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探讨弓形虫感染孕鼠对胎鼠脑组织蛋白的影响(可编辑)

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探讨弓形虫感染孕鼠对胎鼠脑组织蛋白的影响(可编辑)探讨弓形虫感染孕鼠对胎鼠脑组织蛋白的影响(可编辑) 两医科大学硕:学位论文 单位代码: 分类号: 学 号: 密 级: 探讨弓形虫感染孕鼠对胎鼠脑组织蛋白的影响 研 究 生:夔基迭 指 导 教师:堡垂墓塾拯 申请学位门类级别:医堂亟? 专 业 名称:疸厦生塑堂 研 究 方 向:宣生虫壁鎏皇尘殖垂理 所 在 学院:基础医堂医 年月同 医科大学硕学位沦文, 哪 .西医科人学硕学位论文 学位论文独创性声明 本人声明,所呈交的学位论文系在导师侯玉英教授指导下本人独 立完成的研究成果。 文中任何引用他...
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探讨弓形虫感染孕鼠对胎鼠脑组织蛋白的影响(可编辑) 两医科大学硕:学位 单位代码: 分类号: 学 号: 密 级: 探讨弓形虫感染孕鼠对胎鼠脑组织蛋白的影响 研 究 生:夔基迭 指 导 教师:堡垂墓塾拯 申请学位门类级别:医堂亟? 专 业 名称:疸厦生塑堂 研 究 方 向:宣生虫壁鎏皇尘殖垂理 所 在 学院:基础医堂医 年月同 医科大学硕学位沦文, 哪 .西医科人学硕学位论文 学位论文独创性声明 本人声明,所呈交的学位论文系在导师侯玉英教授指导下本人独 立完成的研究成果。 文中任何引用他人的成果,均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已 属于他人的任何形式的研究成果,也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本文如违反上述声明,愿意承担以下责任和后果: 、交回学校授予的学位证书; 、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报; 、本文按照学校规定的方式,对因不当取得学位给学校造成的名誉损害,进行公开 道歉; 、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。 日期:渔羔年?鱼月?尘日 论文作者签名:蔫蚕堕尘筮 学位论文版权使用授权书 本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权山西医科 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索,可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论 文或成果时,署名单位 仍然为山西医科大学。 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名: 期:塑兰年?鱼月竺同 指导教师签名: 日期:??年??月??同 本声明的版权归山西医科大学所有,未经许可,任何单位及任何 个人不得擅自使用山西医科火学硕:学位沦文 目录 缩略词 中文摘要第一章建立生殖毒性的小鼠模型? .