【doc】北里链霉菌启动子和柱晶白霉素抗性基因的克隆

【doc】北里链霉菌启动子和柱晶白霉素抗性基因的克隆 北里链霉菌启动子和柱晶白霉素抗性基因 的克隆 /,,'中国抗生常禁志1.93'I8【|)2鼬,6O , t北里链霉菌(s打p.cs南s.s2488) 启动子和柱晶白霉素抗性基因的克隆 三翌Rq (四JI】抗茵素工业研究所,成都61OO5" 摘薹用启动子探针质粒plJ486作载体,变青链霉菌TK24作受体,克隆来自北里链霉菌 SK2488的启动子和柱晶白霉素抗性基因,得到三个转化子其中转化子变青链霉菌TK24(pRL1) 中重组质粒插入片段约为10kb,其外源启动活性和柱晶白霉素抗性较低'转化子变青链霉 菌TK24(pRL2)中重组质粒插入片段较小,但具有高活性的外源启动子,并有较高的柱晶白霉 索抗性}转化子变青链霉菌TK24(pRLX)中未分离得到重组质粒,但它同样具有区别于受体 的对新霉素和柱晶白霉索的抗性,而且它在R=YE平板上艟抑制其它转化子生长,其发酵液经 薄层层分析发现有不同于供体和受体的新斑点,发酵滚经高压斌相分析发现有一个吸收峰.但 三千转化株发酵液均无抗菌话性,将重组质粒pRLI和pRL2再转化变青链霉茸TK24,抗性稳定. 关?调北里链霉菌I启动子'柱晶白霉素I抗性基因一一一 前育 链霉菌的基因克隆随着载体(质粒和噬 菌体)和受体系统的甘益完善,已有了迅速的 发展.从目前的理论及,些证据看,抗生素 的抗性基因同其生物合成基因是连锁在一起 的.因此,从抗生素产生菌中克隆抗生素的 抗性基因,就可以作为探针去克隆抗生素的 生物合成基因.目前用l曲法克隆其生物合 成基因的抗生素有土霉索",红霉素", Bialaphos[?,瞟岭霉素'.两且,克隆抗 生素的抗性基因,并使其特异性产物加以扩 增对提高抗生素的产量也十分有效.莸们知 道,抗生素产生菌具有抗自身所产抗生素的 能力,并随其产生抗生素能力的提高,抗性 也在增加.最近还发现扰性基因不仅用在自 我防御,而且在抗生素生物合成中起着重要 作用.因此,利用基因克隆技术,得到某 种抗生素的抗性基因,重组到高拷贝质粒 上,再转化至宿主菌中增加其抗性,以期得 到高产菌株是很有效的(a. 在原核微生物中转录的起始是基因达 -254- 调节的主要点"基因克隆研究表明,同一 结构基因在不同宿主体内表达水平不同, 除与相关调节因素有关外,还与启动子的存 在和强弱有关.目前,链霉菌启动子探针质粒 的构建和使用,使分离和研究链霉菌转录控 制信号(启动子)的表达调节成为可能"-I口) 因此,研究链霉菌的启动子在改造产生抗生 素的链霉菌特性方面具有潜在应用价值.例 如,利用启动子探针质粒获得链霉菌启动子 后【目前已分离到近1O种链霉菌启动子),再 导入抗生素产生菌中,加强结构基因的表达, 以提高抗生素的产量,或将强启动子与抗生 素生物合成基因进行重组,提高抗生素的产 量.总之,对调节基因,特g是启动子的克 隆和研究对产生抗生素的链霉菌是很重要 的. 本文以启动子探针质粒pIJ4$6克隆了北 里链霉菌SK2488的启动子和柱晶自霉索的 抗性基因. 材料和方法 一 菌株和盾枉 北里链霉菌(S~replomyceski~asatoensis) 5K2488lI~Uil抗菌素工业研究所生物技术 室提供,在实验中作供体. 变青链霉菌(SireSIlomyceslivldans)T K24;英国D.A.Hopwood教授惠赠,在实 验中作受体 变青链霉菌M386,英国D.A.Hopwood 教授惠赠,在实验中用于提取质粒plJ 486. 