力学刺激促进软骨细胞与骨髓基质干细胞共培养体外软骨分化

力学刺激促进软骨细胞与骨髓基质干细胞共培养体外软骨分化 ?论著? 力学刺激促进软骨细胞与骨髓基质干细胞共培养体外软骨分化 12 田 甜 ,章庆国 (1.东南大学附属中大医院整形外科 江苏 南京 210009,2.中国医学科学院整形外科医院北京 100144) [摘要]目的,研究不同的应力刺激对软骨细胞与骨髓基质干细胞(BMSCs)共培养体外构建组织工程化软。方法,分离骨的影响、 7培养、扩传兔 MSCs及软骨细胞 ,二者按 73 比例混和,以 5.0×10/m 的细胞密度接种于聚羟基乙酸PGA,l()支架上? 一周后根 据不同的施加力分为 4 组,离心组、摇床组、搅拌组,静止培养作为对照组。6 周后取材行相关检测。结果,三受力组形成的细胞 复合物基本保持原来的体积与外形。HE 染色结果显示大量成熟软骨陷窝形成,细胞外基质沉积均匀Safranin,-O 及甲苯 胺兰染色显示有大量的 GAG形成 ,免疫组化检测?型胶原达强阳性。三受力组标本组织湿重、体积、GAG 含量等指标均优于对 照组。结论,力学刺激有利于促进少量软骨细胞与BMSCs 共培养体外软骨分化 ,并在三维支架材料上构建组织工程化软骨。 [关键词]软骨细胞,骨髓基质干细胞,共培养,力学,组织工程 [中图分类号]R318 [文献标识码]A [文章编号]1008-645,5200,905-0658-05 Mechanical Stimulation to Promote in Vitro Chondrogenesis by Co-culture of Bone Marrow Stromal Cells and Chondrocytes 12TIAN Tian,ZHANG Qing-guo (1. Department of Plastic Surgery, Affiliated Zhong da Hospital, Southeast University, Nanjing 210009 Jiangsu,; 2. Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100144,China) Abstract: Objective To evaluate the influence of different mechanical stresses on in vitro cultured chondrogenesis by co-culture of bone marrow stromal cells (BMSC) and chondrocytes. Methods Rabbit MSCs and chondrocytes were in vitro isolated, cultured and expanded respectively, then mixed up with the ratio of 7:3 (MSCs: chondrocytes). The mixed 7cells were seeded onto PGA (polyglycolic acid) scaffold at the ultimate concentration of 5.0×10/ml. One week later, the cell -scaffold constructs were randomly divided into four groups according to the different imposed stresses: experimental group A in which a centrifugal stress was imposed. Experimental group B with rotative stress; experimental group C with fluid shear stress, and the control group in which the constructs were statically cultured. All specimens were collected for relative detections after 6 weeks. Results The constructs in three experimental groups were basically maintained in their original sizes and shapes with optimal elasticity. Massive lacuna -like structures in most areas of the construct and extra cellular matrix were evenly deposited on HE stain. Safranin -O and toluidine blue staining showed massive GAG formation. IHC (immunohistochemistry) staining of collagen type II was observed with strong positive result. In three experiment groups, weights of wet tissue, sizes and GAG contents were higher respectively than the control group. Conclusions Mechanical stimulation promotes in vitro chondrogenesis by co -culture of BMSCs and a small amount of chondrocytes, and constructs tissue engineered cartilages on 3-dimensional scaffolds. Key words: chondrocytes; bone marrow stromal cells; co-culture; mechanical stress; tissue engineering 众所周知，软骨组织是运动系统的重要组成部分，而运力及流体剪切力对软骨细胞与 BMSCs 共培养体外软骨分化 的影响，目的是要明确力学刺激是否有助于软骨细胞与 动系统在人体日常生理活动中不断有力的产生传导过程，不 BMSCs 共培养构建组织工程化软骨，进而为探讨合适的体外 同生物力学环境直接影响软骨细胞的生长代谢。在体外细胞 软骨构建方式提供相应的实验参考。 或组织培养过程中施加力学刺激同样可以影响软骨细胞代 谢和功能，力学刺激在组织工程化软骨的构建过程中起到了 [1] 1 材料和方法重要的作用。研究证实，利用少量软骨细胞通过共培养方法 1.1 实验动物:新生新西兰兔 2只，雌雄不限(中国医科院整 诱导骨髓基质干细 胞 (bone marrow stromal cells, BMSCs)在体外可以形成软骨组织。本实验研究离心力、旋转 形外科医院动物实验室提供)。 通讯作者:章庆国，主任医师，教授，硕士研究生导师，研究方向:整形外科，中国医学科学院整形外科医院，北京，100144 多克隆抗体(武汉博士德生物公司);DAB显色 剂(北京中杉金置相差显微镜下连续观察细胞在支架材料上的黏附及细胞桥生物公司);聚羟基乙酸(polyglycolic acid, PGA;上海 外基质的分泌情况;?标本大体观察:重点观察组织大小、色 组织工程研究中心);倒置显微镜( IX71, Olympus);倒置荧 泽、弹性及形状等。在电子天平上测量组织湿重，应用排水法 光 显 微 镜 (TE2000-S, Nikon);台式离心机(1.0R, 测量体积大小;?组织学检测:将标本固定于4% 多聚甲醛，经 Heraeus);CO培养箱(MCO-15AC, Sanyo);细胞计数仪(Z2, 2 脱水、石蜡包埋，切成5 μm 厚切片，常规苏木素 - 伊红(HE)染 Beckman);恒温摇床箱(上海智城分析仪器制造有限公司); 色，观察培养物的组织结构，包括组织的连续性、软骨陷窝形 磁力搅拌器(北京医用离心机厂)。 1.3 兔 BMSCs 的分离培养:将出生 5:7 天的新西兰兔处死，成情况和生物材料降解情况;?组织化学检测:应用 无菌操作下取其四肢的长骨，用注射器抽取长骨内骨髓，加Safranin-O、甲苯胺蓝(美国 Sigma 公司)染色，观察软骨特 含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基吹打制成单细胞悬液，分装于 异性细胞外基质中聚合蛋 白 多 糖 (glycosaminoglycan, 2 2 个 25cm培养瓶中，取少量细胞计数。在37 ?、5%CO及饱和 2 GAG)的合成及分泌情况;?免疫组化检测:一抗为小鼠抗人 湿度条件下静止培养 5 天。第 6 天首次细胞换液，以后每 ?型胶原单克隆抗体;二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗 2:3 天换液 1 次。待第 10:14 天贴壁细胞长满瓶底部后用 小鼠多克隆抗体，行标本的免疫组织化学染色，采用 3,3'- 0.25%胰蛋白酶和 0.01% EDTA 的混合溶液消化并传代培养二氨基联苯胺(DAB)显色，棕黄色染色为阳性。兔自体皮肤为 细胞。 阴性对照，兔自体关节软骨为阳性对照，染色过程中 PBS 代 1.4 兔软骨细胞的分离与培养:将出生 5: 天的新西兰兔处7 替一抗为空白对照;镜下观察各组标本?型胶原的表达情 死，在无菌操作下从其四肢的关节中取软骨，将软骨切成1: 况;?