人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较（可编辑）

人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较（可编辑） 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比 较 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性 状的比较 分类号: 密 级: 学 号:2009109020单位代码:10759 石河子大学 硕 士 学 位 论 文人胎盘、 脐带及 骨髓源性 间充质干 细胞生物学性 状的比较 学位申请人 冶 娟 慕晓玲 教授 指导教 师 申请学位门类级别 医 学 硕 士 学 科 、 专 业 名 称 人 体 解 剖 与 组 织 胚 胎 学 研究方向 干 细 胞 的 基 础 与 应 用 研 究 所在学院 医 学 院中国〃 新疆〃 石河子2012 年 5 月 1 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 Comparing the biological characteristics of mesenchymal stem cells derived from human placenta, umbilical cord and bone marrowA Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree ofMaster of MedicineBy Ye Juan Human anatomy, Histology and EmbryologyDissertation Supervisor: Prof. Mu Xiao-lingMay, 2012 2 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本 人 所 呈 交的 学 位 论 文是 在 我 导 师的 指 导 下 进行 的 研 究 工作 及 取 得 的研 究 成 果 。据 我 所 知 , 除 文中已经注明引用的内容外 , 本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体,均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名: 时间:年 月 日 使用授权声明 本 人 完 全 了解 石 河 子 大学 有 关 保 留、 使 用 学 位论 文 的 规 定, 学 校 有 权保 留 学 位 论 文 并 向 国 家 主 管 部 门 或 指定 机 构 送 交论 文 的 电 子版 和 纸 质 版。 有 权 将 学位 论 文 在 学校 图 书 馆 保存 并 允 许 被查 阅 。 有 权 自 行 或许 可 他 人 将学 位 论 文 编入 有 关 数 据库 提 供 检 索服 务 。 有 权将 学 位 论 文的 标 和 摘要 汇 编 出版。保密的学位论文在解密后适用本。 研究生签名: 时间:年 月 日 导师签名:时间:年 月 日 3 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 目 录 中文摘要? 英文摘要? 英文缩略语表 ? 前言??1 材料与方法??3 1 材料3 2 实验方法?7 3 统计方法12 结果13 1 人胎盘、脐带及骨髓源性基质 细胞的培养 13 2 人胎盘、 脐带及骨髓源性基质 细胞表面抗原14 NTR 3 人胎盘、脐带及骨髓源性基质 细胞中Nestin、MRP 、ABCG 、P75 1 2 的表达15 4 人胎盘、脐带及骨髓源性基质 细胞的细胞周期??17 5 人胎盘、脐带及骨髓源性基质 细胞的 增殖情况?18 6 人胎盘、脐带及骨髓源性基质 细胞向脂肪细胞诱导后油红O 染色结果??19 7 人胎盘、脐带及骨髓源性基质 细胞向成骨细胞诱导后茜素红染色 结果20 8 人胎盘、 脐带及骨髓源性基质细胞 向神经细胞诱导后鉴定结果21 讨论23 结论28 参考文献??29 综述33 致谢40 作者简历??41 导师评语??42 4 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 摘 要 目 的: 比较 人胎盘、脐带及骨髓源性 间充质干细胞(MSCs ) 的生物学性状 方 法: 采用组织块贴壁 培养法分离 培养人胎盘 、脐带源性 基质细胞(SCs ),采用 密 度梯度离 心 法 分离培养人骨髓源性 SC 。采 用流式细胞仪检测 CD29 、CD34 、CD44 、CD133 、HLA-DR 、vWF 的 表 达 及 细 胞 周 期 。 应用 MTT 法检测并比较三种 SCs 的 增殖情况 。 应 用 免 疫 荧 光 技 术 检 测 并 比 较 NTR MRP 、ABCG 、P75 及 Nestin 在 三种 SCs 的表达情况; 在体外诱导三种 SCs 向成骨细胞、脂肪 1 2 细胞、神经细胞方向分化,并通过特异性染色鉴定并比较其分化能力。 