材料和?.. .结果??..? .讨论.. 第二章观察弓形虫感染对胎鼠的毒性作用?. .材料和方法.?. .结果?........ .讨论??.... 第三章 弓形虫感染胎鼠脑组织相关蛋白质样品的制备与分 离?.. .材料和方法.? .实验方法?... .结果.....?...?..?....讨论...??.....?.......?. 第四章 弓形虫感染相关差异蛋白质谱鉴定与生物信息学分 析.?. .材料和方法??..?.. .实验方法...?.?..??.??.?.??..?. .结果......?.....................?.... .讨论..??....??..??.. 参考文献?..??.... 第五章文献综述蛋白质组学研究技术及在弓形虫病诊断中的应用 . 蛋白质组学相关核心概念??.? .蛋白质组学研究技 术.?....?........................??......... .蛋白质组学在各领域的研究应?.??.?.??. .蛋白质组学在弓形虫研究中的应用??.?.?.?.. .蛋白质组学发展趋势??..?.?.?..?....?. 参考文 献................?......?...?.?...........?.....?..?.... 附录.??.??..??.......?..... 个人简 历??.?......?...?...??...............??.?...??..??.. 致谢.?.?..?.?..??.?.?.?两医科人学硕学位沦文 缩略词 英文缩写 中文全称 英文全称 刚地弓形虫 半数致死量 牛血清白蛋白 一胆碱胺丙基一二乙胺 一一一? 丙磺酸 一一? 双向电泳 二硫苏糖醇 乙二胺四乙酸乙二醇双一氨基乙醚四乙酸等电聚焦 固相梯度千道尔顿 相对分子量 聚丙烯酰胺凝胶电泳等电点肽质量指纹谱 十二烷基磺酸钠三氟乙酸三羟甲基氨基甲炕 ?? ?基质辅助激光解吸电离乜行时间质谱 阴医科大学硕:学位 论文 探讨弓形虫感染孕鼠对胎鼠脑组织蛋白的影响 中文摘要 目的:?采用不同剂量的弓形虫速殖子经腹腔接种孕中期小鼠,建立弓形虫急性感染孕 鼠的动物模型;?利用弓形虫感染孕鼠的模型,观察弓形虫是否对胎鼠有毒性作用;?采 用双向凝胶电泳技术,提取胎鼠脑组织的蛋白质;?利用基质辅助激光解吸电离飞行时间 质谱技术,鉴定染虫胎鼠脑组织是否有特异性蛋白;?利用生物信息学软件,对染虫胎鼠 脑组织的特异蛋白进行分类和功能分析。利用以上的实验技术和生物信息学软件,来分析 和探讨母代小鼠感染弓形虫,对子代脑组织是否有影响,为干预先天性弓形虫脑病和提高 优生优育率提供可靠的理论依据。 方法:?建立动物模型:将?周龄、?的/小鼠交配,查孕栓。将受孕鼠 随机分为正常组和感染组~组,每组只。于受孕第天,正常组孕鼠经 腹腔注射无菌./只,染虫~组孕鼠分别腹腔注射经胰酶消化后的弓形虫速 殖子个、个、个、个和个/./只。观察和记录孕鼠的体重、进食量、 饮水量,有无竖毛、怠动、厌食、弓背、存活等情况,计算半数致 死量,确定接种孕鼠的 最佳剂量。?观察弓形虫对胎鼠的毒性作用:采用受孕的/小鼠只,随机分为正 常组和染虫组,每组各只。于受孕第天,正常组小鼠经腹腔注射无 菌./只,染虫组经腹腔注射胰酶消化后的弓形虫速殖子最佳剂量个 /。