不同提取方法的板栗花黄酮对293T细胞的影响

不同提取方法的板栗花黄酮对293T细胞的影响 不同方法提取的板栗花黄酮对293T细胞 活力的影响 Effect of the Flavonoid Extracted by Different Methods from Chestnut Flower on 293T Cell Viability 目 录 内容摘要(((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( I Abstract((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( II 1 引言(((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 1 1.1 板栗((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 1 1.2 板栗花((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 2 1.3 黄酮类化合物((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 2 1.4 黄酮类化合物的生物学功能((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 3 1.5 黄酮类化合物提取方法简介((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 4 1.6 293T细胞的概述((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 6 1.7黄酮类化合物的细胞活力研究进展((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 6 1.8 研究目的与意义((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 7 2 实验材料与方法(((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 7 2.1 实验材料((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 7 2.2 实验方法((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 9 3 结果与讨论((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 11 3.1 结果((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 11 3.2 讨论((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 14 4 结论((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 16 参考文献(((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 17 致谢(((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((((( 19 内容摘要:板栗生产中会产生大量的雄花花序，完成授粉只需要很少一部分雄花花序，而多余的雄花花序被直接丢弃，但板栗花中含有大量的生物活力物质，其中黄酮类化合物的含量又较为丰富，而黄酮类化合物具有调节心血管系统、清除氧自由基、抗氧化、抗炎免疫等多种功能的重要的生物活力物质，为此对板栗花黄酮的提取、生物学功能的开展研究有助于提高资源的利用率，并为板栗花的开发应用提供实证依据。本实验选用不同方法得到的板栗花黄酮，设置系列浓度梯度(1 mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml)，采用MTT法研究板栗花黄酮对293T细胞活力的影响。实验结果显示，板栗花黄酮具有显著的抑制293T细胞增殖的作用，抑制率随着黄酮浓度的提高而增大，且不同方法提取的板栗花黄酮抑制率存在差异。