结 果: 采用 组织块贴壁法能成功获得贴壁生长的成纤维样人胎盘、 脐带源性 SCs , 采用 密度梯度离 心 法能成功获得贴壁生长的骨髓源性 SCs ;流式细胞术结果示,人胎盘、脐带 及骨髓源性 SCs 高表达 CD29、CD44 ,阴 性表达 CD34 、CD133 、HLA-DR 及 vWF ,细胞周期结果示, 三种 SCs 大 部分 均处于 G0/G1 期, 仅 少数处于分裂期, 但 脐带 源性 SCs 处于 G0/G1 期细胞 最多,而处于 S 期细 NTR 胞 最少,处于 G2M 期细 胞介于胎盘及骨髓源性 SCs 之间;免疫荧光示 MRP 、ABCG 、P75 及 1 2 Nestin 在三种 SCs 中表达情况相似, 即 均为阳性表达, 且荧光定位在细胞的胞浆 ;MTT 检测 结果 显 示, 胎盘与脐带源性 SCs 增殖较快, 两者增殖速率无差异 。 三 种 SCs 经向脂 肪细胞诱导后油红 O 染 色阳性, 但脐带源性 SCs 分化为脂肪细胞的数量多, 着色深 ; 向成骨细胞诱导后茜素红染色为阳性, 向神经细胞诱导后,NSE 表达阳性, 但胎盘源性 SCs 分化为 成骨细胞及神经细胞的 数量多, 着色深。 结 论 : (1 )人胎盘、脐带 组织中富含间充质干细胞。(2 )人胎盘、脐带 与 骨髓源性MSCs 均表达 NTR NTR MRP 、ABCG 、P75 及Nestin , 但 骨髓源性MSCs 中P75 的表达较弱。 (3 )人胎 盘及 脐带源性 1 2 MSCs 具有更强的增殖能力。 (4 )人 胎盘、脐带 及骨髓源性MSCs 分化为特定细胞的潜能不同 。 关键词: 胎 盘;脐带;骨髓; 间充质干细胞;分化 论 文 类 型:A (基础研究) 5 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 Abstract Objective: Comparing the biological characteristics of mesenchymal stem cells MSCs derived from human placenta, umbilical cord and bone marrowMethods: The stroma cells SCs derived from human umbilical cord and placenta were isolated by tissue adherence and so did bone marrow by density gradient centrifuge, respectively. The CD29, CD34, CD44, CD133, HLA-DR, vWF and cell cycle of the three kinds of SCs were detected by flow cytometry, NTR respectively, and the MRP , ABCG , P75 , Nestin of them were detected by immunofluorescence, 1 2 respectively. The proliferation ability of them were analysed by MTT and then, they were induced to differentiation into adipocytes, osteocytes and nerve cells, respectivelyResults: The SCs derived from placenta and umbilical cord and bone marrow could be cultured and proliferated in vitro, respectively. Flow cytometry analysis revealed that the three kinds of the SCs expressed CD29 and CD44, while CD34, CD133, HLA-DR and vWF were negative. Most of them were in the G0/G1 phase and only a small proportion of cells in the mitosis. In G0/G1 phase, the number of umbilical cord-derived SCs was more than that of SCs either derived from the placenta or bone marrowWhile in S phase, the number of umbilical cord-derived SCs was less than that of SCs either from the placenta or from the bone marrow. In G2M phase, however, the number of umbilical cord-derived SCs was in between the number of SCs from the placenta and the number of SCs from the bone marrow. The NTR immunofluorescence showed that the three kinds of the SCs all expressed MRP , ABCG , P75 and 1 2 Nestin, and