在怀孕第天处死孕鼠,剖腹取胎鼠,肉眼观察胎鼠的颜色,判断胎鼠的存活情 况,记录活胎、死胎和吸收胎数,计算活胎率。称胎鼠的重量,测胎鼠的体长、尾长。同 时,解剖胎鼠取脑组织,观察脑有无出血、水肿等情况,证实弓形虫是否对胎鼠有毒性作 用。?采用双向凝胶电泳技术分离胎鼠脑组织蛋白:取『常组和染虫组胎鼠新鲜的脑组织, 进行研磨、纯化,提取总蛋白,进行定量。再根据双向凝胶电泳原理,进行一维等电聚焦, 然后根据分子量和等电点进行二向垂直分离,获取蛋白质点。采用胶图分析软件,对两组 凝胶图像以不同灰度值计算比值,根据.的标准判断,从中选取差异显著的蛋白点。 ?利用质谱技术鉴定染虫胎鼠脑组织的特异蛋白:将差异显著的蛋白点从胶图上切取,经 蛋白酶切和肽段提取,再利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析每种蛋白独特的肽 指纹图谱。用软件对图谱进行分析,根据系统打分分值的高低、分子量、 等电点、序列覆盖率等信息鉴定其可靠性。?用生物信息学软件分析染虫胎鼠脑组 织特异性蛋白质的种类和功能:应用分析的结果,分析和探讨特异性蛋白是否与先天性弓 形虫病的发生有相关性。 结果:?动物模型的结果:正常对照组孕鼠体重增加明显,采食量、饮水量『常,在 受孕期的观察中未出现竖毛、倦怠等异常反应,胎鼠发育无异常,存活率高达.%。染山西医科大学硕:学位沦文 虫组、组孕鼠在孕期有活动量少、倦怠的现象。组孕鼠在孕期出现采食量、饮水量 减少,倦怠等症状,并有流产现象,天剖出的胎鼠,活胎率为.。组孕鼠孕期的 采食量、饮水量明显减少,有竖毛、弓背现象,体重增长缓慢;剖出的胎鼠中,死胎、吸 收胎多,活胎率仅为.%。组的孕鼠,体重增长不明显,弓背、竖毛现象严重;在孕 天时,已有/孕鼠死亡;存活的孕鼠,胎鼠均已流产。通过对胎鼠的 半数致死量分析, 腹腔接种经胰酶消化的弓形虫速殖子个/只为最佳剂量。?胎鼠的毒性反应:正常组 胎鼠发育良好,仅有例吸收胎。染虫组的胎鼠中有死胎、吸收胎,胎鼠的体重明显减 轻,身长及尾长也明显缩短,差异具有统计学意义.。解剖镜下观察,胎鼠有 例脑出血,例脑水肿。通过两组比较分析,弓形虫感染母鼠可导致胎鼠的毒性反应。? 胎鼠脑组织蛋白的分析:采用双向电泳的方法分析了两组胎鼠脑组织的蛋白,其正常对照 组与染虫组的胎鼠脑组织均有独特的一凝胶电泳图谱,且不同批次的实验重复性良好, 组内的匹配率达%以上。每块凝胶图上可以分离出约个蛋白点。经软件对比分 析,得到差异显著的蛋白点个。?把差异表达显著的个蛋白点用生物质谱鉴定和生 物信息学软件进行分类和功能的分析:发现这些蛋白点主要是肌动蛋白、结蛋白、血清白 蛋白、蛋白质二硫键异构酶、膜联蛋白和葡萄糖调节蛋白。结蛋白和肌动蛋白是维持细胞 结构的蛋白;血清白蛋白具有抑制血小板聚集、抗凝血和维持血 液胶体渗透压的作用;葡 萄糖调节蛋白是一种应激蛋白,可保护细胞结构,有报道显示可能与小鼠的心脏和神经管 发育有关;蛋白质二硫键异构酶可催化蛋白质二硫键的形成和对错配二硫键的修整;膜联 蛋白参与细胞膜表面的物质转运。在弓形虫感染的鼠脑中,这些蛋白均低于正常对照组的 表达。说明弓形虫感染胎鼠,对胎鼠脑组织的细胞结构和功能造成损伤,可引发先天性弓 形虫脑病。 结论:?采用经胰酶消化的弓形虫速殖子个/只腹腔接种/孕鼠,可作为弓形虫 感染孕鼠生殖毒性的最佳剂量。?