质粒pI~486是启动子探针质粒,具有硫 链丝菌素(Thiostreptoa)抗性基因和缺少启 动子的氨基糖苷磷酸转移酶基因I(neo).在 实验中作载体.其限制性酶切图谱如图I. 蝴4 ?lI ?Ec口Rr ?S+tI XpnI SmaI ?B.mHl ?Xbal salGI lPatI SphI ?ndI PstI ?B且【I :,培养基和培养条件 1.斜面固体培养基,变青链霉苗斜面 培养基"",2813培养6天. 2,液体培养基:YEME液体培养基, 2813培养46小时,在培养菌丝体时与用于制 备原生质体时相同,均加0.5的甘氨酸用 于培养变青链霉菌M386和转化子的苗丝体 以提取质粒,并加入硫链丝菌素5ag/mln 3.种子和发酵培养基t 种子培养基()l淀粉1.5,黄豆粉1.2, 鱼胨0.5,葡萄糖1.5,酵母粉0.5,KNO8 O.25,NaC10.2,CaCO,0.4.pH自然, 28?,2天. 图1质粒p[J486物理图谱 发酵培养基(%):葡萄糖2,黄豆粉3.5, 淀粉4,KH|PO'0.05,MgS040.5,NItC1 0.5,MnCItO.05.CaCO30.6.pH:7.0, 28?,5天 4.平板培养基,RtYE和基本培养基 C . 三.主要试剂 限制性内切酶缓冲液,T'DNA连接酶 缓冲液,电泳缓冲液(TAE),TE缓冲液及 琼脂糖凝胶电泳样品携带缓冲液均参照 MattiatisT"a等方法配制. 转化原生质体时所用的P缓冲液按Ho— pwood方法配制" 琼脂糖凝胶电泳染色液为0.5ag/ml溴 化乙锭在TAE电泳缓冲液中. 四,琼脂搪凝胶电泳 琼脂糖浓度为1.DNA样品和携带缓 冲液按5t1混合后进样,平板电泳(9x8era), 5V/ctla,凝胶在0.5.ug/ml溴化乙锭中染色3O 分钟,在紫外灯下观察及照相 五.DNA操作 1.质粒及重组质粒DNA采用Kieser时 -255? 'II?l, 碱法提取(省去精胺处理一步). 2.总DNA提取按Hopwood等方法提 取(省去精胺处理一步)"lj. 3.DNA用Hindl酶切作对照,BamH 1酶切DNA及用T4DNA连接酶连接均参 照Maniatis等方法. 六,原生质体制备和再生 受体菌变青链霉菌TK24的原生质体翩 备和再生按Hopwood的方法",北里链霉 菌SK2488的原生质体制备参照Hop~ood方 法,但藩菌酶加后的培养温度提高为34?. 培养时间增加了3小时左右,并随时用显搬 镜现察原生质体形成情况.原生质体均在干 燥的RzYE平板上再生. 七.转化及再转化 重组DNA混台物及重组质粒等转化受 体原生质体按Hopwood等方法". ^.转化子及再转化子的再生和筛选 DNA转化后混合物涂布于干燥的R,YE 平板上,在28?培养2d小时,然后用lmI含 硫链丝菌素50~g/ml的P缓冲渡覆盖,28?继 续培养,两天后可见对硫链丝菌素具有抗性 的菌落出现,即转化子 九.对硫链丝菌素和新霉素具有双重抗 性重组子的筛选 将已得到的对硫链丝菌索具有抗性的转 化子继续培养,待长有孢子后,用消毒过的 丝绒影印到含新霉索1.ug/ml的MM培养基 上,以变青链霉菌TK24为对照,28"C培养 现察,得蓟对硫链丝菌素和新霉索具有抗性 的重组转化子. 十.对硫链丝茸素.新霉素和拄晶白霉 素均具有抗性的转化子的筛选 将已得到的双重转化子接入含柱晶自霉 索(50m1)的RtYE培养基,并以变青链 霉菌TK24为对照,得到对柱晶自霉素有抗 性的转化子,并将其接入不同浓度的新霉素, 柱晶自霉素的RtYE培养基,对其抗性大小 进行测定,并以北里链霉菌SK2488和变青 链霉菌TK24为对照. ?256? 