fluorescence located in the cytoplasm of cells. According to MTT results, the SCs derived from umbilical cord and placenta have stronger proliferation ability than that from bone marrow, and umbilical cord and placenta have the same proliferation ability. After induction, the SCs become to be stained by oil red O and alizarin red S and express NSE, respectively, and the adipocytes differentiated from SCs derived from umbilical cord were more in cell numbers and stronger in staining than that derived from placenta and bone marrow, and as SCs derived from placenta did in differentiation into osteocytes and nerve cellsConclusion: 1 Human placenta and umbilical cord does contain MSCs. 2 The MSCs derived from NTR NTR umbilical cord, placenta and bone marrow all express MRP , ABCG , P75 and Nestin, but P75 is 1 2 weakerly expressed in bone marrow-drived MSCs. 3 The MSCs derived from umbilical cord and placenta have stronger proliferation ability. 4 The differentiated potential to specific cell is different in the three kinds of MSCsK e y Wo r ds : p l a c e n t a ; u mb i l i c a l c o rd ; me se n c h y ma l st e m c e l l s; d i ff e r e n t i a t i o n Type of thesis: A Basic Research 6 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 缩略语 表 中文译名 英文缩写 英文全名 间充质干细胞 Mesenchymal Stem Cells MSCs 基质细胞 SC Stroma Cell 胎牛血清 FBS Fetal bovine serm 磷酸二氢盐缓冲液 PBS Phosphant-balanced solution DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium 改良Eagle 培养基 EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸 二甲基亚砜 DMSO Dimethyl Sulfoxide 多药耐药相关蛋白 1 MRP Multidrug Resistanec-Associated Protein 1 1 乳腺癌耐药相关蛋白 ABCG Breast Cancer Resistance Protein 2 NTR P75 神经营养素受体 P75 P75 neurotrophin receptor 血管假性血友病因子 vWF Von Willebrand Factor 神经元特异性烯醇化酶 NSE Neuron Specific Enolasen bFGF Basic Fibroblast Growth Factor 重组人碱性成纤维细胞生长因子 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 IBMX 3-Isobutyl-1-Methylxanthine 二丁酰环腺苷酸 dbcAMP Dibutyryl cyclic AMP 神经生长因子 NGF Nerve Growth Factor 激光共聚焦显微镜 LSCM Laser sanning confocal microscope 每分钟转速 rpm Round per minute7 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 前 言 introduction 随着再生医学的兴起, 细胞疗法正在不断发展, 干细胞stem cell 已成为细胞治疗领 域的研究热点。 干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞, 虽然胚胎干细胞在再生医学中是 较 全能的干细胞类型, 但由于 胚胎干细胞 的研究 涉及伦理问题, 缺乏对其特定分化调节 的 研究 ,并广泛报道具有致瘤性等 , 促使研究人员开发和利用成体干细胞 。 