在0.01 mg/ml到0.1mg/ml这一浓度范围内，采取水提法、醇提法和半仿生法得到的板栗花黄酮的抑制率依次为17%-56%，10%-76%，34%-81%，抑制率变化最明显，且乙醇回流法提取的板栗花黄酮活力最高，本实验结果为板栗花的综合利用与开发提供理论依据。 关键词:板栗花;黄酮类化合物;MTT法;细胞活力 Abstract: Chinese chestnut production will produce a lot of male inflorescence, pollination need only a small percentage of male inflorescence, the excess of male inflorescence is directly discarded, at the same time, the Chinese chestnut flower contains a lot of biological active substances, among them flavonoids is rich and can eliminate free radicals, so it is the more important active substances and has the functions of antioxidation, anti-cancer, anti-aging, anti-inflammatory, immuno- and cardiovascular-regulatory properties The biological functions of Chinese chestnut floral ketone the extracted by different methods are researched to improve the utilization this resources, and provide the experimental data for the development and application of Chinese chestnut flower. Chinese chestnut flower floral ketone extracted by different ways was chose and set up of the concentration gradient (1 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.001 mg/ml, 0.0001 mg/ml), and the effects on the cell viability of 293T line were determined by MTT method Experimental results showed that the Chinese chestnut floral ketone had significantly inhibition on 293T cell proliferation. Inhibitory rate increased with the concentration of flavonoids, and there were some differences in Chinese chestnut floral ketone getting from different methods at the same level. In the concentration range between 0.01 mg/ml and 0.1 mg/ml, Inhibition rate changes of floral ketone from water-, alcohol- and semi bionics-extraction were 17%~56%, 10%~76%, 34%~81%, respectively. Inhibitiory rate changes of ethanol-extraction of Chinese chestnut flower ketone was the most significant. This experimental results provide the theoretical basis for the comprehensive utilization and development of Chinese chestnut flower. Key Words: Chinese chestnut flower; Flavonoids; MTT method; Cell viability 1 引言 1.1 板栗 板栗属于壳斗科栗属落叶植物，它的学名叫Castanea mollissima Blume。