鸡胚胎生殖细胞在鼠胚成纤维细胞饲养层上的生长_cropped

鸡胚胎生殖细胞在鼠胚成纤维细胞饲养层上的生长_cropped !"!#$ 王娟 ，孔祥华 ，杜立新 21 滨州医学院 !" 生物技术教研室;B1 附属医院中心实验室;山东 滨州 8?CC9A; 中国农业科学院 畜牧研究所国家畜禽分子遗传育种中心，北京 81 2999@ ; ,摘要, 目的:探讨以鼠胚成纤维细胞为饲养层分离、培养鸡胚胎生殖细胞的方法和条件。方法:分离、培养 281?D2A1? E 鼠 胚成纤维细胞。分离孵化 鸡胚原始生殖细胞，原代培养时不使用饲养层，与性腺基质细胞共培养;继代培养时将其置 ?1? E 于鼠胚成纤维细胞饲养层上，在含生长因子、分化抑制因子的培养体系中培养胚胎生殖细胞。结果:鼠胚成纤维细胞可连续 传代 代以上(个月)，代细胞可以用作饲养层细胞。分离的鸡胚胎生殖细胞在饲养层上可增殖形成典型胚胎生殖 23 @ AD2? 细胞集落，并能连续在体外培养超过 代。集落未分化标志高碘酸希夫反应()呈强阳性，体外分化实验明胚胎生殖细 FG%; 胞具有多能性。结论:用鼠胚成纤维细胞作为饲养层能获得可连续增殖的胚胎生殖细胞。 ,关键词, 胚胎生殖细胞;鼠胚成纤维细胞;细胞培养;鸡 ,中图分类号, H8? ,文献标识码, G !"#$%& #’ (&)*+,- ./0"1#-)* !,"/ (,223 #- 4)*, ./0"1#-)* 5)0"#0263%3 252B8! " #$ %&’() *+#$ ,-’(./0&’) 12 3-/4-( 21 51 IJK5LMNJ6M /O (P/MJQR6/0/STU B1 *J6ML50 !5B/L5M/LT7 GOOP0P5MJE +/VKPM50U (P6WR/X YJEPQ50 */00JSJ7 (P6WR/X 8?CC9AU 81 ’5MP/650 *J6MJL O/L Y/0JQX05L 56E ( LJJEP6S /O G6PN507 &6VMPMXMJ /O G6PN507 *RP6JVJ GQ5EJNT /O GSLPQX0MXL50 %QPJ6QJV7 JPZP6S 2999@U *RP65 (; ,703%"6*%, 809,*%):,; #/ P6[JVMPS5MJ MRJ PV/05MP/67 KXLPOPQ5MP/6 56E Q X0MXLJ NJMR/EV /O QRPQ\J6 JNBLT/6PQ SJLN QJ00V =",*V> /6 OJJEJL 05TJL QJ00V /O NPQJ JNBLT/6PQ OPBL/B05VMV=Y"]V> 1 4,%&#<3; YPQJ JNBLT/6PQ OPBL/B05VMV OL/N MRJ NPQJ JN^ BLT/V /O 281?D2A1? E5TV _JLJ QX0MXLJE O/L /[JL 23 K5VV5SJV=@ N/6MRV> 1 XNJL/XV KLPN/LEP50 SJLN QJ00V Q/0/6PJV _JLJ EJ^ ’ LPJE OLN S65E50 LPESJV O ?1? _JLJ [////\/\/,*Q/2%3; #RJ QX0MXLJV R5E V /NJ QR5L5QMJLPVMPQ V /O JNBLT/6PQ SJLN QJ00V7 VXQR 5V MRJ 5BP0PMT M/ BJ Q /6MP6X/XV0T K5VVJE=K5VV5SJ 2?> 56E MRJ NLKR0ST O KJLPEPQ 5QPE <%RPO OLJ5QMP6 =FG%> KVPMPJ1 #RJ QX0MXLJV _X0E EPOOJLJ6MP5MJE P6M VJJL50 P6EV O QJ00V X6EJL ///////[//[\/MRJ Q/6EPMP/6 /O EJ[/PE /O !