠腔吸收底物不仅能提高组 分氨基酸的吸收利用率,而且能改善其它氨基酸和寡肽的吸收效果和生理功能。 在食品工业领域,由于小肽以上的优点,可作为肠道吸收功能差、处于消化道手 术康复期、高负荷运动或过度疲劳时人员的蛋白营养源,可用在临床营养、运动营 养食品或中老年人食品中。对于中年人而言,中年人处于生理功能的全盛时期,也是 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 开始进入衰老的过渡期,身体经历着从盛到稳定、开始衰老的巨大变化过程,消化、 循环系统功能逐渐衰退,但单位体重对氮和氨基酸的需求量并不减少,且随着年龄的 增长,人体对食物中的蛋白质的利用率逐渐下降,只相当年轻时的%%,而 对蛋白质分解却比年轻时高,容易造成营养不良,寡肽不经消化就可以被吸收,非 常适合中年人快速补充蛋白质。 乳酸茵的保健作用 .乳酸菌简介 乳酸菌 是一类革兰氏阳性杆菌或球菌,是一群能利用碳水化 合物主要指葡萄糖发酵产生乳酸,不形成芽孢,不运动,厌氧或兼性厌氧,不能还 原硝酸盐的一类细菌的总称。如按上述定义和目前研究的进展,其涉及的科属种则 相当多。在自然界已发现的这类菌在细菌分类学上划分至少有个属,即:乳杆菌 属、肉食杆菌属、链球菌属、乳酸链球 菌属、尼球菌属、气球菌属》、奇异菌属 、漫游球菌属、明串珠菌属和片球菌属 等。当涉及寄主人或动物的健康功效时,乳酸菌也包括肠球菌 砌纪阳螂和双歧杆菌够面口陀,.甜聊。在食品发酵和加工利用中常用的乳酸菌 分属乳杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属;、 明串珠菌属彪“?聆幻和片球菌属尸疣?郴。 乳酸菌属于食品级安全 ,的微生物,与人类的生 活密切相关,它们是人体和动物肠道微生物茵群中的优势种类,具有调节肠道菌群 平衡、提高食物消化率和生物价、降低血清胆固醇、抑制肠道内腐败菌的生 长以及 腐败产物的形成等作用。 .乳酸菌的保健功能 ..治疗肠道功能紊乱,维持肠道茵群平衡 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 人体肠道内有数百种细菌,包括有益菌、有害菌和中立菌三大类,它们分别集 中在肠道的某个部位形成菌群。在机体正常的情况下,有益菌占优势,此时称肠道 菌群平衡。当宿主机体抵抗力较弱时,有害菌会引起机体发病。而乳酸菌进入肠道 后,即在肠道内繁殖,抑制病原菌和有害人体健康的细菌繁殖,从而起到预防感染、 维持肠内菌群的平衡。乳酸菌及其代谢产物能够促进宿主消化酶的分泌和肠道的蠕 动,促进食物的消化吸收并预防便秘的发生。乳酸菌的代谢产物乳酸和醋酸对病原 性微生物有拮抗作用。产酸还使肠道和下降,促进肠蠕动,防止了病原菌的 定植,维持肠道正常生理功能。有些乳酸菌如乳链球菌所产生的细菌素对许多革兰 氏阳性菌,包括葡萄球菌、球链菌、微球菌等有抑制作用。】【作为一种高效、 无毒的天然防腐剂,己被广泛用于乳制品、罐头食品、高蛋白食品和乙醇饮料的防 腐保鲜。 ..抗肿瘤作用 乳酸菌抗肿瘤作用是由于肠道菌群的改善,抑制了致癌物质的产生,一般认为, 乳酸菌及其代谢产物活化了免疫功能,抑制了癌细胞的增殖。等四证实了 瑞士乳杆菌可以大大降低大肠癌的发生率。等【】报道保加利亚乳酸杆菌有抗白 血病的活性。嗜酸乳杆菌也可有效地抑制腹水癌细胞的繁殖。 ..营养作用 乳酸菌发酵后产生的乳酸,可以提高钙、磷、铁的利用率,促进铁和维生素 的吸收。乳糖分解产生的半乳糖,是构成脑神经系统中脑苷脂的成份,与婴儿出生 后脑的迅速生长有密切关系。经研究发现,乳酸茵发酵制品中族维生素含量有所 增加。烟酸含量由普通牛奶的./增加到./;叶酸从./ 增加到./;维生素从./增加到./】【。 ..降低胆固醇作用 傅晓丽等【】证明尿链球菌等在动物体内及人体内均有降低血清胆固醇作用。 