间充质干细胞 (mesenchymal stem cell ,MSCs)是成体干细胞中较为常见的 类型之 一, 这种细胞 来源于发育早期中胚层, 是一种 具有高度自我更新能力和多向分化潜能的 多能干细胞 , 在特定的诱导条件下可以分化为成骨、 软骨、 脂肪、 神 经、 胰岛样等多种 [1,2] 类型细胞 。 间充质干细胞最初由 Friedenstein 从骨髓中分离出来, 但成人骨髓中的 间 充质干细胞 含量较低, 且在严重感染、 骨髓恶性肿瘤的情况下, 或随着年龄增长其细胞 [3] 数量和 增殖 、分化能力出现明显下降趋势 , 因此寻找新来源的 间充质干细胞 在再生医 学方面尤为必要。 近年来, 随着人们对成体干细胞生物学特性及功能的深入研究, 已成 [4] 功地从 脑、心脏、肺、肾、脾、牙髓及脐带、胎盘 等 多 种组织中 分离并签定出间充质 干细胞 。 脐带和胎盘在胚胎发生过程中发挥着重要作用, 胎盘是胎儿与母体之间进行物质交 换的重要器官, 是胚胎 的丛密绒毛膜 和母体子宫 底蜕膜的联合体, 是由 滋养层细胞及大 量起源于胚外中胚层的血管和间充质共同组成 。 脐带是连于胚胎脐部与胎盘之间的索状 结构, 内含来自胚外中胚层的胶样结缔组织, 脐血管的一端与胚胎血管相连, 另一端与 胎盘绒毛血管续连。血管周围被胶样结缔组织所包裹,即沃顿胶Wharton’s jelly ,WJ 。 在胎儿出生后, 脐带与胎盘即作为废物被丢弃。 近年的研究发现, 从人脐带、 胎盘组 织 [5] 分离培养的 间充质 干细胞具有更强的自我更新、高度增殖和多向分化潜能 ,而 标本来 源更方便、不涉及伦理问题, 已成为寻找人类 间充质干细胞新来源的研究热点 。 间充质干细胞是一种异质细胞群, 至今未发现其特异性标记物, 一般认为表达的抗 [6] 原标记 有: SH2/CD105 、 SH3/CD73 、 CD29、 CD44 、 CD71 、 CD90/Thy21 、 CD106 、 CD120a 、 [7] CD124 及HLA-ABC , 还表达一些细胞因子受体 如白细 胞介素类受体、 血小板衍生生长 因子受体、 细胞间黏附分子1及细胞外基质 , 表达胚胎干细胞标记, 如SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, 也表达 白细胞介素类、Flt-3 配体、 白细胞抑制因子、 单核细胞集落刺激因子 [8] [9] 等 , 而不 表达其他造血细胞系的表面标记 ,如CD11b 、CD45 、CD14 、CD34 、CD31 及内皮细胞标记 。但这些抗原均具有间质细胞特征,无特异性。 NTR MRP 、ABCG 、P75 及 Nestin 都为干细胞的标记物, 但这些标记物在人胎盘、 1 2 脐带 及骨髓 源性间充质干细胞中的表达鲜有报道。 本研究通过原代分离培养胎盘 、 脐带 及骨髓 源性 基质细胞, 并 选取一些有代表性的 “ 干”性蛋白, 应用流式细胞仪及荧光免 疫 细胞 化学技术检测其在人脐带、 胎盘 及骨髓源性基质细胞中的表达情况, 并通过细胞 周期 、 细胞增殖情况 及向脂肪细胞、 成骨细胞及神经细胞分化方面, 比较胎盘、 脐带 及 8 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 骨髓 来源 的间充质干细胞之间是否存在异同 。 9 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 材料和 方法 Materials & Methods 1 材料 1.1 胎 盘、 脐带 、骨 髓 取自新疆农八师人民医院妇产科足月剖宫产健康产妇,均知情同意 1.2 主 要试 剂 (1) DMEM 培养基 Gibco 公司 (2) 胎牛血清 Hyclone 公司 (3) 磷酸盐缓冲液(PBS ) 美国 Sigma 公司 (4) 胰蛋白酶+EDTA 消化液 Solarbo 公司 (5) 二甲基亚砜(DMSO ) 美国 Sigma 公司 (6) MRP 鼠抗人单克隆抗体 Abcam 公司 1 (7) ABCG 鼠抗人单克隆抗体 Abcam 公司 2 NTR (8) P75 兔抗人多 克隆抗体 Millipore 公司 (9) Nestin 鼠抗人单克隆抗体 Abcam 公司 (10)vWF 鼠抗人单克隆抗体 Santa 公司 (11 )CD133 兔抗人多克隆抗体 Abcam 公司 (12)NSE 鼠抗人单克隆抗体 Abcam 公司 (13)CD29-FITC 抗体 eBioscience 公司 (14)CD34-FITC 抗体 eBioscience 公司 (15)CD44-FITC 抗体 eBioscience 公司 (16)HLA-DR-FITC 抗体 eBioscience 公司 (17)山羊 IgG 荧光二抗 北京博奥森生物技术有限公司 (18)PI 染液(碘化丙啶) 美国 Sigma 公司 (19)RNA 酶 上海生物有限公司 (20)二甲苯、无水乙醇 上海生物工程有限公司 (21)SP 三步法试剂盒 北京中杉金桥生物有限公司 (22)bFGF Gibco 公司 (23)IBMX 美国 Sigma 公司 (24)胰岛素 美国 Sigma 公司 (25)地塞米松 美国 Sigma 公司 (26)吲哚美辛 美国 Sigma 公司10 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 (27)β- 甘 油磷酸钠 美国 Sigma 公司 (28)抗坏血酸 美国 Sigma 公司 (29)dbcAMP 美国 Sigma 公司 (30)NGF PeproTech Asia 公司 (31)茜素红-S 美国 Sigma 公司 (32)四甲基偶氮唑盐MTT 美国 Sigma 公司 1.3 主 要仪 器设备 (1) 37?