阿利新兰比色法检测蛋白聚糖(GAG)含量:称取10mg 3 3mm大小置无菌试管，PBS 冲洗 3 次，1000r/min 离心 3 min，软骨组织标本，用组织匀浆机以15 000r/min×1min 打成匀 吸去 PBS，加 0.25%胰酶 4ml，置 5%CO培养箱 30 min，吸出胰 2 浆，加入 1/10 标本重量的木瓜蛋白酶(美国 Sigma 公司)酶 酶后再加入 0.2% II 型胶原酶 5 ml，置恒温摇床箱内消化 解;显色:空白管为 0.5mol/L 乙酸钠溶液1ml ，管为含 6:8h。观察大部分软骨块被消化后，收集消化液，800r/min 0.5mol/L 乙酸钠溶液的 5mg/100ml 硫酸软骨素 A (美国 2 离心 5min，用培养液洗 2 次。细胞计数后移入 25cm培养瓶 Sigma 公司)1ml，样品管为各标本的酶解液1ml ，以上各管均 4中，使细胞密度为2 ×10/L，加 DMEM 培养液(含 10%胎牛血 加入新鲜配制的阿利新兰 8-GX 染液(美国 Sigma 公司)各 2 ml，清，100U/ml 青 - 链霉素)，置 37?、5%CO培养箱中培养，每2 2 混匀，室温下放置 10min;比色:将紫外分光光度计选用 480nm 波长，空白管上样调零后，依次比色测定标准管和样品 天换液 1 次。原代细胞贴壁并融合成单层后传代培养。 管，取 4 次测定数值的平均值分别设为 A 标和 A 样，按 A 样 1.5 聚羟基乙酸(PGA)支架的处理:取非编织的线性PGA5mg ， /A 标比值求出样本中的蛋白多糖含量;?统计学分析:所有 均匀放入预制的圆柱状 (内径 5mm、高 1mm) 模具中，加入 数据应用 SPSS11.5 软件包进行统计学分析P，<0.05 为差异 100μl 乙醇，压制成直径 5mm，厚度 1mm 的圆柱体(PGA直 径 有统计学意义。 13:15μm，制作后所得支架孔隙率约90 %)。充分晾干后放入 培养皿中，75%乙醇浸泡 1h，紫外线照射 30min。PBS 洗涤 3 次，每次 10min，吸干后备用。 2 结果 1.6 细胞与 PGA 支架的复合:将 BMSCs 与软骨细胞按 73 ?2.1 细胞形态观察:?原代 BMSCs 呈纺锤形或梭形，呈集落 7比 例混匀，调整细胞密度为 5.0×10/ml。将混合细胞接种于样生长，接种后 8:10 天可达 80%以上的融合，此时细胞相互 经 培养液预湿的塑形 PGA 上，以细胞悬液刚好不溢出材料间紧密贴附，单个细胞呈狭长梭形，从整体看大多数细胞沿 为 宜。在 37?、5%CO及饱和湿度培养箱中孵育 4h，然后在复2 胞体长轴呈有序排列。传代培养后细胞不再以集落方式生 合 物周围滴加含 10%胎牛血清 DMEM 培养液 5ml，以后每 48h 长，而是以均匀分布的纺锤形细胞形态平均生长(图 1A);? 换 液 1 次，培养 1 周。倒置显微镜下观察细胞生长及附着情原代软骨细胞一般 12:24h 贴壁，48h 后开始增殖。细胞刚贴 况。 壁时仍为圆形，伸展后呈多角形，多以类似于同源细胞群的 1.7 实验分组:实验随机均分为 4组，每组各 4 个细胞材料复 生长方式形成小群体，中央密集处可形成软骨样结节;天5 左 合物。分别为离心组、摇床组、搅拌组和静止组。离心组复合 右即可达到 90%以上的融合 (图 1B);?细胞材料的黏附情 物于离心管内培养，每天施加离心力2 次(100g,1 000r/min)，每 况:接种到支架上 4h 后，细胞与 PGA 纤维紧密粘附，3 天后支 次 30min;摇床组复合物在 6 孔板内培养，每天于摇床上 架局部有细胞分泌细胞外基质包埋纤维，1 周后细胞外基质 (80r/min)旋转作用 2 次，每次 30min;搅拌组复合物于离心 逐渐增多填满纤维间的空隙，支架完全被包埋(图1C) 。 管内培养，每天于磁力搅拌器上搅拌作用2 次，每次 30min; 2.2 大体观察:离心组、摇床组及搅拌组体外培养 周时6细 胞材料复合物形成了软骨样组织，体积无收缩，表面光滑，有少量软骨细胞的诱导作用下，BMSCs可以用来替代大 部分软细腻光泽，呈浅灰白色，有一定的弹性。静止培养组标本体积 骨细胞而构建出成熟的软骨组织，这大大节省了软骨构建过 收缩，弹性明显较前三组差(图2) 。离心组、摇床组及搅拌组 程中软骨细胞的用量，避免了为获取足够量的软骨细胞反复 [5]之间组织湿重和体积差异无统计学意义(表 1)。 传代培养而引起的软骨细胞老化和去分化，且不必应用任 2.3 组织学及组织化学检测:离心组、摇床组及搅拌组体外 何生长因子。因此，BMSCs和软骨细胞共培养对优化和扩大软 培养 6 周时可见有明显的软骨陷窝样结构，内有细胞核，核 骨组织工程的种子细胞源可能是一种实用的策略。 仁明显，陷窝结构呈巢状或片状，周围有蓝染的胞外基质沉 适当的力学环境作为一个必要的生理性刺激因素可以 积。静止组陷窝样结构少，残留 PGA 及纤维样组织交织排列 在一定程度上克服传统软骨细胞培养条件的不足，满足细胞 (图 3)。Safranin-O 染色显示三受力组细胞外有大量 GAG 沉 在可吸收聚合物中的营养需要，减少处于中心部位的软骨细 积，甲苯胺蓝染色表明有大量均匀分布的软骨特异性基质成 胞由于营养不良或代谢不畅而导致的生长迟滞甚至死亡。