食管鳞癌自发细胞凋亡和核增殖抗原P53关系的研究

食管鳞癌自发细胞凋亡和核增殖抗原P53关系的研究 食管鳞癌自发细胞凋亡和核增殖抗原p53关系的研究 中华肿瘤杂志 1998年第6期第0卷 基础研究 作者:程继东 李淳 沈忠英 单位:515031 广东省汕头大学医学院肿瘤病理教研室 关键词: 食管肿瘤;细胞凋亡;增殖细胞核抗原;p53基因;p53蛋白;癌，鳞状细胞 【摘要】 目的 通过对食管鳞癌组织中凋亡细胞的原位观察和核增殖抗原(PCNA) 的表达状态的研究，探讨不同增殖情况的食管鳞癌组织细胞凋亡情况，同时研究p53基因的 突变和p53蛋白的表达对食管鳞癌组织细胞凋亡的影响。方法 30例术前未经任何治疗的 食管鳞癌手术标本，分别进行凋亡细胞的原位检测(TUNEL)、PCNA、p53蛋白的免疫组化 染色和p53基因5，6，7，8外显子PCR-SSCP检测。结果 不同增殖能力的癌组织中，细 胞凋亡的程度差异有显著性(P,0.05)。p53基因突变组中，增殖程度高与增殖程度低者之间 癌细胞凋亡的程度差异有显著性(P,0.05)。p53基因突变组与非突变组、p53蛋白表达阳性 组与非阳性组癌细胞凋亡的程度差异无显著性(P,0.05)。结论 食管鳞癌组织中，细胞增殖 活跃则自发性凋亡也相应增多。 Correlation study of spontaneous apoptosis, PCNA, and p53 in esophageal squamous-cell carcinomaCheng jidong, Li Chun, Shen Zhongying. Department of Tumor Pathology, Shantou University Medical College, Shantou, Guangdong 515031 【Abstract】 Objective To investigate the inter-relationships among spontaneous apoptosis, proliferative activity and p53 mutation in esophageal squamous-cell carcinoma.Methods In 30 previondy untreated patients with esophageal squamous-cell carcinoma, tissues were examined for apoptosis by in-situ TUNEL, PCNA by immunohistochemistry, p53 mutation by PCR-SSCP and immunohistochemistry. The number of apoptotic cells per 10 low-power microseopic fields was taken as the apoptotic index.Results Apoptotic index of cells with high proliferative activity was significantly higher than that of cells with low proliferative activity (P,0.05). In tumors with p53 gene mutation, apoptotic index of cells with high proliferative activity and low proliferative activity was significantly different (P,0.05). No significant differences were observed in apoptotic index in tumors positive and negative for p53 mutation as examined by PCR-SSCP or immunohistochemistry (P,0.05).Conclusion In squamous-cell carcinoma of the esophagus, cells with high proliferative activity are apt to undergo spontaneous apoptosis. 【Subject words】 Esophageal neoplasms Apoptosis Proliferating cell nuclear antigen p53 genep53 protein Carcinoma, squamous-cell 肿瘤细胞凋亡的研究对肿瘤的发生、发展、治疗及预后的认识均有重大意义，愈 来愈受到肿瘤研究者的重视。食管癌是我国高发性肿瘤之一，食管鳞癌组织中凋亡的研究仅 有少许报道,1,。我们应用原位检测(TUNEL)方法，对30例术前未经任何治疗的食管鳞癌 手术标本的自发性凋亡进行原位研究，目的是在获得食管鳞癌细胞凋亡的病理形态学资料的 同时，观察肿瘤增殖能力及p53基因对它的影响。 材料与方法 1.材料:30例术前未经任何治疗的食管鳞癌手术标本，由汕头大学医学院附属肿瘤医院 1996年手术切除。所有标本均分成两份。一份经福尔马林固定、石蜡包埋连续切片分别做 HE染色、TUNEL、PCNA和p53免疫组化;另一份抽提DNA做p53 5，6，7，8 exon PCR-SSCP 检测。 2.方法:(1)TUNEL:常规脱蜡至水，过氧化氢封闭后，微波处理2分钟。TDT酶、biod UTP 37?孵育1小时。biotin-avitin-HRP 37?孵育1小时。DAB显色、衬染、脱水、封片。 (2)PCNA p53免疫组化:常规ABC法，ABC试剂盒、p53单克隆抗体、PCNA单克隆抗体 购自上海华美公司。一抗浓度p53为1?50，PCNA为1?500。