&] 56E O JJEJL 05TJL QJ00V7 VXQR 5V OPBL/ B05VM QJ00V7 6JXL/QTMJV7 5XM/LRTMRNPQ QJ00V7 JMQ1 ‘RJ6 QX0MXLJE P6 VXVKJ6MP/67 MRJT VXQQJVVOX00T O/LNJE JNBLT/PE B/EPJV1 G0 0 /O _RPQR P6EPQ5MJ MR5M MRJ QJ00V /BM5P6JE _JLJ ",*V1 (#-*2>3)#-; */6MP6X/XV0T KL/0POJL5MP6S ",*V Q56 BJ / BM5P6JE /6 OJJEJL 05TJL QJ00V /O Y"]V1 ,?,1 $#"<3, JNBLT/6PQ SJLN QJ00VU NPQJ JNBLT/6PQ OPBL/B05VMVU QJ0 0 QX0MXLJU QRPQJ6 \ 和抗病性能，并为开发输卵管生物反应器提供高效的技术手段。鸡胚胎生殖细胞(JNBLT6PQ SJLN QJ0，0V)是鸡胚胎生殖 /",* 嵴原始生殖细胞经体外分化抑制培养得到的一种具有发育全能 a2b性或多能性的干细胞。年，等从孵化 的鸡胚生 8999 F5L ?1? E \

材料

关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料

和方法2 殖嵴中分离培养原始生殖细胞(，)，在 KLPN/LEP50 SJLN QJ00VF,*V 体外培养 个月，建立了鸡的类胚胎生殖细胞系，并分别用传至 A a8b第 代和第 代的 获得了 只嵌合体鸡。接着，等又 A @ F,*V A F5L\212 材料 将 与生殖嵴基质细胞共培养，在不更换饲养层和不传代的 F,*V 种蛋的类型为山东寿光黑鸡，由聊城市嘉明种鸡场惠赠，孵 情况下，可维持不分化状态达 个月之久。国内学者也对 F,*V 8 化温度为 ，湿度为 。孵化期按 等

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划分。A:13cC9d+5NBXLSJL aAb鸡的 进行了培养，但尚无胚胎生殖细胞系建立的报道。本 FV ,* IYIY 培养基和胰蛋白酶购自 ,PBQ/ ($! 公司;胎牛血清a@，?b研究的目的是在本实验室原有工作基础上，以 鸡 胚 生 殖 腺 为 购自杭州四季青公司;无机盐和二甲基亚砜()购自 %%PSN5 Y)I材料，探讨影 响 鸡 分 离 克 隆 的 相 关 因 素 ，完 善 鸡 的 FV V ,*",* 分离克隆程序，并最终获得 系 ;继 而 通 过 对 系 的 定 ",*V ",*V 向改造与选择，实现对鸡基因组的特定遗传修饰，提高鸡的生产 ,收稿日期,899C<9@<9? ,基金项目,北京市自然科学基金项目() ?9?299@,作者简介,王娟()，女，硕士 232< ;,通讯作者,杜立新，() "!"" / 0 53IW !();, 鸡 传代后的生长行为青霉素和 链霉素，并用孔径为 的微孔滤膜 +6@ 5829 !"" !4 / ,0 "6+ !, 离散成小团块的鸡 在很短的时间内()就会聚集 *829 +R P过滤除菌。 增殖成集落，但此时集落并不典型;培养至 ，则会有鸟巢状 RV P 结构的集落出现;待集落较多较大、周边开始分化时，及时传代。 高碘酸希夫反应+6R 小鼠胚胎成纤维细胞的分离、培养及铺板!6+ 第 代鸡 克隆被染成紫红色，而 饲养层不着色U 829 $9 *)*BCD 无菌条件下取孵化 的鼠胚 ，按 薛 庆 善的 方 法 +67?@67 A !!(图 )。@ ，)，常 EFG GHIJ-=EF KEHI-H.39L9*$9,,)分离获取小鼠成纤维细胞(体外分化实验BND +67 规培养传代，大量冻存 代细胞。采用 的方法，取?C M-HGIL9-= ! 代细胞进行饲养层细胞的铺板，法筛选丝裂霉素 抑 @?!7 )OO 2 制细胞增殖的浓度和时间。选择终浓度为 的丝裂霉 +67 4 / 0 !,7 素 处 理 胚 胎 成 纤 维 细 胞 ， 以 每 孔 细 胞 种 植 在 用 2 @ P + Q!" 