活性乳酸菌饮料污染菌总数
方法
活性乳酸菌饮料污染菌总数检测方法 wwwchinadairynet
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中国乳品工业
dairyINDUSTRY
活性乳酸菌饮料污染菌总数检测方法
马德良,蔡芷荷,吴清平
(1.广东环凯微生物科技有限公司,广I510700;2.广东省微生物研究所,广州510700) 摘要:在培养基中添加无菌TTC(三苯基四氮唑),最终质量浓度为2,5mg/L,使茵落变红,方便观察计数.发现使用营养琼脂倾注法
检验,至10-4稀释度才能消除样品中营养成分的干扰:而采用滤膜法,能有效消除
可以准确,灵敏地检验活性乳 饮料中营养成分的干扰.
酸茵饮料q-污染茵数,检测下限达到10mL1整个货架期,蜡样芽孢杆菌,大肠埃希氏菌,沙门氏菌等污染茵在活性乳酸茵饮料中可以
存活.建立准确简便的活性乳酸菌饮料茵落总数检测方法非常必要..
关键词:乳酸茵饮料:污染菌总数:检测培养基;检测方法
中图分类号:TS252.7文献标识码:A文章编号:1O01,2230(2010)04—0054—03 DetectionmethodofthetotalcontaminatedbacteriafortheactiveLactobaciUus
beverage
MADe—liang,CAIZhi—he,WUQing—ping2
(1.GuangdongHuankaiMicroorganismTechnologyCompany,Guangzhou510700,China;
2.Microorganisminstituteof
GuangdongProvince,Guangzhou510700,China) Abstract:Inthepresentstudy2.5mg/LsterileTTCwasputintothemediumtomakethebacteri
aredfortheconveniencecountingandfound thatthedisturbanceofthenutrientcompoundscouldbevanishedtill1()dilution.Howeverthe
filtermembranemethodcouldeliminatethedis
turbanceofthenutritioninthebeveragetodetectthecontaminatedbacteriaaccuratelyandeffe
ctivelywhichdetectionlowerlimitcanreachtO 10mL
一.DuetOthelivingofthecontaminatedbacteriaincludingBacilluscereusEscherichiacoliS
almonellaetc.inthebeverageduringtheshelfdate, itisveryimpressivetOsetupanaccurateandfastdetectionmethod.
Keywords:Lactobacillusbeverage;totalnumberofcontaminatedbacteria;detectionculture
medium;detectionmethod
0引言
乳酸菌对人体的保健作用不断被人们所认识.酸
奶制品发展迅速.越来越多的具有特殊益生功能的乳
酸菌被添加到乳品中.以酸乳为代表的活性乳酸菌制
品已成为人们日常饮品乳酸菌数量是评价该类产品
营养价值与保健作用的重要依据因此.该类产品质
量评价常用活菌计数法评定酸乳国家标准…中规定.
乳酸菌数不得低于1×10mL活性乳酸菌制品由于
本身含有大量的活性乳酸菌.对污染菌总数检测形成
极大干扰.其菌落总数的检测难题一直困扰着生产者
和卫生监督者.我国目前还没有统一的活性乳酸菌制
品污染菌总数的测定方法
本研究采用不同的培养基和不同的检测方法来
测定乳酸制品中污染菌数的含量.以寻找适宜的计数
培养基和检测方法
收稿日期:2009,10—16
作者简介:马德良(1969一),男,工程师,从事微生物培养基方向的
研究.
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种
植物乳杆菌(Lactobacillusplantanum)GIN1.140:嗜热 乳酸链球菌(Streptococcusthermophilus)IFFI6038;干酪乳 杆菌(Lactobacilluscasei)HK10051;嗜酸乳杆菌(Lacto— bacillusacidophilus)HK10031:大肠埃希氏菌(Escherichia
coli)ATCC25922;金黄色葡萄球菌(Staphylococcusau— reus)ATCC6538;蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)CMCC
(B)63301.
1.1.2样品
市场上销售的货架期内的酸奶4种.分别以样品 A,B,C,D代之.
1.1.3培养基
平板计数琼脂,营养琼脂,TTC营养琼脂(TTC质 量浓度为2.5mg/L),MRS琼脂培养基,BCP平板计数 琼脂(自配).