板栗的别名有很多，主要包括中国板栗、毛聚等。板栗的原产地是中国，现在广泛分布于亚洲多个国家和地区，以中国大陆为主，并享有“千果之王”的美誉，与枣、李、杏、 [1]桃合称为“五果”。栗属约有7—9种，比较重要的树种有锥栗、毛栗、美洲栗、美洲矮栗以及板栗。在这些树种中，主要栽培的是中国板栗和美洲栗。 我国的板栗种植具有悠久的历史，我国是板栗、锥栗及毛栗的原产地。板栗不但具有较好的食用价值，还具有较高的药用价值。根据《本草图经》中的记载，板栗有益于冠心病、高血压的防治。而《本草纲目》更是将栗子与莲子相媲美，认为其仁老如莲子。在现代临床医学上，板栗还可用于对反胃等病症的治疗。在日常生活中，如果板栗和其他的食料或药材一起做成可食用的药膳，可以较好地治疗消化 [2]不良、气管炎等疾病。 在现代农业种植中，板栗也是一种非常重要的粮食作物。具体来说，这是因为板栗的坚果质干水少所以比较方便进行保存运输，同时采用不同方法制作出来的板栗也由于味道甜美和营养物质丰富受到广大消费者的喜爱。依据相关的文献研究资料对板栗仁中营养物质的分析，结果表明板栗仁的淀粉和糖类物质含量丰富，蛋白质和脂肪的含量则在5%左右，维生素A、维生素B1等维生素类物质含量也较为丰富，同时板栗仁中也含有少量的各类矿物质及黄酮类化合物。正是因为板栗的食用价值较高，所以板栗的制作方法也多种多样，主要包括将栗子加水熬汤食用或将栗子炒熟食用。据相关文献研究表明，炒熟后的板栗可以作为治疗淤血肿痛和各种跌打损的辅助药。但需要指明的是，虽然栗子营养物质丰富且功能较多，但是栗子在熟食时容易滞气，所以不能过多食用，避免因此造成消化不良。 我国的中医学对板栗也有较为深入的研究，研究表明，板栗的性味是甘温的，具有栗子性味养胃健脾、止血消肿等功能。板栗由于含有大量的生物活力物质因此能够起到较好地生活保健功能，能够实现对动脉粥样僵化、糖尿病等老年常见病症 1 起到较好地防治治疗作用。与此同时，相关研究表明，如果老年人在日常生活中进食适量的栗子，可以提高老年人的免疫力、有效帮助老年人对抗衰老，进而实现延年益寿的作用。 1.2 板栗花 板栗花通常指的是板栗树上的雄花花序，具涩肠止泻的功效。具体来说，因为板栗属于雌雄同株，板栗树上的雌雄花比例约在1:2400—1:4000之间，而为了实现有效的板栗种植生长，雌花授粉只需要5%-10%的雄花序即可。板栗花中富含多种有益人体的有机天然产物成分，特别是富含黄酮、活力钙、维生素E及蛋白质等生物 [3]活力物质。这些有效生物活力物质能够对人体起到较好的保健作用，可以对人体起到改善血管通透性，降低血糖及胆固醇、减少血栓的形成、抗菌、抗衰老、抑制肿瘤等作用。根据现有文献资料表明，板栗花是目前已知的花粉中黄酮类物质含量最 [4]高的，同时黄酮类物质在食品、药品等多个领域具有广泛的开发应用。而随着近年来板栗种植面积的增加，进一步产生了大量板栗花雄花花序，而其利用价值未被充分认识，大部分雄花花序都是被当做废弃物给处理掉，这无疑是造成了巨大的资源浪费。 板栗花粉中含有丰富的黄酮、氨基酸、精油等多种生物活力物质。对于植物体而言，其精华主要存在于花粉中，营养物质相当丰富，因此花粉拥有“微型营养库”、 [5]“完全营养品”的美称，是一种天然的绿色营养品。板栗花的医药作用在很早以前就被我国医学界所熟知和认可，根据《中药大辞典》记载，板栗花具有治疗瘰疬、小儿消化不良等功效。而且板栗花的提取物也具有显著的生物学作用，可以有效改善血管通透性、减少血栓的形成、提高机体免疫力。同时还可以较好地实现抗菌、抗氧化等。 1.3 黄酮类化合物 黄酮类化合物的化学结构是以C6-C3-C6作为基本骨架，然后依据中间的三碳链 2 氧化程度的差异和苯基(B环)连接位置的不同，由此将黄酮分为不同类型，具体 [6]包括黄酮、二氢异黄酮等化合物。 黄酮类物质的抗肿瘤作用机制与其抗氧化、清除自由基的作用密切相关。