以个/只经胰酶消化的弓形虫速殖子感染母代小鼠, 可导致子代感染,并产生毒性反应。?弓形虫感染孕鼠可影响胎鼠脑组织蛋白的表达。? 利用? 技术和生物信息学软件分析个特异性蛋白质,发现弓形虫感 染小鼠的脑组织中,肌动蛋白、结蛋白、血清白蛋白、蛋白质二硫键异构酶、膜联蛋白和 葡萄糖调节蛋白均低于正常鼠,说明弓形虫感染对宿主脑组织细胞的结构和功能有损伤作 用。此研究为先天性弓形虫脑病的珍治奠定了理论基础,但需要 进一步的验证。 关键词:弓形虫、小鼠模型、胎鼠脑、双向凝胶电泳、质谱分析 山西医科人学硕:学位论文:;?;? ; ., ;?. , .,. :. :/ . :. .. /. /. / .,,, , , .,,, .: / ... //., ,, ,,, . ,, ; , , ? ,. , 俩医科大学硕士学位论文 一???????????????????????????????????????????????一 : ,. ,,,, . , .,, ,.. . , : ’, ? , , , 百:, ’ . ’: . . : , :? , .%.. , ,. , , .%. , . . . ..%., . ., ,. . .?/ : ,, ,, , , .., .. : 两医科人学硕士学位沦文,’ , %. , ., . : ,,,,. ;, ; , , ;; . ,, .’ , . / : /. , . . , ,,,,, , . . , : , ,? , ,晒医科大学硕学位论文 第一章建立生殖毒性的小鼠模型 【摘要】 目的采用不同剂量的弓形虫速殖子经腹腔接种孕中期小鼠,建立弓形虫急性感 染孕鼠的动物模型。方法将?周龄的/小鼠、体重,交配,查孕栓,将 受孕鼠随机分为组:正常组和感染组~,每组只。受孕第天,正常组 小鼠经腹腔注射无菌./只,染虫~组小鼠分别腹腔注射经胰酶消化后的弓 形虫速殖子个、个、个、个和个/./只。观察和记录孕鼠的体重、进 食量、饮水量,有无竖毛、怠动、厌食、弓背、存活等情况,计算半数致死量, 确定接种孕鼠的最佳剂量。结果正常对照组孕鼠的体重明显增加,采食量、饮水量正常, 在孕期的观察中,孕鼠未出现竖毛、倦怠等异常反应,剖取的胎鼠存活率高达.%。染 虫组、组孕鼠仅在孕晚期出现活动量少、倦怠的现象。组孕鼠在 孕晚期出现采食量、 饮水量减少,倦怠等症状,并有流产现象,胎鼠中活胎率为.%。组孕鼠在孕晚期采 食量、饮水量明显减少,有竖毛、弓背的现象,体重增长不明显,死胎、吸收胎多,活胎 率仅为.%。组孕鼠体重减轻,弓背、竖毛严重,在孕晚期有/孕鼠死亡,存活的 孕鼠腹内未见胎鼠。通过对胎鼠半数致死量的分析,个/只胰酶消化的弓形虫速殖子, 作为生殖毒性模型接种的最佳剂量。结论采用经胰酶消化的弓形虫速殖子个/只腹腔接 种/孕鼠,可作为弓形虫感染孕鼠生殖毒性的最佳剂量。 【关键词】刚地弓形虫、小鼠、生殖毒性模型. ?? ,/: . . ,. . /., /. / ,,, . , , , , .,,, . ,.,山西医科大学硕学位论文 . ..%. , . , , . .%. , ,, , . .. .%. , 。. ,., ./ . , / . ,, ?上.?一 刖百 ,是一种专性的细胞内寄生 刚地弓形虫 原虫,可寄生在所有有核细胞内,人和动物感染率极高,可引起人兽共患弓形虫病【】。