、5% CO 细胞培养箱 美国 Thermo 公司 2 (2) 生物安全柜 美国 Thermo 公司 (3) AB204-E 电子天平 MonoBloc 公司 (4) Milli-Q Acdemic 超纯水仪 美国 Millipore 公司 (5) LX-100 手掌型离心机 江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司 (6) TDL-40B 台式离心机 上海安亭科学仪器有限公司 (7) 791 型磁力加热搅拌器 上海南江电讯器械有限公司 (8) -20? 冰箱 上海海尔公司 (9) SHH.W21 恒温 水浴箱 北京光明医疗器械厂 (10)SANYO 低温冰 箱 日本 SANYO 公司 (11)普通光学显微镜 OLYM-PUS 日本 Olympus optical 公司 (12)CHK Olympus 倒置显微镜 日本 Olympus optical 公司 (13)LSM-510 激光共聚焦显微镜 德国 Carl Zeiss 公司 (14)流式细胞仪 PAS 系统 德国 Partec 公司 (15)HVE-50 高压锅 Hirayama Manufacturing corporation (16)SFB-02B 电热恒温鼓风干燥箱 湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司 (17)液氮罐 YDS-30-125 乐山市东亚机电厂 (18)可调量程移液枪 德国 Eppendoff 公司 (19)MPM 6 酶标仪 美国 Bio-Rad 公司 1.4 实 验耗 材 (1 )0.22μm 的微孔滤 器 (2)一次性注射器 (3)6 孔板,96 孔板,培养瓶,离心管 (4)盖玻片,载玻片 (5)各种量度 Tip 头 (6)Eppendoff 管(0.5,1.5,2.0ml ),冻存 管。 1.5 主 要试 剂配制11 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 1.5.1 低糖 DMEM 培养基 (1) 将干粉型低糖培养基倒入大烧杯中 ,加入 900ml 的双蒸水 ,并 用水冲洗包装袋, 保证干粉冲洗干净, 将大烧杯放在磁力搅拌器上充分搅拌, 确保培养基干粉充分 溶解; (2) 加入 2.2g 碳 酸氢钠(NaHCO ) , 继续搅拌,完全溶解后,调整 pH 在 7.2-7.4 之 3 间; (3) 继续加入双蒸水,大烧杯定溶至 1000ml; (4) 0.22μm 一次性 无菌滤器 过滤 , 将培养 基分装于无菌的储液瓶内, 并密封 保存于 4?冰箱备用。 1.5.2 PBS 缓冲液 (1) 将干粉型 PBS 倒入大烧杯中,加入 900ml 的双蒸水,并冲洗包装袋,以保证粉 末冲洗干净,将大烧杯放在磁力搅拌器上充分搅拌至粉末完全溶解 ; (2 ) 继续加入双蒸水,大烧杯定溶至 1000ml; (3 ) 分 装 于 无 菌 储 液 瓶 中 , 并 定 容 总 体 积 至 2000ml , 高 压 蒸 汽 灭 菌 (101.3KPa , 121.3 ?) ,密封保存于 4? 冰箱备用。 1.5.3 双抗 (青霉素、链霉素液)配制 (1 ) 吸取 5mlPBS 注入 100 万 单位的 硫酸链霉素瓶中,反复晃动,充分溶解 ; (2 ) 吸取 4ml 溶 解的硫酸链霉素溶液注入 80 万单位的青霉素瓶 中,反复晃动,充分 溶解,制成青霉素、链霉素各 20 万单位的母液; (3 ) 用 0.22μm 一次 性无菌滤器滤过细菌,分装,-20 ?保存备用。 1.5.4 细胞 冻存液 在低糖 DMEM 基础培养液中加入 FBS 和 DMSO,使 DMSO 的终浓度为 10% ,FBS 的终浓度为 40 %,现用现配。 1.5.5 MTT 溶液制备 (1) 称取 100mgMTT ,放入小烧杯中; (2 ) 加 20mlPBS (pH7.4 ) ,磁力搅拌机上充分搅拌 30min ; (3 ) 用 0.22μm 的微 孔滤器除菌,分装,-20 ?避光保存。 1.5.6 油红 O 配制 (1) 电子天平称取油红 O 粉末 0.35g; (2 ) 将油红 O 粉末倒入 100ml 异丙醇中,搅拌使其充分溶解; (3 ) 搅拌 后 静置 6h, 滤出 90ml 上清, 然 后将其放入 60ml 的双蒸水中, 搅拌混匀后, 静置 2h; (4) 用 0.22μm 一次 性无菌滤器 过滤,放 4?避光保存。 1.5.7 茜素红配制 (1) 称取 0.6057gTris 粉末, 溶于 95ml 的双蒸水,搅拌至充分溶解; (2 ) 用 HCL 调节 PH 至 8.2,定容至 100ml ,使 Tris-HCL 的终 浓度为 0.05mol/L ;12 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 (3) 称取 0.1g 茜素红粉末, 溶于 100ml 的 0.05mol/LTris-HCL 溶液中, 使其终浓度为 1mg/ml ,搅拌至充分溶解; (4) 用 0.22μm 一次 性无菌滤器过滤,放 4?