十一.北里链霉茸SK2488,变青蛙霉 l~TK24Yl转化子进行发酵测定 分别将其由斜面接入种子培养基,28"C 培养2天,然后再分别接0.5ml至发酵培养 基,28?培养5天. 十:.发酵液抗茵活性的洲定 用枯草芽孢杆菌作为检测菌,用牛津杯 法进行攫i定. 十三,发酵液进行硅胶H薄层层析分析 将发酵滤液点于硅胶H薄层层析板上, 在氯仿:甲醇氨水(955:0.5)中展层,随后 用碘蒸气显色? 十四,发酵液高压液相分析 发酵滤液经无水乙醇处理后,采用日本 岛滓C-R3A,参照潘建英等方法进行". 结果 1.实验用菌株对硫链丝菌索,新霉索 和柱晶自霉索抗性的测定用含不同浓度的 硫链丝菌素,新霉素和桂晶自霉索的培养基 分别测定实验菌的不同抗性,结果见表一. 由表一可知,作为受体的变青链霉菌 TK24对硫链丝菌素,新霉素及柱晶自霉素是敏感的.而作为供体的北里链霉菌SK2488 对硫链丝菌索,新霉素也是敏感的.因此, 筛选转化子时,得到的新霉素抗性转化子的 抗性基因不应是来自供体菌,而是pi1486上 衰一实验用菌株抗性蔫定 硫链丝胜晶I 菌素新霉肃g/m1) P.g 素/m:( 1~g/m1) RtYERtYEMMRY — l f5f02OO5OO1050O 北里链霉菌?} SK2488一r 变青链霉菌一j+TK24 变青链霉菌?一f+?M386 n?基因被启动得到表达由表一也得出了 两种培养基RtYE和MM培养基.三种抗 生紊应使用的最小浓度t硫链丝菌素50pg/ m1,新霉索50#g/ml和fi#g/ml,柱晶自霉 素50~g/m!. 2.北里链霉菌SK2488质粒的检测:用 YEME液体培养基培养菌丝体,用碱性法提 取质粒,电泳后未发现质粒带.此结果与本 实验室同恚以前得出的结果相同.说明此菌 株可能不含质粒. 3.供体菌北里链霉菌SK2488染色体总 DNA,质粒pIJ4S6~提取及酶切,连接和 转化:供体总DNA用BamHl部分酶切,plJ 486DNA用BamHI完全酶切,再按一定比例 将二者混合,在T4DNA连接酶作用下连接. 重组混合物转化受体变青链霉菌TK24 原生质体,经过影印及抗性标记选择,最后 得到三个同时对硫链丝菌素,新霉素和柱晶 自霉素均具抗性的重组转化子.它们是变青 链霉菌TK24(pRLI),变青链霉菌TK24 (pRL2),变青链霉菌TK24<pRLX) 4.转化子对新霉索和柱晶白霉素抗性 的进一步测定t将得到的三个转化子分别接 种到含不同浓度的新霉素和柱晶白霉素的 RtYE平板上,28?培养,观察生长情况,结 果见表二. 转化子变青链霉菌TK24(pRLI)对新 霉素的抗性水平为3Oe/ml,而转化子变 青链霉素TK24(pRL2)和转化子变青链霉 菌TK24(pRLX)对新霉素的抗性水平高于 600#g/ml,转化子变青链霉菌TK24<pRL1) 对柱晶自霉素的抗性为2..,300pg/m1,而 转化子变青链霉菌TK24<pRL2)和变青链霉 菌TK24<pSRX)对柱晶自霉素抗性水平达 400~g/ml,说明转化子变青链霉菌TK24 (pRL2)和TK24<pRLX)中存在外源起动活 性较强的启动子,并有较强的对柱晶自霉素 的抗性.而转化子变青链霉菌TK24(pRL1) 中则含有外源起动活性较低的启动子,并且 对柱晶自霉素的抗性较弱. 5.