明胶处理后的 孔培养板上，后可以用作饲养层。"6#R C P ! 自发分化+676! 鸡原代 的分离和培养!6@ 5829 将生长状态良好的鸡 集落置于无饲养层、无 因子 829 0<$ *在无菌条件下于显微解剖镜下取孵化 的胚胎生殖嵴 767 A 即可出现分化现象，分化的 形态 ?+ A *829 !的培养液中培养，并切成小组织块，用 的胰蛋白酶在 消化 ，加入 6+7@NS7 E="#!,发生明显变化，细胞克隆边界消失且体积增大。实验中我们观察 离心 ，弃上清 +"" I / E= 7 E=,,等体积含血清培养基终止消化，到培养至第 、代的 可以自发分化成纤维样的细胞、神经 CN *829 培养液重悬细胞沉淀，接种于 孔培养板中(细胞密度 *829 R 液，细胞及心脏跳动样细胞(图 、图 、图 )。R7C 为 枚 生 殖 腺 )，置 于 培 养 箱 中 培 养 (，，饱 R / 02>@NS 7# 2>,+ +后换液一半。+R P 和湿度)， 悬浮培养+676+ 鸡 的传代培养!6R *829 鸡 克隆悬浮培养 后，发现有类胚体状物出现*829 +?R A 原代 在种植 后形成鸟巢状集落，用毛细玻璃管 *829 7?N A (图 );继续培养 后出现囊胚结构(图 )。N7?!" A V 挑取典型的鸟巢状集落，用 的胰蛋白酶分散成单细胞悬 "6+7# 传代。R?7 A 液，接种饲养层细胞上，每天更换培养液，平均每 高碘酸希夫反应()67 5T& ! 取生长状态良好的第 代 克隆种植在放有经明胶预 U *829 @ 讨论 处理的无菌盖玻片的培养皿中，培养 ;取已生长有 集 +R P*829 玻 片 浸 入 戊 二 醛 中 固 定 ; 取 出 玻 片 用 冲 #7 E=5%& !,落的盖@6 饲养层对鸡 *829 的影响 !洗，再浸入高碘酸中浸 ;取出玻片用 冲洗，然后浸入希 7 ,E=5%& 鸡 的体外培养必须依赖于饲养层细胞，目前在胚胎干 *829 夫试剂中浸泡 ;取出玻片用 冲洗，自然晾干后，用中 7 E=5%& !,细胞的培养及建系过程中通常采用 细胞系或小鼠胚胎成纤 &O> 性树胶封片，在光学显微镜下观察，照相。附着贴壁 829 *维细胞等作为饲养层。饲养层细胞一方面可促进 体外分化实验6C !生长;另一方面可分泌各种生长因子抑制其分化，促进其体外存 自发分化 去除 培养液中的 因子，不更换饲养 6C6 829 0<$ !!*活增殖。本研究发现 饲养层对于鸡 的继代培养支持 *$9 *829 )层，长时间不进行传代，观察鸡 克隆自发分化的形态。*829 效果最好，这可能与 的分泌特性有关，主要产生固定 *$9 *$9 ))悬浮培养 为了鉴定所培养的鸡 是否可形成类胚 !6C6+ *829 、细胞虽然具有与 &O>&X0 $9 )*在细胞表面的分化抑制因子。 ， 将 生 长 良 好 的 克 隆 挑 出 后 置 于 无 饲 养 层 、无829 $9 *)*体相同的分泌特性，但随着反复的冻存、复苏及传代次数的增加其 的 培养体系中悬浮培养，培养液每隔 更换 次。 ,0<$ *829 ! A ! 分泌能力会下降，也易老化。考虑到在鸡 培养中要避免鼠 *829 每天镜检，观察 克隆形成类胚体的情况。829 *FPEFWG= GHIJ=EF KEY -,源性物质的混杂，探讨了鸡胚成纤维细胞( ，)用 于 培 养 的 可 行 性 ，但 的 分 泌 机 理 HI-H.39L92*$9*829 2*$9 及分泌量存在很多未知因素，在小鼠等动物的胚胎干细胞中特 表 达 的 基 因 以 及 对 于 的 存 活 增 殖 至 关 重 要 的!"#$ % & 5829 异 BVD基因在鸡的基因组中并不存在。本研究还发现，鸡 原 ’() 5829 代培养时不宜使用饲养层，适于与性腺基质细胞共培养，这可能BUD与 自身以及培养系统提供了一个良好的增殖环境有关。5829 细胞因子对鸡 的影响@6+ *829 在胚胎干细胞分离克隆过程中，细胞因子一方面有促进增 年开始已 !UU+ 殖的作用，另一方面也发挥抑制分化的功能。