避光保存。 1.5.8 成脂 肪 细胞诱导剂配制 胰岛素干粉 : (1) 将 10mg 胰岛素 干粉加入到 5ml pH2.0 的盐酸溶液内,混匀,充分溶解后,所得 溶液浓度为 2mg/ml ; (2) 用 0.22μm 一次 性无菌滤器 过滤; (3 ) 分为 20 份,每份 0.25ml 含 0.5mg 胰岛素,分装在 EP 管里,保存在-20?; (4 ) 取 2 份即 1mg 加入到 100 毫升培养基里,终浓度为 10μg/ml 。 非水溶性地塞米松干粉 :6 r C* E4 m! (1) 电子天平称取 3.925mg 非水溶性地塞米松干粉,溶于 5ml 无水乙醇中,混匀后 浓度为 0.785mg /ml 即 2mmol/L ; (2 ) 用 0.22μm 一次 性无菌滤器过滤; (3 ) 分为 100 份,每份 50 微升含 0.03925mg 地塞米松 ,分装 20 份 在 EP 管里(余下 的使用前再分装) ,保存在-20?; (4 ) 取 1 份即 0.03925mg 加入 到 100 毫升培养基,即终浓度为 1mol/L。 3- 异丁基-1- 甲基黄嘌呤(IBMX ) 干粉 : (1) 100mgIBMX 干粉 溶于 2.7ml DMSO 中,浓度为 37mg/ml ; (2 ) 用 0.22μm 一次 性无菌滤器过滤; (3 ) 分为 18 份,每份为 150 微升含 5.55mgIBMX , 分装在 EP 管里,保存在-20?; (4 ) 取 2 份即 11.1mg 加入到 100 毫升培养基中,终浓度为 0.5mmol/L 。 吲哚美辛干粉: (1 ) 电子天平称取吲哚美辛干粉 71.558mg , 充分溶于 1ml DMSO 中, 浓 度为 71.558mg /ml ; (2) 用 0.22μm 一次 性无菌滤器过滤; (3 ) 分为 10 份, 每份为 100 微升含 7.1558mg 吲哚美 辛 , 分装在 EP 管里, 保存在-20? ; (4 ) 取 1 份即 7.1558 加入到 100 毫升培养基中,终浓度为 200μmol/L 。 1.5.9 成骨细胞诱导剂配制 β- 甘油磷酸 钠干粉 : (1) 电子天平称取 β- 甘油磷 酸钠干粉 3.06g, 充分溶于 10ml ddH O 中, 浓度为 0.36g 2 /ml ; (2 ) 用 0.22μm 一次 性无菌滤器过滤; (3 ) 分为 10 份,每份为 1ml 含 0.36gβ- 甘油磷酸钠,分装在 EP 管里,保存在-20?; (4 ) 取 1 份即 0.36g 加入到 100 毫升培养基中,终浓度为 10mmol/L 。 抗坏血酸:13 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 (1) 取 1ml 双蒸水 加入到 10mg 的抗坏血酸中,充分溶解,浓度为 10mg/ml ; (2 ) 用 0.22μm 一次 性无菌滤器过滤; (3 ) 取 88μl 即 0.88mg 加入到 100 毫升培 养基中 ,终浓度为 0.05 mmol/L ,剩余液体 保存在 4?。 非水溶性地塞米松干粉:取配好的浓度为 2mmol/L 地塞米松 0.5μl ,加入到 100 毫升培 养基中,终浓度为 100 nmol/L 。 1.5.10 成神经细胞诱导剂配制 双丁酰环磷腺苷(dbcAMP ): (1) 电子天平称取双丁酰环磷腺苷 23.47mg , 充分溶于 1ml 双蒸水 中, 浓度为 23.47g /ml ; (2 ) 用 0.22μm 一次 性无菌滤器过滤; (3 ) 取 1ml 双丁酰 环磷腺苷溶液 加入到 50 毫升培养基中,终浓度为 1mmol/L 。 胰岛素: 取配好的浓度为 2mg/ml 的胰岛素 0.0625ml , 溶于 50 毫升培养基中, 终浓度为 2.5μg/ml 。 IBMX:取 1 份浓度为 37mg/ml 的 IBMX 加入到 50 毫升培养基中, 终浓度为 0.5mmol/L 。 神经生长因子 (NGF ) : 取 5mg/ml 的 NGF250μl , 溶于 50 毫升培养基中, 终浓度为 25ng/ml 。 重组人碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF):取 10mg/ml 的 bFGF20μl , 溶于 100 毫升培 养基中,终浓度为 20ng/ml 。 2 方 法 2.1 细 胞原 代分离培 养 2.1.1 脐带源性基质细胞分离培养 从手术台取健康足月产婴儿脐带组织置于 LG-DMEM 培 养基中,4 ?保存。在超净 工作台内取出脐带, 用 PBS 缓冲液 充分清洗残留的血液, 剔除动静脉血管, 取脐带基质, 将其剪碎至 1mm×1mm×1mm 大小的组织块, 接种于含 10%FBS 的 低糖 DMEM 培养基, 置于 37 ?、5% CO 细胞培养箱内培养,4-6d 后首次半量换液,以后每 3-4d 换液一次。 2 培养 12-14d 后去除组织块。