以上培养基除BCP平板计数琼脂按照配JS-自配 外.均为商品化干燥培养基
54
InspectionMethods测定方法
1.2方法
(1)倾注法.乳酸菌质控菌株在试验培养基上的 生长.IRMRS~基斜面上植物乳杆菌,嗜热乳酸链 球菌,十酪乳杆菌,嗜酸乳杆菌的新鲜培养物.以无菌 生理盐水稀释至0.5麦氏比浊管浓度.再10"f~系列稀释 至10稀释度取各稀释度菌液1mLhH入无菌平??中. 将灭菌后冷至45ocL右的平板计'数琼脂,营养琼脂, MRS琼脂,BCPTa板{f一数琼脂培养基注入平皿.与菌 液充分混匀,凝固后倒置培-9~37?(48h).每个稀释 度2个平行
(2)倾注法.样品中乳酸菌在试验培养基一f的生
长市售保质期内的4种酸奶无菌操作取样.以无菌 生理盐水系列稀释至10稀释度.取各稀释度稀释液 1mL加入无菌平皿中.将灭菌后冷至45?左右的平板 计数琼脂,营养琼脂,MRs琼脂,BCP~-板计数琼脂 培养基注入平皿.与菌液充分混匀.凝固后倒置培养 37oc(48h)每个稀释度2个平行
(3)滤膜法.样品中乳酸菌在试验培养基上的生 长取1.2(2)样品稀释液1n1L至适量(25mL)无菌生 理盐水中混匀,将稀释液通过0.45m滤膜过滤,再用 100mL_A41理盐水冲洗滤膜.将冲洗后滤膜滤面朝上贴 于平板计数琼脂,TTC营养琼脂,MRS琼脂,BCP平板 计数琼脂脂平板每个稀释度2个平行.
(4)滤膜法和倾注法.人工污染样品污染菌的检 出取大肠埃希氏菌,金黄色葡萄球菌,蜡样芽孢杆菌 营养琼脂斜面新鲜培养物.以无菌牛理盐水稀释至0.5 麦氏比浊管浓度.然后10倍系列稀释.使用营养琼脂 倾注法计数3种菌液的菌量同时.将3种菌的适宜稀 释度菌液分别加入证明无菌的A,B,c.D样品中,使样 品中各污染菌浓度达到1000n1L-.左右取1mL加菌 后样品至9niL无菌牛理盐水中混匀制成10倍稀释液. 取1mL稀释液通过0.45"m滤膜过滤,再用100mL生 理盐水冲洗滤膜.冲洗后滤膜滤面朝上贴于TTc营养 琼脂平板同时.TTC营养琼脂倾注法分别对人工污 染样品的1()倍稀释液计数..
(5)冷藏条件下,污染菌在样品中的存活状况.取 大肠埃希氏菌,金黄色葡萄球菌,蜡样芽孢杆菌营养 琼脂斜面新鲜培养物.以无菌牛理盐水稀释至0.5麦氏 比浊管浓度.然后1()倍系列稀释,加入证明无菌的样品 A中.使样品中各菌浓度达到1000mL-.左右.将混菌
后的样品于4?保存;于5,10,15,3()d;用滤膜法测定3 种菌的总数
2结果
(1)倾注法,乳酸菌质控菌株在试验培养基上的 生长表1为4种乳酸菌在不同培养基卜的生长情况 由表1可以看出.4种乳酸菌在营养琼脂上各稀释度均 无生长:平板计数琼脂的菌落细小.10稀释度处仍 有菌落生长:MRS琼脂上菌落较大,呈白色;BCP-~--板 计数琼脂上菌落小呈黄色:MRs琼脂和BCP~-板计数 琼脂生长率相当.约比平板计数琼脂高出2个数量级. 表14种乳酸菌在不同培养基上的生长情况 注:一为尢生长
(2)不同检验方法——倾注法和滤膜法.样品中 乳酸菌在试验培养基上的生长情况.倾注法:营养 琼脂上.4种样品在10.10,.10稀释度处均有菌生
至10一,稀释度有菌生长;MRS', 长;平板计数琼脂上,
脂和BCP2Ta板计数琼脂生长率相当.大致比平板计数 琼脂高出2个数量级
采取滤膜法时.样品各稀释度在营养琼脂上均无 菌生长.其他3种培养基检出情况与倾注法相当检出 情况如表2所示
(3)人工污染样品污染菌的检出乳酸菌量109mE-1 以上的样品A,B,c.D中.人工加入100mL左右污染 菌.采用滤膜法.高浓度本底乳酸菌存在情况下,可以 正确检出污染菌数:倾注法,乳酸菌和污染菌同时大量 生长.无法计数及区分污染菌人工污染样品污染菌 的检出如表3所示
(4)杂菌在酸奶中冷藏保存状态下的变化情况如 表5所示大肠埃希氏菌,金黄色葡萄球菌30d后仅仅下
降了一个数量级,而蜡样芽孢杆菌的数量基本不变. 3讨论
污染菌总数的测定.可以了解产品在生产中,从 原料加工到成品包装及贮存运输等环节受外界污染 Vol38INTO4201O(total2331????
测定方法InspectionMethods 表2不同检验方法样品在4种培养基上的检出情况 样品本底乳酸菌量加入污染菌加人污染菌量倾注法检出值滤膜法检出值
表4冷藏条件下污染菌的变化情况n1I_ 的情况,也可以观测产品中细菌的性质以及细菌在产 品中繁殖动态.可以对被检样品进行卫生学评价时提 供科学依据.菌落总数是检测
产品卫生状况的重要指标实
验证明.乳酸菌制品中的污染
菌在产品货架期内可以存活.
对消费者的健康造成潜在的
威胁因此.必须对活性乳酸
菌制品的污染菌总数进行检
测活性乳酸菌制品由于本身
含有大量的活性乳酸菌.对污
染菌总数检测形成极大干扰.