从 + 结果 陆续发现了一些维持 体外存活、增殖及保持全能性和抑制 529 8 分化的必需生长因子， 其 中 是 目 前 最 常 用 的 分 化 抑 制 剂 ，0<$ +6 $9 的体外生长与传代 !)* &2$ 和 $8$ 是比较常用的生长促进剂，另外一种生长因子 <$8原代培养的 在种植后即快速增殖，时细胞铺满培 )*$9 @ A 养瓶底，细胞排列成放射状或栅栏状，其间有少量上皮细胞 ，平 均 传代。原代细胞经传代后上皮样细胞逐渐减少，到第 +?@ A @? 7 代时已基本消失(图 !)。本研究所培养的 )*$9 在体外已连续 图 2:鼠胚成纤维细胞单层(dC9);图 8:与生殖腺基质细胞共培养的原代鸡 ",*< 克隆(d899);图 @:;F% 染色后的鸡 ",*<(d299); 图 ?:鸡 *< 自发分化为成纤维细胞(d299);图 C:鸡 *< 自发分化为神经细胞(d299);图 D:鸡 *< 自发分化为自律细胞(d299); ",",",图 ::鸡 ",*< 克隆悬浮培养时形成类胚体样结构(d299);图 3:鸡 ",*< 悬浮培养时形成囊胚体样结构(d299) =29>也有促进 ;,*< 增殖的作用。本研究采取 ? 种细胞因子联合 NJ00< S5K6M5K6JE &’ (&")* P/G 56 JYMJ6EJE QJGK/E =4> 1! 作用的方式，得到了良好的分离克隆效果。 #AJGK/VJ6/0/VU7 89987C3X2C@2 鸡胚日龄对鸡 的影响@1@ "*< , 影响鸡原始生殖细胞分离克隆因素的研究王娟7 杜立新1 =@> 一般认为分离 只在胚胎的某一阶段进行。本研究根据 ;,*< =4> 1 实验生物学报7 899?7@:(@)X8?: 鸡 的发生、迁移及性腺形成规律，确定分离获取 的胚 ;,*< ;,*< 杜立新尹春光鸡 期胚盘细胞体外培养动物学报7 1 Z =4> 1 7 =?> 龄和部位。鸡 起源于胚盘明区，在迁移过程中出现 次聚 ;,*< @ ()89987?3?XC?[ 集高峰，第 次于孵化 时聚集在生殖新月区，第 次 于 孵 2 88 A 8 IR !Z7 F6 41 #AJ K 6LJ 时开始大量聚集在生殖腺中。鸡胚孵化 时生殖腺开始分化，D E S5K6M5K6JE NAKNHJ6 JSTGU/6KN NJ00< 5< M/MKQ/MJ6M NJ00< =4> 1参与了性腺的形成，孵化 时 逐渐转变为卵原或 < E < ;,*: ;,*F 1 X 7 的 ，经形态学鉴定、染色、体外分化实验等证明其具有 89921??D 的诸多特性。< ",*$/TJGM 1 #JG5M/_ \=> :N5GNK6S5 56E STGU6KN %MJS J00F G5NMKN50 FQQG5NA /"/*\;/ =W> 1 ‘5 参考文献MAJ NAKNHJ6 VJ6SJ=4> 1 W0 JQGE JL7 89927C3X2@ //$/:I 李松7 窦忠英7 华进联1 从原始生殖细胞分离克隆牛胚胎干 =[> =2> ;5GH #%7 +56 4-7 !" #$% IJGKL5MK/6 56E N A5G5NMJGKO5MK/6 /P 细胞的规律农业生物技术学报()=4> 1 7 899973?X@?[ Q0RGKQ/MJ6M JSTGU/6KN VJGS NJ00< K6 NAKNHJ6=4> 1 W/0 $JQG/E =29> A56V &7 #5c KS5 F7 AKH5SR6J #1 G0KPJG5MK6 P NAKNHJ6 **;///JL7 89997CDX?C I: QGKS/GEK50 VJGS NJ00< NR0MRGJE /6 +56 4-7 ;5GH #%7 +/6V -+7 !" #$1 ;G/ERNMK/6 /P VJGS0K6J VJGSK650 GKEVJ=4> 1 J0 0 K0 &6M7 2C57X2?@ *(/[[[NAKSJG5< TU MG 56