重组质牧的提取和插入片段大小测 定:用碱性法提取重组质粒,用]3amHI酶 切,然后进行琼脂糖凝胶电泳,并用DAN 的HiadI酶切物做片段大小的对照物,得到 pRLI的插入片段约为10kb,pRL2的插入片 段较小,未得到,从转化子变青链霉菌TK 24<pRLX)中未分离得到质粒.如图2 6.转化株发酵液抗菌活性铡定t变青链 霉菌TK24(pRLI).变青链霉菌TK24<P, RL2)和变青链霉菌TK24(pKLX)发酵液 表二各菌株抗性测定 抗生素浓北里链霉菌变青链霉菌变青链霉菌变青链霉菌裹度 SK2488TK24TK24(pRL1)TK24(pRL2) <~g/m1) 新霉索柱晶新霉索柱晶柱晶柱晶自 白霉素白霉索新霉索新霉索柱晶自霉新霉索白霉素霉素 0 5O 1oo} 200 3oo++ 40O l 8oo—士 图2重组质粒酶切电泳示意图 ^供体SK2488总DNA B鸯睾化子壹青链霉蕾TK24(pRLX)~提取 C重组质鞋pRL2+BBmHI D重组虚粒pRL1+mill Ep|J486+B'mHf FpII4B~ G^DAN+Hiudl 图s变青链霉菌TK24(pRLX)在R,YE 平板上抑制其它转化株生长的透明圈 均无抗菌活性. 但变青链霉菌TK24(pRLX)在R2YE平 板上培养时周围出现一个抑帝l其它转化株生 长的透明圈(如图3). 7.转化株发酵液薄层层析.变青链霉菌 TK24(pRLX)发酵液在薄层层析板上出现 不同于变青链霉菌TK24,北里链霉菌SK 2488新斑点,北里链霉菌SK2488发酵液的 Rf值为0.19,变青链霉菌TK24发酵液的Rf 值为o.07,但此点为系统杂质,转化子变青 链霉菌TKz4(pRLX)的Rf值为0.36和0.42 f如图4). 8.转化株变青链霉菌TK24和变青链霉 菌M386发酵液没有吸收峰,北里链霉菌SK 2488发酵液有4个吸收峰,分剐是8.627, ?258? 1I.502,16.403和23.708.转化子变青链霉菌 TK24(pRLX)发酵液有一个吸收峰II.667, 如图5. (pRLX)(pRt1)(pRL2) 图4发酵液薄层层斩示意图 jss ^ 3.22B B 3.4S C 3.173 图5转化于变青链霉菌TK24(pRLX) 发酵藏HPLC盈 A变青链霉菌TK24发茸{直 B北里链霉菌SKZ488发酵{直 C变肯链葛蕾M386发群{直 D转但予壹青链霉菌TIC~~IpRLX)发酵蠹 D 9.再转化:将获得的重组质粒pRL1和 pRL2再转化变青链霉菌TK24,抗性结果 同上.将它们再转化北里链霉菌SK2488原 生质体未获得成功. 讨论 本实验得到了启动活性和抗性不同的转 化子,其中重组质粒pRL1的插入片段较大, 但外源起动活性和抗性都较弱,而重组质粒 pRL2的插入片段较小,但外源起动活性和 抗性都很高.启动活性不同可能有几种原因 一 是启动子本身片段大小和结构特点'二是 重组质粒在受体苗中拷贝数的多少;三是来 自供体菌的启动子在供体菌中的表达时序, 调节表达条件与在受体菌中不同.而与其连 锁的抗性基园抗性的大小很可能是由启动子 的活性决定.Bibb等报道",链霉菌间 启动子是通用的,因此当我们克隆到一个强 启动子后,将其同结构基园连在一起,以提 高结构基因的表达,或将其抗性较强的抗性 基因转入产生抗生素的菌株中,以期提高抗 生素的产量.虽然本实验将重组质粒pRL1和 pRL2去转化北里链霉菌SK2488原生质体未 获得成功,其原因可能是北里链霉菌SK2488 原生质体的转化条件未撑握好,或是北里链 霉菌SK2488中的甩制性内切酶系统对转化 DNA起了作用. 