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 和调查发现,非洲族人即使食用高胆固醇膳食,但由于大量 饮用由乳杆菌发酵的乳制品,其体内血清胆固醇含量普遍较低。 ..延缓机体衰老 据研究,人体衰老与肠内菌群有关【引。乳酸菌产生的乳酸,抑制了肠 内腐败细菌的生长,从而减少了这些细菌产生的毒胺、吲、氨、硫化氢等致癌物质, 和其他毒性物质,使机体衰老过程变得缓慢。保加利亚人的长寿和长期服用酸奶有 关‘。细野明义等通过实验证实了乳酸菌的抗变异原性,并发现了乳酸菌能够产 生超氧化物歧化酶。是一种含有金属离子的酶,其生理功能是清除体内 代谢过程中产生的过量超氧阴离子,延缓衰老,提高机体对那些由于自由基侵害而 诱发的疾病的抵抗力,提高机体免疫力,减少肿瘤患者在化疗时的疼痛和副作用。 ..增强机体免疫力 大量研究发现,食品工业中常用的乳酸菌均具有一定的免疫调节活性。其中, 以乳酸杆菌属和双歧杆菌属研究较多。研究中,不仅证实其活菌体有免疫调节生理 的作用,而且证实乳酸菌的热杀死的菌体、菌体破碎液、细胞壁分离物、细胞质提 取液和发酵液均具有免疫活性。乳酸菌及其发酵产品激活和调节免疫系统的作用基 本相似,可以激活巨噬细胞、产生体液、产生淋巴细胞和自然杀伤细胞, 增加肠道中的产生,释放.,.,.、.,及粒细胞集落刺激 因子.等。乳酸菌能阻断许多微生物的入侵和黏附口服乳酸菌能刺激人体产生 非特异性免疫。乳酸菌和双歧杆菌能够参与细胞免疫和体液免疫,从而发挥特异性 免疫调节作用。据报道,乳酸菌发挥免疫调节作用的主要成分由肽聚糖、多糖和磷 壁酸组成,肽聚糖对免疫反应具有佐剂作用。保井久子掣】等研究发现短双歧杆菌 可以促进抗体产生。厚井芳则等】研究发现婴儿双歧杆菌可以促使小白鼠的细胞 分裂,活化吞噬细胞。 ..其它功能牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 研究发现,乳酸菌还具有控制内毒素、抗辐射等作用。等实,双 歧杆菌对门脉肝硬化性脑病有缓解作用。口服乳酸菌、双歧杆菌的动物,经放射线 照射后,比未服乳酸菌的对照动物存活时间长或免于死亡,其机制可能是活性细菌 及其代谢产物有保护造血系统和抗突变的作用。 立题目的与意义 .研究的目的 本实验依据牡蛎和乳酸菌的营养保健功能、寡肽营养消化特点,研究出一种风 味独特,营养丰富,有益于各类人群食用的牡蛎乳酸菌发酵饮料。实验以牡蛎为原 料,采用酶解、液相色谱、离子交换等方法,获得口感较好、~的寡肽含量较 高的酶解液;以感官、乳酸菌数等为指标,所获得的酶解液经乳酸菌发酵,确定了 一条牡蛎乳酸菌饮料发酵的最佳工艺。 .研究的意义 我国是牡蛎养殖的大国,牡蛎产量占养殖贝类的%左右,资源极为丰富。目 前,国内牡蛎以鲜食和制成千肉制品为主,少量加工成蚝油或其它调味品。随着牡 蛎养殖业的快速发展,牡蛎已出现供过于求和价格下跌的趋势,开发牡蛎加工利用 的新途径已成为牡蛎养殖业进一步发展的先决条件。牡蛎乳酸菌发酵饮料的研究不 仅实现了牡蛎的高值化利用,促进了牡蛎养殖业健康持续发展,而且本实验为牡蛎 的开发利用提供了理论依据和实践指导。 牡蛎乳酸菌发酵饮料是由富含寡肽和其它营养素的酶解液经保加利亚乳杆菌和 嗜热链球菌发酵而成,不仅营养丰富,而且具有寡肽和乳酸茵的的优点,适合于各 种人群的营养需求,特别适宜于高负荷运动和中老年等肠道吸收功能差、消 化能力 较弱的人群营养需求和生理特点,为这类人群提供了一种兼具营养和保健功 能的新 食品。 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 第二章牡蛎营养成分分析 实验材料 .实验原料 太平洋牡蛎 ,月购于青岛团岛批发市场,鲜活,剥壳, 。。冻藏备用。 。试剂 甲基红.