而黄酮类化合物清除自由基作用强弱受其结构影响，如酚羟基取代模式及数目和B环上 [7]是否存在邻二酚羟基等，从而影响其抗癌效果。现有研究表明，黄酮类化合物对于正常的细胞如293T细胞并不存在致突和毒性作用，但是对肿瘤细胞或者肿瘤细胞则 [8]具有一定的毒作用。同样的松树皮中提取的黄酮类化合物可以实现对MCF—7细 [9]胞的诱导使其凋亡，但并不对正常的细胞产生任何影响。因此，黄酮类化合物这种选择性毒性对于研究和开发板栗花黄酮有重要作用。 1.4 黄酮类化合物的生物学功能 黄酮类化合物在医学上具有多种功能，它主要具有清除氧自由基、调节心血管 [10]系统等作用。而生物类黄酮还具有解痉、抗过敏、吸收紫外辐射、保护肝脏等作用。由于黄酮类化合物具有多种生理影响和药理作用，所以综合利用的价值前景比较广阔，因此，许多公司都争相加大对黄酮类化合物的早期研究开发和后期实际生产，尤其在医疗和保健品行业，黄酮类化合物的研究更是受到了强大的支持和广泛的关注程度。 1.4.1 抗癌抗肿瘤 癌症产生的原因在于许多致癌因子致使自由基在人体内富集，脂质的过氧化引起细胞的DNA解链断裂，从而导致细胞的生长不受正常的机理控制，不断破坏正常的组织和器官。黄酮化合物具有清除自由基和抗氧化的作用，可以通过清除自由基， [11]抑制脂质的过氧化，减缓细胞中DNA被破坏速度从而实现抗癌作用。而一些生物类黄酮能够抑制肿瘤细胞中的线粒体琥珀酸氧化酶的活力从而实现抗癌。黄酮类化合物主要作用于肿瘤细胞的S或M期，通过干扰肿瘤细胞原有的细胞周期使细胞周期变得紊乱从而实现对肿瘤细胞增殖的抑制，达到不断抗肿瘤这一目的。 3 1.4.2 抗心脑血管疾病 黄酮类化合物同样的在治疗心脑血管疾病的过程中被广泛地应用，这是因为黄酮类化合物具有降低胆固醇的功能，具体来说就是对血栓的抑制和对扩张冠状动脉 [12]的抑制从而实现对动脉粥样僵化等疾病的治疗。通过现有文献资料的研究发现，黄酮类化合物中的芦丁是最早发现的能够有效降低血压的降压药，之后则陆续发现了黄酮类化合中的海棠素、黄芩苷也都具有较为明显的降压效果。黄酮类化合物化合物能够治疗心脑血管疾病的原理在于黄酮类化合物可以阻断受体对线粒体所产生的正性影响，同时也可以通过抑制PDEG的活力从而可以变时性调节心肌收缩。 1.4.3 免疫调节作用 黄酮类化合物可以增强机体的体液免疫功能和非特异免疫功能。黄酮类化合物一般通过对T 淋巴细胞、巨噬细胞等相关免疫类细胞的影响以及影响胸腺的相关功能来实现免疫调节。但是生物类黄酮增强机体免疫功能的作用机制至今未能完全阐 [13]释清楚，但是其效果和功能确实的确存在。 1.4.4 降血糖作用 黄酮类化合物能够加快胰岛β细胞的恢复速度，从而可以实现对血糖和血清胆固醇浓度的降低，而且可以持续性的改善糖耐量。黄酮类化合物中的抗肾上腺素则具有升血糖作用，同时还能够抑制醛糖还原酶。 1.4.5 抗辐射 电辐射作用于人体使得人体内的自由基数目增加，加大了对细胞功能和结构的损坏程度。但是黄酮类化合物因为可以清除自由基所以具备抗辐射的能力。 1.5 黄酮类化合物提取方法简介 综合现有各类相关文献资料，黄酮类化合物的提取方法主要有水提法、微波场 [14]提取法、超声波法、乙醇回流法、超临界流体萃取法、酶解法等。本文只对黄酮类化合物的其中一些提取方法做简要介绍。 4 1.5.1 水提法 适于黄酮甙类物质的提取。这种提取方法的优势在于成本低、对环境及人类并不会产生毒害作用，而且对提取设备的要求较低，且容易操作，适合应用在工业化大生产中。但是其缺点在于提取率较低，而且成分不纯，对后续的分离纯化造成很大的麻烦。 1.5.2 有机溶剂提取法 主要原理是基于相似相溶原理来选择适合的有机溶剂以区分开黄酮类化合物和极性不同的杂质。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。游离甙元一般难溶或不溶于水，但是却易溶于乙酸乙酯、甲醇、乙醇等有机溶剂及稀碱液中，而黄酮 [15]甙类易溶于水、甲醇、乙醇等强极性的溶剂中。 1.5.3 微波法 微波法提取黄酮类化合物的原理是利用磁控管所产生的超高频率的快速震动，使得被提取原料内的分子间不断相互挤压、碰撞，使得有效成分较好地浸出而获得提取物。这种方法的优点在于选择性很强、反应非常高效、产率高、产物易提纯等。同时在进行提取的过程中，原料细粉并不会出现糊化、凝聚等不利于提取的现象，由此可以大大提高黄酮类物质的提取率。 1.5.4 酶解法 这一方法主要应用在黄酮类化合物被细胞壁紧密包围导致黄酮类化合物不能方便的被提取出来的相关原料上。