弓 形虫是重要的机会致病性原虫,正常人感染弓形虫多为隐性感染,免疫功能低下或缺陷的 宿主感染可出现脑炎、眼部的视网膜脉络膜炎、肝炎、肺炎等病症。孕妇感染虫体,引起 流产、早产、死产;孕妇感染可经胎盘传播于胎儿,可造成胚胎的发育迟缓及各种畸形; 导致先天性弓形虫病【。 本实验采用孕中期/小鼠腹腔接种不同剂量的经胰酶消化的株弓形虫速殖 子,观察孕鼠的健康状况、流产率和胎鼠的存活率,计算胎鼠的半数致死量,确立弓形虫 急性感染孕鼠的最佳剂量,建立弓形虫急性感染小鼠的生殖毒性模型。 .材料和方法 .. 实验动物 /小鼠,清洁级,体重?,引白中国疾病预防控制中心实验动物研究所, 在本实验室内饲养、繁殖,保持近交。将健康的~周龄/处女鼠与雄鼠:合 笼,次晨查阴栓,查到者计为孕天。将检出的小鼠按先后顺序编号,记录体重。于妊娠 第天再次称重,体重增长.以上者纳为实验鼠。 ..弓形虫虫株 弓形虫株引自北京大学医学部寄生虫学教研室,在本实验室液氮保存,常规复苏, 在/小鼠体内转种三代,用于实验。西医科人学硕:学位论文 ..主要仪器 低速台式离心机型北京医用离心机厂,恒温水浴锅浙江嘉兴中新医疗仪 器有限公司,普通光学显微镜型日本株式会社,电子精密天平 型梅特勒一托利多仪器上海有限公司。 ..实验方法 ... 弓形虫速殖子获取 收集转种三代的染虫孕鼠腹腔液,以离心,弃上清液,用无菌 水 将沉淀物洗涤,再次离心。取离心后沉淀物加入.%胰蛋白酶液稀释,放入 浴锅中消化,再离心,留沉淀物。 ...弓形虫速殖子计数 将离心后留取的沉淀物中加入无菌,震荡稀释,使沉淀物与完全混匀。 取 稀释液加入干净的血细胞计数板,于显微镜下计数弓形虫速殖子,用调整含 虫液的浓度。计算稀释液中弓形虫速殖子的浓度,公式:弓形虫速殖子数/:个大方格 速殖子总数/××稀释倍数。 ...动物的分组处理 将实验用/孕鼠?,?周龄随机分组:组为正常对照组,~ 组为染虫组,每组各只。妊娠第天,正常对照组孕鼠经腹腔注射无 菌./只, ~组孕鼠分别经腹腔注射胰酶消化后的弓形虫速殖子个、个、个、个和 个/./只。观察并记录孕鼠的体重、进食量、饮水量,有无竖毛、怠动、厌食、弓背、 死亡等情况。于妊娠第天颈椎脱臼处死孕鼠,从阴门处沿腹中线剪开,暴露子宫和卵 巢,解剖镜下分离双侧卵巢,剥离黄体,计数。剖开子宫,观察胚胎的颜色、数量、外形 的变化,判断胎鼠的存活情况,记录活胎、死胎、吸收胎的数目,并计算胎鼠的半数致死 量,确定弓形虫急性感染孕鼠的最佳剂量。 ...结果处理 全部数据采用.统计软件录入并分析,计量资料用?表示,不同剂量比较 采用两独立检验,检验水准.。 . 结果 .. 孕鼠的毒性反应 正常组孕鼠采食量、饮水量正常,随着妊娠天数的增加体重增加明显,整个孕期的 观察中,孕鼠未出现竖毛、倦怠等异常现象;染虫组孕鼠在天出现 活动量少、倦怠 的现象;组孕鼠在天开始出现采食量、饮水量减少,倦怠等症状,体重与阴性对照组 比较无差异.;组孕鼠在天出现采食量、饮水量明显减少,有竖毛现象,体 重与阴性对照组比较有差异.;组孕鼠在天出现采食量、饮水量明显减少,两医科大学硕:学位论文 有竖毛、弓背现象,孕天时体重比正常对照组明显减轻; 组孕鼠体重增长不明显, 弓背、竖毛现象严重,孕天时,只孕鼠已死亡见表卜。 表弓形虫感染对孕鼠体重的影响 注:与正常对照组相比,木.,料. 