大 分，而对照组标本只有部分区域染色且淡于实验组(图4、 5)。 量的研究证实，力学刺激可以直接或间接影响软骨细胞的增 2.4 免疫组织化学检测:?型胶原免疫组化的结果显示，在 殖及分泌功能，间歇性压力、适当的剪切力及体外模拟的微 三受力组细胞能够合成大量软骨细胞特异性胶原成分?型 重力均能够明显刺激软骨细胞增殖、?型胶原合成及 GAG 合 [6]成和释放。但体外软骨细胞诱导 BMSCs 构建组织工程化软 胶原，并且分布相对均匀。而对照组阳性染色区域少且分布 骨中，力学刺激对具体影响诱导作用的效果，尚无明确论述。不均(图 6)。 本实验在利用软骨细胞诱导因素的同时施加间歇性力学刺2.5 蛋白聚糖含量检测:离心组、摇床组和搅拌组复合物的 激，目的是观察在力学的作用下，是否更有利于 BMSCs 向软 GAG 含 量 分 别 为 5.7 ?0.2mg/g、5.2 ?0.3mg/g 和 5.4 骨细胞表型分化，并最终形成均一、成熟的软骨组织。离心 ? 组、摇床组是根据关节软骨在生理状态下受到重力、剪切力 0.4mg/g，约为正常含量的80 %，三受力组间蛋白聚糖含量差 的作用，则在体外分别用离心压力及旋转力对上述两种应力 异无显著意义，但均明显高于静止组(4.4?0.3mg/g)(表1) 。 表 1 体外培养 6 周定量指标检测[7] 进行体外模拟。其中离心力改变了软骨细胞在支架材料上 3[8] 体积(mm)GAG 含量(mg/g)组别组织湿重(mg) 的空间排列，最终形成的类软骨组织具有一定层次排列结构。 离心组80.0?1.980.4?1.95.7?0.2 而搅拌组是模拟机械搅拌式生物反应器，将支架 细胞复合-摇床组 75.54.5?78.7?3.05.2?0.3 物悬在培养瓶的瓶塞上，支架周围加入培养液，位于培养瓶 搅拌组 76.94.4?79.5?2.45.4?0.4 [9]底部的磁棒不断搅拌，每隔数日更换培养液以保持营养。这 静止组 65.2?2.266.3?0.94.4?0.3 样的培养体系能使 CO和 O的浓度达到一个类似正常的平 2 2 衡状态，避免静态培养中O 的降低和 CO的聚集。实验结果 2 2 3 讨论显示力学刺激在三个实验组均能明显促进诱导作用，形成特 在软骨组织工程研究中,软骨细胞作为种子细胞存在来 异性的软骨陷窝样结构，并能表达软骨特异性基质成分 蛋- 源不足、供区损伤和体外培养时去分化和老化等问题。有研 白多糖和?型胶原，证实了体外诱导构建过程中施加合适的 [2-4]表明，BMSCs 与生物材料复合后置入动物关节腔内可形 究外力可与少量软骨细胞产生某种作用或联系，最终促进 成软骨组织，而将 BMSCs 注入到动物皮下则形成纤维组织。 BMSCs 的体外软骨形成。但三受力组结果的差异并无显著意 这提示软骨微环境对 BMSCs 向软骨分化及形成软骨组织具 义，这可能是因为三种外力均可刺激诱导发生，亦或在短时 有重要作用。软骨细胞能够分泌多种生长因子，在与 BMSCs 间体外培养情况下三种力的作用效果相似，这三种力的具体 密切接触过程中，可能通过细胞间的信号传导及软骨细胞合 作用机制和参数尚需实验进一步论证。 成并分泌的软骨特异性细胞外基质引起 BMSCs 向软骨分化。 总之，本实验证实了力学刺激确实促进软骨细胞与骨髓 图 1 倒置显微镜下观察(×100)第 2 代 BMSC 呈长梭形，有角状突起(A);第 代软骨细胞呈多角形2(B);混合细胞接种到支架上 周后 1，细胞外 基质逐渐增多填满纤维间的空隙(C) a) Eaa? ) () H#44 a) ?tf? (y)fl) OO 9 ar :(x) ouues OV’9OOX) (O)4f (8)fli(Y)flN9 0) #N* 兔关节骨软骨缺损的实验研究 [J]. 中国美容医学, 2008,17 (3): 基质干细胞共培养体外软骨分化，并有利于体外构建具有良 389-392. 好的组织结构和生物组成的组织工程化软骨。至于力学因素 [5]Marlovits S, HombaueMr , TruppeM , et al. Changesin the ratio of 与少量软骨细胞对 BMSCs 向软骨细胞分化的诱导作用的具 type-I and type-II collagen expression during momolayer cultureof 体机制及二者间的相互作用，以及在体外诱导中最佳的施力 human chondroyctes[J]. J Bone Joint Surg, 2004, 86(5):286 -295. 大小，施力方式及作用时间等尚需进一步研究。 [6]刘天一,周广东,刘伟,等. 力学因素对软骨生物力学性状的影响及 在组织工程中的应用[J]. 国外医学骨科学分册, 2004, 25(1):51 -54. [参考文献][7]刘天一,周广东,苗春雷,等. 力学刺激影响猪骨髓基质干细胞体外 [1]苗春雷,周广东,曹谊林,等. 软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外 软骨形成的初步研究[J]. 