(3)PCR-SSCP:p53引物为中国预防医学科学院李学明教授惠赠。PCR-SSCP的主要步骤如下:酚、氯仿法抽提组织DNA后，常规PCR扩增。SSCP:10 μl扩增产物等量与变性缓冲液混合，96?变性5分钟后冰浴，8%聚丙稀酰胺(49?1)凝胶电泳。银染。 对照:(1)TUNEL:阴性对照，无TDT酶反应液;阳性对照，DNA酶消化后切片，小肠绒毛切片。(2)PCR-SSCP阴性对照:野生型p53质粒DNA。 3.结果判断标准:(1)凋亡指数:每10个低倍镜视野凋亡细胞数。(2)肿瘤组织增殖能力:高:PCNA阳性细胞数,50%;低:PCNA阳性细胞数,50%。(3)PCR-SSCP:电泳双链条带和对照相比出现位移，条带增多和缺失等为阳性。 4.统计分析:t或t′检验。 结果 30例食管鳞癌组织HE切片按国际肿瘤组织分级标准进行分级，其中?级8例，?级13例，?级9例。 30例食管鳞癌细胞凋亡指数为10.07?13.11，93.3%(28/30)可见阳性细胞。阳性信号位于细胞核内，呈棕黄色点状或片状。阳性细胞分布于癌巢各个部位，单个存在，周围无炎症细胞，细胞胞膜、核膜完整，清晰可见，部分阳性细胞核固缩，胞浆呈空泡状，可见凋亡小体被吞噬现象。 PCNA免疫组化结果显示，阳性信号棕黄色，位于核内。有12例增殖能力高，18例增殖能力低。 p53免疫组化及PCR-SSCP结果为p53免疫组化阳性信号位于核内，棕黄色，其阳性率为43.3%(13/30);基因5，6，7，8 PCR-SSCP阳性率分别为26.7%、33.3%、23.3%和36.7%，总阳性率为66.7%(20/30)。 统计结果:(1)高增殖能力组细胞凋亡指数为19?16.87，低增殖能力组细胞凋亡指数为4.11?3.89，两者相比，差异有显著性(P,0.05)。(2)p53突变组中，高增殖能力者细胞凋亡指数为20.6?18.13，低增殖能力者细胞凋亡指数为4.72?4.45，两者相比，差异有显著性(P,0.05)。(3)p53免疫组化阳性组细胞凋亡指数为10.29?11.91，阴性组细胞凋亡指数为9.41?14.28，两者比较，差异无显著性(P,0.05)。(4)p53突变组细胞凋亡指数为12.29?14.96，p53非突变组细胞凋亡指数为4.889?4.51，两者比较，差异无显著性(P,0.05)。 讨论 凋亡是细胞的自杀行为，是细胞受内外因素诱导启动细胞内的凋亡机制的结果。当细胞凋亡发生时，可产生一系列具有特征性的变化，包括细胞固缩、核固缩、凋亡小体产生等细胞形态方面的变化和细胞内核酸内切酶激活而产生DNA片段化等生化方面的变化。TUNEL方法由于能够在原位显示片段化的DNA，具有可以结合细胞的镜下形态来研究凋亡的优点,2,，从而被广泛应用。我们选择30例术前未经任何治疗的食管鳞癌标本，进行TUNEL研究，排除了化疗、放疗等治疗手段诱发凋亡的因素。研究结果发现，93.3%(28/30)的食管鳞癌标本可见程度不等的凋亡细胞核阳性，阳性细胞的病理形态也符合文献报道的凋亡细胞的形态。说明在食管癌组织中存在着自发性凋亡的机制，这种机制的意义及与食管鳞癌的发生、发展和预后的关系值得进一步研究。 PCNA是增殖期细胞特异表达的核蛋白，它的表达程度是反映食管鳞癌组织增殖能力的良好指标。我们的研究发现，高增殖能力的癌组织中，凋亡指数显著低于低增殖能力的癌组织。在各种肿瘤中，不同增殖能力肿瘤组织中凋亡的研究有不同的结果，King等,3,对45例膀胱癌的研究表明，癌组织中的细胞凋亡指数高于正常膀胱上皮，?级癌组织中平均凋亡指数低于?级癌组织。孙保存等,4,用PCNA和TUNEL研究了大肠癌及其癌前病变中凋亡和增殖的关系，发现随着增殖细胞增多，凋亡细胞密度递减，并认为这是由于肿瘤组织发 生过程中细胞凋亡调控失常，即正常组织中细胞增殖和凋亡存在着一种平衡被打破，细胞增 殖超过细胞凋亡，从而异常增生产生肿瘤。我们认为，食管鳞癌组织中增殖能力增强，凋亡 细胞数随之增多的原因有以下几种可能性:(1)营养因素:随着细胞增殖能力增强，肿瘤组 织增殖过程中需要的营养也随之增多。伴随肿瘤血管的供应不足，部分细胞可因缺氧等因素 产生凋亡。(2)增殖期细胞较静止期细胞在遗传等方面的稳定性差，易受内外因素的影响。(3) 肿瘤是一种异常增生的组织，作为一种非常规的增生方式，常常引起细胞核分裂不完全、多 倍体、异倍体等“粗制滥造”现象。是否肿瘤组织也象正常组织一样，存在着一种“优胜劣 汰”的机制，即通过凋亡来清除某些“劣质”细胞，尚需进一步研究。 p53基因突变和蛋白表达是食管鳞癌中的一种常见现象。黎妙娟等,5,报道55例潮汕 食管癌标本中，CM1-1、DO-7抗体的免疫组化阳性率分别为50.9%和69.1%。李华川、陆 士新,6,报道运用PCR序列分析法，发现50%食管癌p53 5,9外显子突变。我们用免疫 组化法和PCR-SSCP法分别检测p53蛋白的表达和p53基因突变情况，免疫组化阳性率为 43.3%，PCR-SSCP阳性率为66.7%，与文献报道的基本一致。p53作为细胞凋亡的重要调控 基因已有广泛研究，Liu等,7,的研究发现，野生型p53可诱导鳞状上皮肿瘤细胞株Tu-138 发生凋亡，认为p53可通过突变失去对细胞凋亡正常调控，而使细胞凋亡减少或不凋亡，从 而永生化为癌。Clarke等,8,认为，细胞凋亡和p53的关系有两种形式，一种形式为p53 依赖性，另一种形式为非p53依赖性，即p53仅仅在某一些细胞凋亡中起作用。本实验中 p53蛋白表达阳性组与阴性组、突变组与非突变组凋亡指数差异无显著性，一种可能是由于 在肿瘤组织中，影响凋亡的因素较多，而本研究的病例数尚少;另一种可能性是食管癌细胞 凋亡是非p53依赖的。目前，我们尚难以充分说明这个问题，需进一步研究。 参考文献 1 Ohbu M, Saegusa M, Okayasu I, et al. 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