细胞达 80% 融合 时,用 0.25% 胰蛋白酶(含 0.02%EDTA ) 消化 2min , 显微镜下观察大部分细胞收缩变圆、 悬浮后加入含 10% FBS 低糖 DMEM 培 养液终止消化, 以 1000rpm 离心 5min 后, 弃 上清; 加低糖 DMEM 培养液吹打至单细胞 4 5 悬液,调整细 胞浓度,以 10 -10 /ml 的密度 接种于新的培养瓶,2 天后换液。 2.1.2 胎盘源性 基质细胞分离培养 从手术台取健康足月产婴儿胎盘组织置于 低糖 DMEM 培养基中,4?保存。 在超净 工作台内取出胎盘, 剥除羊膜, 取胎儿面胎盘组织, 用 PBS 缓冲液 充分清洗残留的血液, 将其剪碎至 1mm×1mm×1mm 大小的组织块,接种于培养瓶内,置于 37 ? 、5% CO 细 2 胞培养箱内静置 2 小 时后,加入含 10%FBS 的 LG-DMEM 培养基放入培养箱内继续培 养, 4d 后首次半量换液, 以后每 3-4d 换液一次。 培养 14-16d 后去除组织块。 细胞 达 80% 14 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 融合时,用 0.25% 胰蛋白酶(含 0.02%EDTA )消 化 2min ,显微镜下观察大部分细胞收 缩变圆、悬浮后加入含 10% FBS 低糖 DMEM 培养液终止消化,以 1000rpm 离心 5min 4 5 后,弃上清;加低糖 DMEM 培养液吹打至单细胞悬液,调整细胞浓度,以 10 -10 /ml 的密度接种于新的培养瓶,2 天后换液 。 2.1.3 骨髓源性基质细胞分离培养 无 菌 取 骨 髓 放 入 含 有 肝 素 钠 的 瓶 中 ,4 ? 保 存 。 在 超 净 台 内 将 骨 髓 移 入 离 心 管 中 , 以 1000rpm 离心 5min 后, 去除脂肪滴及上清, 加入少量 PBS 缓 冲液混匀后将其移入预 先加 入 Percoll 细胞分 离液(1.073g/ml )的 离心管中,以 2000rpm 离心 20min 后,轻 轻 吸出中间白色浑浊层, 放入另一个离心管中, 加入 PBS 缓冲液, 以 1000rpm 离心 5min , 共洗两次,弃 PBS ,加 入含 10% FBS 低糖 DMEM 培养液,置于 37?、5% CO 细胞培 2 养箱内培养,2 天后 半量换液。 2.1.4 胎盘、脐带及骨髓源性基质 细胞的传代 (1)显微镜下观察细胞密度达 90% 左右时,即可传代; (2 )取出培养瓶,倒掉瓶内旧培养基,PBS 缓冲液冲洗 2 遍; (3 ) 用0.25% 的 胰 蛋 白 酶 ( 含0.02 %EDTA )消化液消化2min ,镜下观察细胞呈圆形, 悬浮,85% 的 细 胞 消 化 下 来 , 可 以 终 止 消 化 , 加入含10% FBS 低糖DMEM 培养 基 终止消化; (4)离心,把细胞从细胞培养瓶内移到离心管, 以 1000 转、离心 5min ; (5 )取出离心管,弃上清,加入 新鲜 含 10% FBS 低糖 DMEM 培 养基, 吹打成单细胞 悬液,移入两个新的培养瓶 。 2.1.5 胎盘、脐带及骨髓源性基质 细胞的冻存 (1) 配冻存液, 培养基、 血清、 DMSO 按 5: 4: 1 的 比例 配好后 , 放入 4?冰箱 20min ; (2 ) 取细胞,PBS 冲洗 2 遍,加 0.25% 胰蛋白酶(含 0.02%EDTA )消 化 2min ; (3 ) 离心,1000rpm ,5min ; (4) 弃上清,加冻存液吹打成单 细胞悬液 ; (5) 分装于冻存管中; (6 ) 放入 加 入 异 丙 醇 的 冻 存 盒 中 , 然 后 移 入-80 ? 冰 箱 过 夜 , 次 日 放 入 液 氮 罐 , 长 期 保存。 2.1.6 胎盘、脐带及骨髓源性基质 细胞的复苏 (1) 超净台紫外线消毒 30min ,蒸馏水加热至 37?至 40?; (2 ) 从液氮罐中取一冻存管细胞,快速放进 加 热的水中摇动,使其快速溶解; (3 ) 将冻存管中的细胞悬液移入离心管,离心 1000rpm ,5min ; (4 ) 弃上清, 加入含 10% FBS 的低糖 DMEM 培养液, 吹打成单细胞悬液, 移入培养 瓶; (5) 将培养瓶放入 37?、5% CO 细胞培养箱,次日观察细胞生长情况。 2 2.2 HE 染 色检测胎 盘 、 脐带 及骨髓源性基质细 胞的形态15 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 2.2.1 制片 (1)将洗净、干燥的盖玻片浸泡在 75% 酒精浸泡 24h,过火烤干后 放入 6 孔板内,备 用; (2)用 0.25% 的胰蛋白酶 (含 0.02 %EDTA ) 消化液将胎盘、 脐带 及骨髓 源性间充质 干 细胞 消化 2min , 镜下观 察细胞呈圆形, 悬浮, 85% 的细胞消化下来, 加入含 10% FBS 低糖 DMEM 培养 基终止消化; (3)离心,把细胞从细胞培养瓶内移到离心管, 以 1000 rpm 、离 心 5min ; 4 5 (4 )取出离心管,弃上清,加入新鲜 含 10% FBS 低糖 DMEM 培养基, 以 10 -10 /ml 的密度接种于放有盖玻片的 6 孔板内,37?、5%CO 孵育 48h 。 2 2.2.2 HE 染 色步骤 (1 )滴加苏木素染液,室温下 5-8min ,自来水充分冲洗 ; (2 )酸酒精分化数秒,自来水充分冲洗 ; (3)伊红复染 3-5min ,自来水冲洗 ; (4 )梯度酒精脱水,二甲苯脱脂 ; (5)中性树胶封片。 