其菌落总数的检测难题一直
困扰着生产者和卫生监督者.
国际上有日本《乳酸菌粉
末清凉饮料菌落总数测定》删
及ISO13559:2002(E)《黄油,发
酵奶制品和鲜奶酪.污染微生
物的计数在30oC时的菌落计
数法}f41.ISO13559:2002(E)采
用涂布法.低稀释度时由于样 品中营养成分的干扰.乳酸菌 可以生长.造成检测灵敏度下 降,而且培养时间长:日本《乳 酸菌粉末清凉饮料菌落总数 测定》,用添加青霉素G钾的葡 萄糖琼脂培养基与添加4%氯 化钠的BCP平板计数琼脂培 养基上生长菌落数的差值作 为菌落总数.操作繁琐.由于 培养基添加的选择性抑制成 分对检测结果的影响复杂.降 低了结果的准确度
乳酸菌的酶系比较单纯. 不能合成多种氨基酸,维生素 和生长因子实验证明.德氏 乳杆菌保加利亚种,嗜热链球 菌,嗜酸乳杆菌,植物乳杆菌 不能利用含碳氮源.当培养基 中没有可以利用的碳源时不 能生长.平板计数琼脂中含 有葡萄糖.上述4种乳酸菌均 能生长营养琼脂是生活饮用 水,药品,化妆品等产品国家 标准规定细菌总数测定用培 养基,食品卫生微生物检验国家标准2008版颁布前.
一
直采用营养琼脂测定食品中菌落总数目前.许多
食品企,I自检时仍然沿用营养琼脂同时.营养琼脂
中不含乳酸菌能够利用的碳源.活性乳酸菌制品应用 的乳酸菌在其卜不能生长.因此营养琼脂可以做为活 性乳酸菌制品的菌落总数测定用基
利用倾注法测定污染菌总数时.低稀释度的检样 中会带入一部分产品中的营养成分.(下转第59页) 一,b2010年第3卷第4期(总第2一{j期)
InspectionMethods测定方法
表2B一胡萝卜素的不确定度
描述数值x萎评述
成为
【,(/p=-_V(0.021/1)+(0.034/1)+(0.005)=0.040,
扩展不确定度U(Pop)是合成不确定度乘以包含因 子2得至
U(P)/P=0.04(IX2=0.080. 实验室在95%置信水平下测定的不确定度的包含 因子k=2,因此扩展不确定度【)=O.080P. 3结论
建立果蔬等植物及其果实中一胡萝卜素的HPLC 检测方法.将样品先粉碎或打浆,萃取,用HPLc测定口一 胡萝卜素的质量分数.最低检测限为(2.85×10-6)g,回 收率为95.4%~99.2%,扩展不确定度为Ul=0.08. 该分析方法前处理简单.回收率高.线性关系和检 出限都比较理想.能够同时对目标化合物进行定性和 定量检测.分析时间仪5rain就出峰.而且没有其他物质 干扰,大大缩短了分析时间.提高了检测效率因此可 以广泛用于果蔬等植物中一胡萝卜素的检测 参考文献
[1】郑建仙功能性食品[M】北京:中国轻工业出版社,1997.
[21李明元.高效液相色谱法及其在食品分析中的应用【M】.北京:北京大
学出版社.1998
(上接第56页)
培养时乳酸菌会利用检样中带入的营养物质生长.干 扰污染菌的正确计数.实验中发现.样品稀释到10稀 释度时仍有少量的乳酸菌生长
滤膜法可以有效消除样品成分对检验结果的影 响.采用滤膜法并在过滤后冲洗滤膜,可以充分去除 样品中的营养成分.避免乳酸菌的生长对污染菌计数 的干扰.微生物检验中滤膜法通常采用0.45m孔径 滤膜实验证明.稀释10倍的样液过滤冲洗后.可以完 全消除样品中营养成分的影响.乳酸菌不能生长. 稀释10倍,100倍的低稀释度样液过滤后会在滤 过膜上残留非脂乳固形物影响结果的观察.在营养琼 脂中添加2.5mg/100mL的TTc不会影响细菌的生长, 同时使菌落颜色变红.便于结果观察和计数.实验证 明.稀释至1O倍的样液可以准确检测其中的污染菌. 本研究方法以普遍使用的营养琼脂作为污染菌 总数计数培养基,无需另行研发新的培养基;采用滤 膜法消除了样品中营养成分的影响,检测灵敏度高; 37?,有氧培养符合通常菌落总数的定义.同时,有氧 培养抑制了样品中双歧杆菌的生长.因此,本方法能够 准确,快速对活性乳酸菌制品的卫生状况进行检验. 参考文献:
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指南[S1.北京:中国标准出版社,2000. f21赵建新,田丰伟,陈卫,等.酸奶中嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌检测方法
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[4]ISO13559:2002(E).Butter,FermentedMilksandFreshCheese—Enu—
merationofContaminatingMicroorgamsms—Colony——countTechnique
at30
夕