酶解法提取黄酮类化合物的原理是通过在原料中加入相关的酶使得细胞壁结构中的纤维素和细胞间相互连接的媒介物质果胶被充分的破坏，使得纤维素断裂和果胶分子被分解为若干小分子物质，最大程度的消缓黄酮类化合物在提取过程中面对的传质阻力，从而使得被提取的物质得以被完全释放出来，从而达到提取的目的。这一方法的优点在于可以最大程度的提取不易提取的黄酮类物质，但是缺点在于价格较高。 5 1.5.5 超声波提取法 超声波提取黄酮类化合物的原理在于利用超声波的空化作用从而加速植物中有效成分的快速浸出。采用这种方法的优点在于提取设备简单、操作方便、有利于提取出热不稳定成分。 1.5.6 超临界流体萃取法 超临界流体萃取法提取黄酮类化合物主要指的是利用CO在超临界下进行萃2 取。这种方法的主要优点在于提取率高，容易进行分离、不会出现溶剂污染提取物的情况，而且可以选择性地进行提取分离和纯化。虽然这种提取方法的优点较多，但是不容忽视的是其提取成本相对较高，同时由于CO是非极性溶剂，所以对极性2 较强的黄酮类物质则提取率不高。所以为了解决这一问题，常常在超临界的CO中2加入其他物质以改变极性。加入的物质被统称为夹带剂，目前常用的夹带剂有乙酸 [16]乙酯、乙醇、水等。 1.6 293T细胞概述 293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，而293T细胞是由293细胞派生而来，被广泛应用于转染目标蛋白，是属于表达SV40大T抗原的人肾上皮细 [17]胞系。293T细胞具有永生化生长的特点，其属于贴壁细胞，但是因为细胞贴壁并不紧密，所以可以不用采用胰蛋白酶消化，采用EDTA进行消化即可实现细胞从壁上脱落下来的目的。同时293T细胞易生长，培养技术简单，对培养基环境要求比较低，一般不到一天的时间就可以实现倍增，而且在培养过程时对培养基环境要求较[18]低。 1.7 黄酮类化合物的细胞活力研究进展 纵观现有文献资料，在研究黄酮类化合物对细胞的影响时，大多数的研究者是采用癌细胞或者是肿瘤细胞。现有的研究资料表明，黄酮类化合物一个很重要的药用功能就是抗癌抗肿瘤，所以直接选用肿瘤细胞或癌细胞显得非常方便。而最常用 6 的Hela细胞和肝癌细胞。但在实际应用中，更多使用的是Hela细胞，这是因为Hela细胞属于人子宫颈癌细胞的细胞系，且其细胞的特点是可以进行连续传代培养，增殖速度异常地迅速，同时细胞株永远不会出现衰老或蜕化等现象，可以无限分裂下[19]去。在相关文献研究中，黄酮类化合物对Hela细胞的增殖表现出较为强烈的抑制，实验结果非常理想。但在目前现有的研究中，很少涉及黄酮类化合物对正常细胞的影响。为了探究这一相对空白的领域，本文采用正常的293T细胞作为被研究对象。 1.8 研究目的与意义 通过对现有研究成果的研究，我们发现黄酮类化合物对癌细胞等具有细胞毒作用，对正常的细胞则不具有致突作用，反而对正常的细胞能够产生较为明显的正向免疫调节作用。而板栗花黄酮对正常细胞的生长是否具有毒性作用目前还未见诸报道。 故而，本研究的意义在于利用293T这类正常细胞对板栗花黄酮的作用进行深入的探究，并为未来板栗花黄酮的应用开发提供实证依据。 2 实验材料及方法 2.1 实验材料 2.1.1 实验试剂 DMEM培养液 HyClone 购于赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司 培养液配法:DMEM: FBS =9:1，并加入0.1%双抗(硫酸庆大霉素和青霉素) 细胞冻存液:含45%FBS、10%DMSO、45%DMEM PBS (PH 7.4)溶液:分别称取NaCl 8g、NaHPO?12HO 1.44 g 和KCl 0.2g以及242 KHPO 0.24 g，并向其中加入去离子水800 mL，然后对其进行充分的搅拌以完全溶24 解，再向其中加入浓盐酸调PH至7.4，最后加去离子水定容至1L。 7 MTT溶液:首先称取MTT 0.5克，并将其溶于100ml的PBS溶液中，然后使用0.22μm级的滤膜进行过滤，这一操作的目的是为了除去溶液里的细菌，然后在4?下避光保存即可。 其中，DMSO为二甲基亚砜的英文缩写、FBS为胎牛血清的英文缩写、PBS为磷酸缓冲液的英文缩写。 2.1.2 实验材料 板栗花:来源于河北省唐山市迁西县干板栗花。 