2.3 流 式细 胞仪检测 细胞表面 抗原 (1 ) 收 集 细 胞 : 分 别 取 第3 代胎盘 、 脐带 及 骨 髓 源性 基质 细胞,用0.25% 胰蛋白酶(含 0.02%EDTA)消化2min , 显微镜下观察大部分细胞收缩变圆、悬浮后加入含10% FBS 低糖DMEM 培养液终止消化,以1000转、离心5min 后,弃上清; (2 ) 细胞清洗: 用PBS 缓冲液 冲洗细胞2次,1000rpm , 离心5min , 加入PBS 缓冲液,吹 6 打均匀,制成1×10 /ml 的 单细胞悬液; (3 ) 直 接 标 记 的 抗 体 孵 育 : 分 别 加 入FITC 标记的抗人CD29 、CD34 、CD44 、HLA-DR 单克隆抗体,4?孵育30min ; (4 ) 间 接 标 记 的 抗 体 孵 育 : 分 别 加 入 鼠 抗人vWF 单 克 隆 抗 体 、 兔 抗 人CD133 多 克 隆 抗 体,4? 孵育30min 后 , 分别 加入 荧 光 标 记 的 山 羊 抗 鼠 、 山 羊 抗 兔 二 抗 , 室温孵育 30min ; (5)上机:检测前每管加入2ml PBS 缓冲液 ,流式细胞仪检测。 NTR 2.4 细 胞免 疫荧光检 测MRP 、ABCG 、P75 及Nestin 在 人胎盘、 脐带 及骨 1 2 髓 源性基质 细胞中的 表达 (1 )制片:将洗净、干燥的盖玻片浸泡在 75% 酒精浸泡 24h,过火烤干后放入 6 孔板 内,备用; (2) 细胞爬片: 分别取第 3 代胎盘 、 脐带及骨髓源性基质细胞, 用 0.25% 胰蛋白酶 (含 0.02%EDTA )消化液消化单层培养细胞,用含 10%FBS 的低糖 DMEM 培养 基重 3 悬细胞, 以密度为 8×10 个/mL , 将细胞悬液均匀接种于六孔培养板 (内置预先处 16 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 理过的盖玻片)中,置于 37? 、5%CO 培养 箱中培养 24h ; 2 (3 ) 细胞固定: 取出盖玻片,PBS 液冲洗 2 次, 置于 4% 多聚甲醛固定液 中 , 室温下静 置固定 15min,蒸馏水冲洗 3 次,以下操作均在湿盒中进行 ; (4 ) 灭活内源性过氧化物酶:30%H O 与纯甲醇以 1:50 比例混合, 室温浸泡 30min , 2 2 蒸馏水冲洗 3 次 ; (5)滴加山羊血清,室温封闭 20min ,甩去多余液体,不冲洗; (6 )滴加稀释后的一抗,均匀铺在 盖 玻片上,置于湿盒内,放置 4 ?冰箱过夜; (7 )PBS 缓冲液冲洗 3min×3 次 , 滴加 稀释后的荧光二抗,室温 2h,PBS 冲洗干净, 甘油封片 ; (8)激光共聚焦显微镜下观察荧光强度及着色部位。 2.5 流 式细 胞仪检测 细胞周期 (1 ) 细胞收集: 分别取第 3 代胎盘 、 脐带及骨髓源性基质细胞, 用 0.25% 胰蛋白酶 (含 0.02%EDTA ) 消 化 液 消 化 生 长 密 度 达 90% 左右的细胞,用含 10%FBS 的低糖 DMEM 培养基终止消化,1000rpm/min , 离 心 5min , 弃去培养液, 用 PBS 缓冲液 6 冲洗 2 次,1000rpm/min ,离心 5min,收集 1-3×10 /ml 细胞; (2 ) 细 胞固 定 : 缓 缓加 入 70% 的 酒 精 ( 提前-20 ? 预冷 ) 固 定 细胞 ,4? 过夜 , 一 般至 少 18h; (3 ) 去 除 酒 精 :1000 rpm/min , 离 心 5min , 除 去 酒 精 ,PBS 缓 冲 液 冲 洗 2 次, 1000rpm/min ,离心 5min ,加入 500μl PBS 重 悬细胞,轻轻吹打 均匀; (4 )去除 RNA :加 入 10mg/ml 的 RNA 酶 2.5μl ,37?孵育 30min ; (5 )染色:加入 1mg/ml 的 PI 染液 25μl ,4?孵育 30min; (6 )上机:检测前每管加入 2ml PBS 缓冲液 ,流式细胞仪检测。 2.6 MTT 法 检测 细胞 增殖情况 (1 ) 接种细胞: 用0.25% 胰蛋白酶 (含0.02%EDTA ) 消化液消化培养的细胞, 用含10% 3 FBS 的低 糖DMEM 培 养液吹 打成 单细胞 悬液 ,以每 孔10 个细胞 接 种于96 孔培 养板 中 ,每孔体积100μl ; (2 )培养细胞:将培养板移入CO 孵育箱中,在37? 、5 %CO 及饱和湿度条件下 分别 2 2 培养1d 、2d 、3d 、4d 、5d 、6d 、7d , 设 置 空 白 组 及 实 验 组 , 实 验 组 每 组 设18 个平 行孔 ; (3)呈色:吸取孔内旧液,每孔加入 MTT 溶液(5mg/ml )20μl ,37?,继续孵育4h, 终止培养, 小心吸弃孔内培养上清液。 每孔加入 100μl DMSO , 振荡10min , 使结 晶物充分溶解; (4)比色:选择 490nm 波长, 在 酶标仪上测定各孔光吸收值,结果, 并进行统计 学分析 。 2.7 人 胎盘 、 脐带及 骨髓 源性 基质细胞 的成脂肪 细胞诱导 及油红 O 染色 鉴 17 人胎盘、脐带及骨髓源性间充质干细胞生物学性状的比较 定