溴甲酚绿混合指示剂、%的硼酸溶液、浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜、 ./标准盐酸溶液、氯仿、甲醇、苯酚,以上均为分析纯。 .主要仪器 .高速组织捣碎机 上海标本模型厂; 型分光光度计 上海精密科学仪器有限公司; .型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司; 电子天平 奥豪斯国际贸易有限公司; ?电热恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂; 原子发射光谱仪 美国瓦里安。 实验方法 .总蛋白含量的测定 采用标准方法..半微量凯氏定氦法测定牡蛎总蛋白含量【】。此方法 是测定有机物含氮量的经典方法。当含氮有机物与浓硫酸共热时有机物被氧化分解, 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 生成二氧化碳、水、氨,氨与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中,生成的硫酸铵在凯氏 定氮仪中与氢氧化钠反应生成的氨经水蒸气蒸馏,氨被带入接收瓶中,被硼酸吸收, 最后用已知浓度的盐酸滴定硼酸铵溶液,根据消耗的盐酸量即可计算出样品含氮。 .脂肪含量的测定 采用氯仿.甲醇法测定牡蛎脂肪含量【。此方法是将样品分散于氯仿.甲醇混合 液中,在水浴中轻微沸腾,氯仿、甲醇和试样中的水分形成三元抽取体系,能有效 地将样品中的脂类包括结合态脂类全部提取出来。经过滤除去非脂类成分,回 收溶剂,残留脂类用石油醚提取,然后蒸馏除去石油醚,在。左右的烘箱中干 燥,残留物即为脂肪。 本法对于富含蛋白质和脂蛋白、磷脂等的样品提取率最高。 .灰分的测定 采用灼烧法测定牡蛎灰分含量。在空气中使有机物灼烧灰化,在灼烧过程中, 有机物中的碳、氢、氮物质与氧结合成二氧化碳、水蒸气、氮氧化物而挥发, 残留 的无色或灰白色的氧化物即为灰分。按标准方法..【】【删取一定量的牡蛎 于己经恒重的磁坩埚中,电炉上通风橱内加热炭化,炭化完全后置马弗炉中 灼烧至残渣呈浅灰色为止,冷却后称量。 .总糖的测定 标准曲线的制作:准确称取干燥的葡萄糖.溶于烧杯中,然后定容在 容量瓶中。分别吸取.,.,.,.,正蚓标准葡萄糖溶液,加水补 至,然后加入%苯酚及浓硫酸立即摇匀,静置,冰水冷却, 在处检测吸光度。以吸光值为纵坐标,标准葡萄糖质量为横坐标得到标准 曲线【】。 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 .无机质的测定 采用电感偶合等离子体原子发射光谱法测定牡蛎无机质的含量【】【】。 实验结果 .牡蛎的蛋白含量 用半微量凯氏定氮法测得牡蛎蛋白含量,以湿重计为.%,以干重计为.%。 因此,牡蛎是一种高蛋白的食品。 .牡蛎的脂肪含量 测定结果表明,牡蛎是一种低脂肪食品,总脂肪含量以湿重计仅为.%,以 干重计为.%。 .牡蛎的灰份含量 食品灰分是评分食品质量的指标之一。测定结果表明,牡蛎总灰分占其湿重 的 .%,占其干重的.%。 .牡蛎的总糖含量 .。 . 吸. 光~。 .。 值. . . . . . 糖质量 图糖含量标准曲线 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 根据标准曲线,测得牡蛎肉中总糖占湿重的.%,占干重的.%。糖原也 是一种很重要的生理活性物质,它是人体内细胞进行代谢的能源,可改善心 脏和血 液功能,并能增进心脏功能,具有保肝作用。糖原可直接为机体吸收利用,从 而减 轻胰腺负担,对糖尿病的防治十分有利。 .牡蛎的无机质含量 牡蛎无机质含量的测定结果如表.所示。 表牡蛎肉中各种无机质的含量对湿重/ ? / 注: “.”表示样品中该无机质含量低于最低检测线,无法检出. 