细胞株:本实验用293T细胞由天津商业大学实验室提供 水提法提取板栗花黄酮:由河北省唐山市迁西县板栗研究发展中心提供 半仿生法提取板栗花黄酮:通过pH为2.2、7.6、8.0的磷酸氢二钠―柠檬酸缓冲溶液作为浸提剂提取板栗花黄酮。设置料液比为1?20在70?下提取20min，后合并滤液离心取上清用旋转蒸发器浓缩得到黄酮粗提液。 乙醇回流法提取板栗花黄酮:板栗花粉末经石油醚脱脂后，用80%的乙醇按料液比为1?20在80?条件下提取2h，后离心取上清用旋转蒸发器浓缩得到黄酮粗提液。 2.1.3 实验仪器设备 CO恒温培养箱 HeraeusHERAcell 240i 美国Thermo公司 2 96孔板细胞培养板 美国Thermo公司 酶联免疫检测仪 SPECTRAMAX-M5 德国AID公司 台式离心机 SIGMA3-18K 德国SIGMA公司 超净工作台 FHC-1200A 北京国仪合信商贸有限公司 微孔过滤器 0.2um孔 上海吉虑过滤科技有限公司 倒置荧光显微镜 Nikon eclipse Ti-u 日本尼康公司 微孔板快速振荡器 QB-9001 杭州陆恒生物科技有限公司 8 2.2 实验方法 2.2.1 MTT法测定细胞活力的原理 MTT是一种黄色化合物，其化学名称是3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名称为噻唑蓝。MTT的检验原理是能够进行正常新陈代谢的活细胞的线粒体中产生的琥珀酸脱氢酶可以将外源性地MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶 [20]甲瓒，并在细胞中沉积。而无法进行新陈代谢的死亡细胞则无法产生琥珀酸脱氢酶，进而也就无法产生蓝紫色结晶。而DMSO(二甲基亚砜)可以将细胞中的甲瓒溶解，并在490nm处使用酶联免疫检测仪测定其光吸收值，这一数值可以反映待测细胞液中活细胞的数量。如果将这一光吸收值比上对照组的光吸收值得到的就是相对吸光度值，这一数值用RA表示。而RA表示细胞存活率，通过这一数值可以换算出细胞存活抑制率，从而间接地知道细胞存活的数量。一般地，OD值的大小与细胞的数量有关。所以，本实验可以采用OD值对细胞的存活情况进行研究，用细胞存 [21]活抑制率来表示黄酮类化合物对细胞生长情况的影响。需要说明的是，当细胞的 [22]数量在一定范围内时，MTT结晶形成的量与293T的细胞数量呈正比。 此次实验选择在不同浓度梯度下(1 mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml)的板栗花黄酮的培养液中培养293T细胞，并观察细胞的生长情况和然后通过公式计算出黄酮对293T细胞的抑制率。 2.2.2 实验步骤 2.2.2.1 293T细胞的复苏 首先小心翼翼地将装有293T细胞的冻存管从液氮中取出，快速地将冻存管放入准备好的37?1?水中，用木镊子夹住冻存管使其完全浸没在水中，并不断地在水中 [23]搅拌，持续时间为1min，以期使其融化。在融化结束后，用酒精棉球擦拭细胞冻存管防止细胞污染，然后将其移入到EP管中。在离心机中在8000rpm下离心3min。然后将EP管移到超净工作台上，在超净工作台中将上清液废弃，再加入约1ml的完 9 全培养液，用吸管吹打使得细胞悬浮在培养液中。然后将培养液移入到细胞培养瓶中，并加入胎牛血清和培养液，要做到使得培养液浸没瓶底的细胞。将培养瓶放置到5% CO培养箱中，在37?下进行培养。 2 2.2.2. 293T细胞的传代培养 取出培养瓶，在荧光显微镜下进行观察，在细胞的贴壁生长几乎铺满整个培养瓶的时候，开始进行细胞传代培养，主要原因在于在这时细胞达到了对数生长期，细胞生长繁殖速度较为快速。选择生长状态良好的293T细胞一瓶，沿着顺时针方向以手背为圆心轻轻的摇动，若干次以后，细胞表面的碎片会悬浮在液面上，这时将悬浮液连同生长液一起倒掉，并用PBS液漂洗1次，然后加入FBS消化液进行消化[24]。然后将离心液平均地分配到三个洁净干燥的培养皿中，并向其中分别加入胎牛血清和培养液，在5% CO2培养箱中在37?下进行培养。接种后约12小时以后开始进行贴壁生长，在48小时后更换生长液，而3—4天后会形成单层细胞，对单层细 [25]胞更换维持液，以方便后续实验使用。 2.2.2.3 293T细胞的计数 当细胞在细胞悬液中呈均匀分布的时候，可以通过测定特定体积的悬液中细胞数目，间接地换算出每毫升细胞悬液中的细胞数量。