转化株变青链霉菌TK24(pRLX)中未 发现重组质粒,但它同样对新霉素和柱晶白 霉素有抗性,关于这一点,可以排除提取质 粒时技术上的问,园此原因可能是;第一, 载体plJ486携带了一段来自北里链霉苗SK 2488的染色体DNA片段,而它与变青链霉 苗TK24基因组中的一段DNA有同源顺序, 经同源整合进入变青链霉菌rK24的染色体. 因为7O年代束Hopwood教授指出,在链霉 菌中可能存在一些未表现其功能的沉默基 因,因此,变青链霉菌TK2d中存在同北里 链霉菌SK2488基因组中同源的保守序列是 有可能的}第二,就是载体plJ486中克隆了 柱晶白霉素的抗性基园,在进入变青链霉菌 TK24后,克隆片段发生了转座,而质粒发 生了丢失.因为,KarlEsser等在其综述 中指出,许多抗生素的抗性基因定位于转座 子上". 从转化子发酵渡在TLC薄板上的结果 看出,转化子变青链霉菌TK24(pRLX)确 实不同于供体,受体及载体宿主,虽然柱晶 白霉素是多组份,但由于北里链霉菌SK2488 是最原始的菌,产量低,很可能有一些组份 显不出来.另外,它在RzYE平板上产生的 抑制圈以及发酵液的HPLC图足以证明受 体基因组中一定发生了变化,并产生了一种 物质.原因可能是:第一,克隆DNA片段激 活了受体菌中的沉默基因,产生了新的代谢 产物I第二,克隆片段可能是部分生物合成 基因,产生了柱晶白霉素的前体或中间体, 或是由于互补产生了不同于柱晶白霉素的其 它物质.但其准确结论有待于进一步研究 参考文献 [I]RhodesPMetal:BiochemSocTrans l984I12l586,587 [2]StanzakRetal,Bio/Tech1986I4(1): 929~232 [8]MurakamlJetalMGG1988I205=42 ,50 [4]HopwoodDAetah"Proceedingsof 6thInternationalSymposiumOnthe BiologyofActinomycetes"Debrecen, Hungary(国外药学抗生素分册l987I8(2) l122,128) [5]KumadaYetalBJAmtibiot1988I4l (12)1838~1845 [6]CrameriReta1BJAntibio~"1986l39 (1):128,135 [7]RobertWetalIGene1982l20I291, 304 [8]姜增莲等I生l物l988I4(3)'166 ,170 (9]BihhMJetallMGG1982I187t265— 2TT ?259? 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AbsorptionpeakappearedintheHPLCmapofS.1ividansTK24(pRLX) fermentationbroth.ButaIIfermentationbrothofthethreetransformants hadnotanvantibactertaIactivities.TheresnItsofretransformatlonOf recombinantplasmidpRL1andpRL2intoS.1ividansTK24werethesacsle asabove. KEYwORDSStreptomyceskitasatO~sis2488jPromotorjLeueomy~- inIResistantgene ? 26O? ? ;[,,