由表中数据可知,牡蛎肉中富含铁、锌、钙和锰等矿物质和微量元素。锌对 人 体而言十分重要,有抗癌、抗衰老、抗毒性、治疗溃疡、提高食欲和增强组 织再生能 力等作用。牡蛎肉中含有的铅和砷等有毒重金属元素符合国家标准。 小结 实验结果表明,牡蛎是一种低脂高蛋白的食品,脂肪含量仅为湿重的.%,而 蛋白含量占湿重的.%。此外,牡蛎还富含糖分占其湿重的.%,铁、锌、 钙和锰等矿物质和微量元素,特别是铁、钙含量较高。 辱蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 第三章富含寡肽的牡蛎酶解液的制备 引言 肽的制各方法和途径通常有三种: 一是从自然界生物体中提取其本身固有的各种天然活性肽。但是,生物体中 天 然活性肽含量很低,提取成本很高;另外,提取生物活性肽残存有机溶剂又会 带来 毒性问题。 二是采用合成方法制备生物活性肽,包括化学合成法、酶合成法和重组技 术合成法【引。化学合成法常用于合成高营养价值、中等长度的医药用肽,但采用这 种方法制取活性肽反应底物和反应试剂价格高,反应过程中能产生有害物质。酶合 成法相对有很多优点,如反应温和,酶催化位置有方向性等,但反应副产物多,最 适酶缺乏及产率过低等因素都制约着其发展。而使用重组技术只能合成大分子 肽类和蛋白质,对人类需求的具有感官和营养价值的小肽,这种方法也受到一定限 制。 三是通过蛋白质降解获得具有各种生理功能的活性肽。采用酶解方法生产生物 活性肽具有以下优点:一是可以生产大量小肽且成本低;二是反应底物、反应试剂 和反应环境没有危害。目前最基本方法是使用蛋白酶进行简单水解,此种方法除可 释放出各种为人类所需要生物活性肽之外,将食物降解为小分子肽还可使其易消化。 本文用、蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶和风味蛋白酶对牡 蛎进行酶解,综合考虑水解度、蛋白回收率、苦腥味和澄清度,选出酶 再进行正交实验,根据蛋白回收率、水解度和.寡肽占图谱含量确定最佳酶解 工 艺;利用处理过的阴阳离子树脂对酶解液进行脱盐,以蛋白回收率和感官评 分为指 标,选出最佳的脱盐工艺。 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 实验材料 .实验原料 太平洋牡蛎 ,月购于青岛团岛批发市场,鲜活,剥壳, .?冻藏备用。 .主要试剂 酸性蛋白酶 上海生工分装: 公司: 蛋白酶 丹麦诺维信公司; 胃蛋白酶 公司; 风味蛋白酶 济南百泰科技有限公司: 马尿酸三肽 公司; 离子交换树脂× 国药集团化学试剂有限公司; 离子交换树脂 国药集团化学试剂有限公司; 牛血清白蛋白 上海生物工程有限公司; 乙腈色谱纯;牛胰岛素、维生素和,均为国产色谱纯; 其他试剂均为国产化学分析纯。 .主要仪器 .高速组织捣碎机 上海标本模型厂;电热恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂; ..立式冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂; .型磁力加热搅拌器 杭州仪表电机厂; 电子天平 奥豪斯国际贸易有限公司: .型精密计 上海精密科学仪器有限公司; 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 高效液相色谱 公司; 超纯水系统 公司; .×. 。 实验方法 .蛋白质水解度测定 蛋白质水解度酶解液中游离氨基氮/样品总氮量×%【。 氨基态氮采用甲醛电位滴定法测定【】; 总氮含量采用半微量凯氏定氮法..定。 .蛋白回收率的测定 对原料进行水解,计量水解离心后上清液的总体积,取蛋白水解液,用凯 氏定氮法测定出上清液中蛋白含量,根据下式计算蛋白质回收率【儿】: 蛋白质回收率上清液中总蛋白质含量/底物蛋白质含量%。 .肽分子量的测定 采用高效凝胶排阻色谱法制作标准品相对分子质量工作曲线。该法所用标准 品 为牛血清白蛋白、维生素、胰岛素和马尿酸酸三肽,它们的相对分子质量分 别为 、、、.。 层析条件:色谱柱.慨:流动相为%乙腈和.%:流速 ./:紫外检测器在处检测吸收峰;柱温?。根据标准品相对分子 质量及其出峰时间,制作标准品相对分子质量工作曲线。 牡蛎酶解液相对分子质量的测定:一定量牡蛎酶解液用.膜过滤后上柱, 层析条件跟标准品条件相同,根据标准曲线计算出一寡肽的含量。 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 实验设计 .蛋白酶的筛选 根据酶的水解特性和有关文献,选择、蛋白酶、胃蛋白酶、 酸性蛋白酶和风味蛋白酶五种酶进行单酶水解实验,酶解工艺如下: 牡蛎一洗净后加入倍体积的水一匀浆一加入蛋白酶保温酶解一灭酶 一/离心一收集上清液。 单酶水解条件如表.所示: 表不同蛋白酶的酶解条件 . 蛋白酶水解的单因素实验 ..不同水解温度对酶解的影响 取五份打浆牡蛎肉每份,用酸碱调至,料水比:,加酶量为/, 分别在。,。,?,?,条件下酶解,然后沸水灭酶,离,巴、, 测定酶解液中蛋白回收率和水解度。 ..不同对酶解的影响 取五份打浆牡蛎肉每份,分别调至.,,.,,.,料水比:, 加酶量为/,在中得到的该酶的适宜温度下水解,然后沸水灭酶, 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 离心,测定酶解液蛋白回收率和水解度。 ..不同料水比对酶解的影响 取五份打浆牡蛎肉每份,分别按料水比:,:,:,:,:配成 牡蛎液,加酶量/,在、得到的最适温度和最适下水解,然后沸水 灭酶,离心,测定酶解液蛋白回收率、水解度。 ..不同加酶量对酶解的影响 在、、得到的最适温度、最适、最适料水比条件下,分别加入/, /,/,/,/蛋白酶水解,然后沸水灭酶,离心, 测定酶解液中蛋白回收率、水解度。 ..不同水解时间对酶解的影响 在、、、得到的最适温度、最适、最适料水比、加酶量的条 件下水解,分别于,,,,下取出一定的水解液灭酶,测定酶解液中蛋白回 收率、水解度。 . 蛋白酶正交实验 在温度,选择、料水比、加酶量和时间作为影响因子,以蛋白回收率、 水解度为指标,对蛋白酶水解牡蛎的条件进行正交实验优化。 表 的正交试验因素与水平料水比 水平 加酶量 时间 堕 垫 . : : . :牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 .水解度与寡肽含量的关系及最佳酶解条件的确定 依据单因素试验和正交实验所得到的实验结果,选择几组不同水解度的酶解 液 采用高效凝胶排阻色谱法测定~寡肽的含量,选出~寡肽含量最高的酶解 液,确定最佳的酶解工艺。 .不同处理对牡蛎蛋白水解的影响 ..热处理温度对牡蛎蛋白酶解的影响 加热时间不变,在不同温度?,。,?,下对牡蛎进 行预处理,在最适的条件下酶解,比较未经热处理与热处理酶解蛋白回收率、 水解 度。 ..超声波处理对牡蛎蛋白酶解的影响 在?室温,超声功率为的条件下,对牡蛎液进行不同时间,, ,的超声波预处理,然后在最适的条件下酶解,比较未经超声波处理与超 声波处理酶解蛋白回收率、水解度。 ..微波处理对牡蛎蛋白酶解的影响 在微波功率和低火加热条件下,对牡蛎液进行不同时间,,, 的微波加热预处理,在最适的条件下酶解,比较未经微波处理与微波处理酶 解蛋白 回收率、水解度。 .水解物的脱盐 蛋白水解物中阳离子为钠离子,阴离子为氯离子,为除去这些离子,本实验选 择强酸性阳离子交换树脂和强碱性阴离子交换树脂赵新淮,对酶 解液进行处理。牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 ..