具体操作步骤是，首先用95%的酒精或无水酒精清洁盖玻片和血球计数板，并用酒精棉球将计数板和盖玻片擦拭干净。其次制备单细胞悬液，应该严格控制细胞密度，具体的要求是细胞密度不能 4少于10个/ml，在制作方法上在可以采用直接收集悬浮或用消化液分散单细胞的方 [26]法来制成单细胞悬液。需要注意的是，在加样时，滴加的细胞悬液的体积应适量，不能出现气泡，而且当出现气泡时要静置。细胞悬液加样结束后，需要在显微镜下用10×这一倍数的物镜对四角大方格中的细胞数目进行计数。需要特别指出的是，如果细胞压在中线上，那么只计量左侧和方格上方的细胞数目，对右侧和下方的细 [27]胞数目不计入总数。 10 2.2.2.4 MTT法测定293T细胞的细胞活力 5取用培养好的293T细胞，并选用三个孔板，并将293T细胞按照1×10个细胞/200μL接种在96孔板上，然后再依次加入200μL含不同浓度的水提法提取的板栗花黄酮、半仿生法提取的板栗花黄酮、乙醇回流法提取的板栗花黄酮的同体积培养液。同时板栗花黄酮设5个浓度，其浓度梯度分别是1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml。每一个浓度设置五个重复孔，并设置空白对照孔(只向其中加入200μL的培养液)。接种完毕后，将三个孔板均放置在37?条件下于5% CO2孵箱中培养24h。待培养至出现贴壁时PBS清洗2-3次换液。然后再向每孔中加入20μLMTT液，继续放置在37?条件下于5% CO孵箱中培养4h。然后利用吸泵小心2 翼翼地依次吸出上清液，并向每个孔中加入DMSO(二甲基亚砜)l50μL使反应终止，然后再放置在摇床低速振荡10min，使得蓝紫色的结晶物充分地溶解。混合均匀后的孔板放置在酶联免疫检测仪中，将测定波长设置在490nm处来测定三个孔板的光密度值(OD)，首先计算水提法提取的板栗花黄酮在不同浓度下的平均OD值，依次计算出半仿生法以及乙醇回流法提取的板栗花黄酮在不同浓度下的平均OD值。将实验结果进行整理，并且按照下列公式计算三种不同方法提取的板栗花黄酮对293T细胞生长的抑制率。 细胞生长抑制率(%)=(1-OD/OD)*100% 12 式中:OD表示实验组吸光度值;OD表对照组吸收光度值。 12 3 结果与讨论 3.1 结果 3.1.1 水提法提取的板栗花黄酮对293T细胞活力的影响 按照2.1.2中的实验操作步骤，选用水提法提取出来的板栗花黄酮在不同的浓 11 度梯度下测定黄酮对293T细胞的活力影响。实验结果如表1。 表1 水提法的板栗花黄酮对293T细胞活力的影响(?S.D) 实验组 浓度 OD值 抑制率 (mg/mL) (%) 对照组 0 1.08?0.394 - 1 1 0.35?0.034* 64?0.129 2 0.1 0.44?0.054* 56?0.127 3 0.01 0.89?0.009 17?0.262 4 0.001 0.89?0.076 12?0.209 5 0.0001 1.05?0.343 2?0.033 注:*与对照组比较，p,0.05 70 60 50 40 30 20抑制率(%) 10 0 0.00010.0010.010.11 水提板栗花黄酮浓度(mg/ml) 图1 水提法的板栗花黄酮对293T细胞的活力影响 水提取法的板栗花黄酮作用在293T细胞24h以后，在实验设计的浓度梯度范围内，随着黄酮浓度的增加，293T细胞的抑制率液不断提高。尤其是板栗花浓度从0.01mg/ml提升为0.1mg/ml的时候，抑制率提升明显。 3.1.2 半仿生法提取的板栗花黄酮对293T细胞活力的影响 按照2.1.2中的实验操作步骤，选用水提法提取出来的板栗花黄酮在不同的浓度 。 梯度下测定黄酮对293T细胞的活力影响。实验结果如表2 12 表2 半仿生法的板栗花黄酮对293T细胞活力的影响(?S.D) 实验组 浓度 OD值 抑制率 (mg/mL) (%) 对照组 0 1.68?0.204 - 1 1 0.308?0.021* 81?0.031 2 0.1 0.39?0.076* 76?0.037 3 0.01 1.49?0.229 10?0.161 4 0.001 1.53?0.169 7?0.196 5 0.0001 1.55?0.349 7?0.203 注:*与对照组比较，p,0.05 90 80 70 60 )50% 40 30抑制率( 20 10 00.00010.0010.010.11 半仿生板栗花黄酮浓度(mg/ml) 图2 半仿生法的板栗花黄酮对293T细胞的活力影响 半仿生法的板栗花黄酮同样对293T细胞活力的影响呈现出随着板栗花黄酮浓度的提高，抑制率液不断提高的实验结果。