中华医学杂志,2004,84(23):1997-2001. [8]孔构建软骨的初步研究 [J]. 上海第二医科大学学报, 2004,2 4(4): 清泉,杨志明,项舟,等. 离心力在体外构建组织工程软骨中的作 246-249. [2]赵子义,杨雷,徐鹏,等. 同种异体骨髓间充质干细胞关用[J]. 中华实验外科杂志, 2005, 22(3):281 -283. 节腔内成软 [9]Gooch KJ, Kwon JH, Blunk T, et al. Effects of mixing intensity on 骨分化的实验研究[J]. 中华外科杂志, 2005, 43(20):1340 -1343. [3]tissue-engineered cartilage[J]. Biotechnol Bioeng, 2001,72:402-407. 周广东,王晓云,苗春雷,等. 骨髓基质细胞修复猪膝关节非负重区 软骨与骨复合缺损的实验研究 [J]. 中华医学杂志, 2004, 8(411): 925-931. [4]王金明,章庆国,张娇,等. 温固化水凝胶负载骨髓基质[收稿日期]2009-02-15 [修回日期]2009-04-09 干细胞修复 编辑 / 张惠娟 论? 著? 三个汉族瘢痕疙瘩家系调查 123 宋良萍 ,陈 阳 ,察鹏飞 ,1.福建检验检疫局国际旅行保健中心 福建 福州 350001,2.福建医科大学附属口腔医院整形外科 福建 福州 350002, 科 福建 福州 3.福州市皮肤病防治院整形外 35002,5[摘要]目的,开展汉族瘢痕疙瘩家系的遗传学研究。方法,收集无亲缘关系的汉族瘢痕疙瘩家系的临床资料,绘制家系图谱,抽 取部分家系成员的外周静脉血样。结果,三个汉族瘢痕疙瘩家系中四代家系1 个,三代家系 2 个,家系成员共 62 人,发病 13 人,可疑发病 1 人,2 个未发病肯定携带者,1 个未发病可疑携带者,三代发病家1系 个,两代发病家 系 2 个,采集家系成员外 周静脉血样 37 份。结论,这三个汉族瘢痕疙瘩家系的遗传模式符合常染色体显性遗传伴外显不完全,家系调查有助于瘢痕疙 瘩的进一步遗传学研究。 [关键词]汉族,瘢痕疙瘩,家系,调查 [中图分类号R394] [文献标识码]A [文章编号]1008-645,5200,905-0662-05 The family survey on three Han Chinese keloid pedigrees 123SONG Liang-ping,CHEN Yang,CHA Peng-fei (1.The Vaccination Department of Fujian International Travel Healthcare Center, Fuzhou 350001, Fujian, China; 2. Department of Plastic Surgery, Affiliated Stomatological Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350002, Fujian, China; 3.Department of Plastic Surgery, Fuzhou Dermatogic Disease Prevention and Cure Hospital，Fuzhou 350025, Fujian, China) Abstract: Objective To evolve the investigation on genetics for Han Chinese keloid pedigrees. Methods To collect the clinical datum from Han Chinese keloid pedigrees among which there was no relationship each other, and then to construct the charts of these pedigrees according to the datum. Peripheral vein blood samples from some members in these families were extracted also. Results Three Han Chinese keloid pedigrees were discovered. Among them, one pedigree spans 4 generations and two span 3 generations. These pedigrees account for 62 family members, of whom 基金项目:福建省科技厅青年人才项目基金资助(编号:2006F3052) 通讯作者:陈阳，福建医科大学附属口腔医院整形外科副主任医师，医学博士;主要研究方向:瘢痕疙瘩易感基因定位; E-mail:cy_chen03@126.com