树脂的预处理 将树脂置于去离子水中浸泡,去离子水的量约等于被处理树脂体积的 两倍,然后放尽去离子水,用去离子水漂洗,使排出水不带黄色。 阳离子树脂用~%溶液浸泡一,其量同上,放尽碱液,用去 离子水漂洗直至排出水接近中性。再用%的的溶液浸泡小时,放尽酸 液,用去离子水漂洗直至排出水接近中性,待用。 阴离子树脂用%的溶液浸泡,其量同上,放尽酸液,用去离子 水漂洗直至排出水接近中性。再用%的溶液浸泡小时,放尽碱液, 用去离子水漂洗直至排出水接近中性,待用。 ..流速的确定 将一定体积的牡蛎酶解液,分别以、、、、、、、倍柱体积/ 的流速通过十型阳离子交换树脂进行脱钠处理,待流出液左右时停止加样。 收 集,合并流出液,然后以同样的流速将脱钠后的水解液,通过‘型阴离子交换 树 脂至流出液呈弱酸性左右。收集,合并流出液。以蛋白质回收率,脱盐效果 为指标,确定最佳的脱盐流速。 ..酶解液体积和柱体积关系 根据文献报道,通过型阳离子交换树脂进行脱钠处理时为左右时停止 进样,通过。型阴离子交换树脂脱阴离子时,为弱酸性停止进样。本试验在此 基础上对酶解液体积和柱体积之间的关系进行了研究。 将牡蛎酶解液,以倍柱体积/的流速通过旷型阳离子交换树脂进行脱钠处 理,来脱除阳离子。收集,合并流出液,然后以同样的流速将脱钠后的水解液,通 过’型阴离子交换树脂。收集,合并流出液,以蛋白质回收率,脱盐效果为指标, 确定最佳的脱盐工艺。 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 实验结果与讨论 .蛋白酶的筛选 表不同酶解产物的特性 注: “”表示腥味或苦味很强, “”表示腥味或苦味较强, “”稍有味道。 从表.可看出,酸性蛋白酶、蛋白酶、菠萝蛋白酶水解液的蛋白质回 收率和水解度较高,但从苦味、腥味、澄清度综合考虑菠萝蛋白酶最为理想。尽管酸 性蛋白酶和蛋白酶的蛋白质回收率和水解程度均高于菠萝蛋白酶,但是考 虑到混浊的产品需要澄清和脱色,苦味、腥昧较重的产品需要脱腥、脱苦,这必然 导致产品营养的损失和加工成本的增加,所以本实验选择菠萝蛋白酶进行酶解。 . 蛋白酶水解的单因素实验结果 ..不同水解温度对酶解的影响 不同水解温度对牡蛎酶解的蛋白回收率及水解度的影响分别如图.和.所 不。 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 如 加 ? 勰 ? 芭 集 孙 弱 蜊 驰 涟 望 卯 坠 毖 钙 瞄 们 加 ?? ? ? ? ? ? ? ? ? 温度 温度 图温度对蛋白回收率的影响 图温度对水解度的影响?实验结果表明,随着温度的升高,蛋白回收率和水解度也增加,当温度升高到 一定值时,即?时,蛋白回收率和水解度达到最大值,当温度继续升高时,蛋白 回收率和水解度将下降。这是因为蛋白酶只有在一定温度范围内才具有稳定性,温 度过低时,酶活力受到抑制,温度过高时,酶发生热失活,催化反应速度降低,导 致蛋白回收率和水解度低【】嗍。因此在蛋白酶稳定的温度范围内,温度提高到一定 值,有利于水解反应的进行,可以获得最高的蛋白回收率和水解度,超过此温度, 蛋白回收率会下降。当温度为?,酶解液的蛋白回收率和水解度最高,并且此温 度所得到的酶解液澄清透明,腥苦味较轻。 ..不同对酶解的影响 巴 型 鐾 辞料擎叵匹嘲 ?加??们?加加 . . . . . . 图 与对蛋白回收率的影响 图对水解度的影响牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免 疫活性的研究 不同对牡蛎酶解的蛋白回收率及水解度的影响分别如图.和.所示。 从图.和图.可以看出,随着的升高,蛋白回收率、水解度都逐渐变小, 但.时的酶解液较小于.时的酶解液澄清透明,苦、腥味较轻,考虑到工 业化生产要澄清、脱腥、脱苦,必然导致生产成本的提高和营养成分的损失, 综合 考虑以上因素,最佳.。 ..不同料水比对酶解的影响 ? 勰 乎 尉 ;号 擎 丑 ?正 母型蓬 孔 随 毖 硒以&;?鼹弱弘驼印船 水的倍数 水的倍数 图.料水比对蛋白回收率的影响 图料水比对水解度的影响 不同料水比对牡蛎酶解的蛋白回收率及水解度的影响分别如图.和所示。 从图中可以看出,加入水的体积越大,蛋白回收率、水解度也增大,当加入水的量 超过牡蛎肉倍体积以后,蛋白回收率逐渐下降;当加入水的量超过牡蛎肉倍体 积以后水解度已经不再增加,甚至呈现下降趋势,并且酶解液澄清透明,苦、腥味 较重。综合考虑以上因素,最佳料水比为:。 ..不同加酶量对酶解的影响 不同加酶量对牡蛎酶解的蛋白回收率及水解度的影响分别如图.和.所示。 从图中可以看出,随着加酶量的增加,水解度和蛋白回收率也逐渐上升,但当加酶 量达到/时,水解度和蛋白回收率随着加酶量的增加而上升的趋势变缓,并且 当加酶量大于/时,腥味较重,浑浊不透明。这是因为在一定条件下,酶和底 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 物的反应速度随加酶量的增加而升高,当酶的活性中心和底物接触达到饱和时,继 续加入酶已没有足够的底物相反应,这时蛋白回收率和水解度将不再升高或升高的 趋势非常缓慢【。综合考虑蛋白回收率、水解度和生产成本,最适的加酶量为 /。 /、 冰 琶 僻 捌 赵 国 斐 皿 随 加酶量/ 加酶量/ 图.加酶量对蛋白回收率的影响 图.加酶量对水解度的影响 ?..不同水解时间对酶解的影响 不同水解时间对牡蛎酶解的蛋白回收率及水解度的影响分别如图和.所 示。从图中可以看出,随着酶解时间的增加,水解度和蛋白回收率逐渐增加,当酶 解时间达到,随着酶解时间的增加,蛋白回收率和水解度上升的趋势变缓。在底 物蛋白中包含可溶性蛋白和不溶性蛋白,可溶性蛋白水解时,最初阶段敏感性肽键 快速断裂,不敏感性肽键在后来阶段断裂,】;在不溶性底物蛋白的酶 水解中,酶吸附在不溶性蛋白表面,首先水解疏松地结合在不溶性蛋白上的聚合肽 链,然后再慢慢水解紧密的蛋白质中心的肽键心,。然而随着反应混合 物中可溶性肽的浓度升高,又反过来抑制水解速度和可溶性蛋白的回收。因此开始 时,大量的肽键被水解,水解速度很快,一段时间后酶水解速度降低,并达到一个 平衡状态。可见,蛋白回收率和水解度并不是随着酶解时间延长而无限提高。因此, 从节约时间和节约能源考虑,最佳酶解时间为。 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及其免疫活性的研究 如 筋 出 芭 荽 加 爿 巡 碍 理 百 址 坫 瞄 加时间 时间 图时间对蛋白回收率的影响 图.时间对水解度的影响 . 蛋白酶水解的正交实验结果 表 蛋白酶水解的正交实验结果料水比 加酶量 时间 蛋白回收率 水解度 编号 % % / . :. . . :. . . :. .:. .:. .:. . . :. . . :. . . : . . 蛋白回收率 . . 均值 . . . . . 均值 . . . . 均值 . . . . 极差 . 水解度 . . 均值 . . . . . 均值 . 均值 . . . . . . . 极差 . 牡蛎乳酸菌发酵饮料研制及』免疫活性的研究 从表.可以看出,以蛋白回收率为主要指标,各因素对蛋白回收率影响的主 次顺序为:料水比加酶量时司,最佳条件为。,料水比为:,加酶量 /,时间;以水解度为主要考察指标进行极差分析,各因素对水解度影响 的主次顺序为:时间料水比加酶量,最佳条件为,料水比为:,加酶 量为/,时间为。综合考虑水解度、蛋白回收率、酶制剂的成本及生产效率 等各因素,进行优化实验,选择的最佳水解条件为:,料水比为:, 加酶量/,时间。此条件下水解所获得的酶解液的水解度为.%,蛋白 回收率为.%。