在这个实验中，板栗花黄酮的浓度由0.0001mg/ml变为0.001mg/ml时，抑制率变化不明显，出现这种实验结果的原因有待于进一步验证。同样的，黄酮浓度由0.01mg/ml提高为0.1mg/ml时，293T细胞的抑制率提高明显。 3.1.3 乙醇回流法的板栗花黄酮对293T细胞活力的影响 按照2.1.2中的实验操作步骤，选用水提法提取出来的板栗花黄酮在不同的浓度 13 梯度下测定黄酮对293T细胞的活力影响。实验结果如表3。 表3 乙醇回流法的板栗花黄酮对293T细胞活力的影响(?S.D) 实验组 浓度 OD值 抑制率 (mg/mL) (%) 对照组 0 1.56?0.588 - 1 1 0.17?0.028* 88?0.047 2 0.1 0.27?0.044* 81?0.039 3 0.01 0.91?0.159* 34?0.308 4 0.001 1.22?0.219 13?0.409 5 0.0001 1.35?0.205 9?0.236 注:*与对照组比较，p,0.05 100 80 60)% 40 抑制率( 20 00.00010.0010.010.11 乙醇提板栗花黄酮浓度(mg/ml) 图3 乙醇回流的板栗花黄酮对293T细胞的活力影响 乙醇回流的板栗花黄酮对293T细胞的抑制率是随着黄酮浓度的提高而增大，浓度与抑制率之间呈现出一定的正相关。同样的，在板栗花黄酮浓度由0.001mg/ml提高为0.01mg/ml，黄酮对293T细胞的抑制率变化最大。 3.2 讨论 为了直观地对比三种不同提取方法下的板栗花黄酮对293T细胞活力的影响，现将水提法、半仿生法、乙醇回流法三组数据整理到一个图中。如图4所示。 14 90 80 水提取法 半仿生法70 乙醇回流法 60 )50% 40 30抑制率( 20 10 0 0.00010.0010.010.11 板栗花黄酮浓度(mg/ml) 图4 不同方法提取的板栗花黄酮对293T细胞的活力影响 由图4可以发现，虽然提取方法不同，但是三组板栗花黄酮对293T细胞的抑制率都是随着板栗花黄酮浓度的增大而增大，并且均是在黄酮浓度由0.01mg/ml增大至0.1mg/ml时，抑制率的变化最大，三组分别是17%—56%，10%—76%以及34%—81%。这说明在这一浓度范围内，293T细胞内的某些物质被严重破坏，抑制了293T细胞的增殖。根据现有文献资料，预期是黄酮抑制293T细胞生长可能与抑制核酸的合成有关，而且B环可能抑制核酸发挥主要功能，也可能是黄酮通过抑制细胞膜的功能导致的。具体的抑制原理根据现有文献尚且不能完全解释清楚，这还需要进一步的考证研究。同时，在三种方法提取的板栗花黄酮在浓度一定时，三种方法提取的板栗花黄酮对293T细胞的抑制率大小不同。尤其是在1mg/ml处，水提法提取的板栗花黄酮对293T细胞的抑制率为64%，半仿生法提取的板栗花黄酮对293T细胞的抑制率为81%，乙醇回流法提取的板栗花黄酮对293T的抑制率为88%。这说明乙醇回流法提取的出来的板栗花黄酮的活力最强，半仿生法次之，而水提法提取出来的板栗花黄酮活力最弱。这说明，应该采取乙醇回流法提取板栗花黄酮，因为采用这种方法提取出的黄酮的活力最强。 15 4 结论 本论文应用MTT法测定不同提取方法得到的板栗花黄酮，在不同浓度下(1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml)对293T细胞活力的影响，得到如下结论: 不同提取工艺方法得到的黄酮，对293T细胞活力有显著的抑制作用，且随着浓度的增加而增加，不同方法得到的板栗花黄酮在相同的浓度下，抑制活力也表现出不同的的活力。在实验中浓度水平范围内(0.1-0.01mg/ml)，通过实验可以得知，板栗花黄酮对293T细胞的抑制率变化最大。同时对比在同浓度下，乙醇回流法对细胞的抑制率最大，说明乙醇回流法得到的黄酮显示有较强的抑制细胞活力的作用。 16 参考文献 [1]姚叶.“肾之果”——栗子[J].开卷有益:求医问药. 2014, (9):68-68. 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