由此看出,组个/只弓形虫速殖子由于剂量较小,对孕鼠的毒性作用不明显; 组个/只弓形虫速殖子则由于剂量过大,对孕鼠的毒性作用较强,均不适于用作 观察弓形虫感染孕鼠毒性作用的剂量。 ..孕鼠流产情况 天解剖孕鼠,计数黄体数和胎鼠数,计算孕鼠的流产率黄体数一胎鼠数/黄体 数×%。染虫组、组孕鼠无流产现象,组孕鼠的流产率为.%,差异具有统计学 意义.,组孕鼠的流产率为.%,差异具有统计学意义.,组孕 鼠解剖后只有黄体存在,未发现胎鼠,其流产率为%。可见,组剂量个/只弓形 虫速殖子对孕鼠和胎鼠的毒性太小,未有流产现象,不适宜作为弓形虫感染孕鼠生殖模 型的剂量见表卜。 表卜弓形虫感染对胎鼠的影响个 组别 黄体数 胎鼠数 流产率% 活胎数 死胎数 吸收胎数 活胎率% . 组. 组 .’ 组 ..组 . 组. 组沣:’ 帛对《绁相比,木. ..胎鼠存活情况 观察胎鼠的颜色及外形,粉红色为活胎,黑色、紫色为死胎,未成形的胚胎为吸收胎。 由表卜可见,随着感染剂量的增加,活胎数逐渐减少,死胎和吸收胎增多,活胎率与『 常对照组相比,差异均有统计学意义.。半数致死量是指能杀死一半试 验总体的有害物质的剂量。组个/只弓形虫速殖子中,活胎率为.%, 有一半 硼医科大学硕‘:学位沦文 的胎鼠为死胎和吸收胎。组剂量个/只弓形虫速殖子对胎鼠的毒性太大,多数为 死胎和吸收胎,活胎率仅为.%,不适宜作为弓形虫感染孕鼠生殖模型的剂量。所以, 个/只弓形虫速殖子可作为弓形虫感染孕鼠对胎鼠毒性作用的半数致死量,用此剂量感 染可建立生殖毒性的模型。 讨论 弓形虫病是一种人畜共患寄生虫病【】,临床上分为先天性和获得性两类。先天性弓形 虫病是母亲在孕期感染,虫体经胎盘传播于胎儿,引起的先天性疾患。根据临床资料报道, 孕早期感染弓形虫,大多数以流产、死胎为结局【】;孕中期感染虫体,胎鼠的死亡率、畸 形率较高【】;孕晚期感染虫体,可引起孕鼠早产和胚胎的感染】。我们采用/小鼠是 因为此鼠为近交系,它们之间的个体差异小,遗传基因纯,性状稳定,适合于做整体 实验。小鼠的配子发生、受精及胚胎的形成、个体发育对人类或哺乳动物具有代表性?圳, 是研究配子发生和胚胎学实验及个体观察常用的实验动物。而且,胎鼠器官的形成是在. 天开始【 。并且我们前期已对弓形虫感染雄性和雌性小鼠的生殖毒性反应进行了系统的观 察,发现:?弓形虫感染雄性小鼠,会侵入雄鼠的生殖系统,导致雄鼠的睾丸、附睾细胞 及损伤【】;精子数量及形状发生变化;雄激素水平、激素受体及血清和睾丸组织 氧自由基水平受到影? 。?弓形虫感染雌鼠会损伤各器官组织的结构,影响内分泌功 能【 。而且,虫体可影响受精卵的发育【珈】,也可影响胎盘组织细胞的结构和功能【心。 同时,我们也证实了虫体经胎盘可传播于胎儿【。】。台感染弓形虫是否导致先天性弓形 虫病我们利用弓形虫垂直传播的小鼠模型,来探讨弓形虫感染对胎鼠的毒性反应。 实验中,我们将孕中期/小鼠分别经腹腔接种个/只、个/只、个/只、 个/只和个/只经胰酶消化的弓形虫速殖子,与正常对照组比较,染虫组孕鼠在 天出现活动量少、倦怠的现象;组孕鼠在天开始出现采食量、饮水量减少,倦怠 等症状;组孕鼠在天出现采食量、饮水量明显减少,有竖毛现象,体重与阴性对照组 比较有差异.;组孕鼠在天出现采食量、饮水量明显减少,有竖毛、弓背现 象,孕天时体重比正常对照组明显减轻; 组孕鼠体重增长不明显,弓背、竖毛现象 严重,孕天时,只孕鼠已死亡。由此看出,弓形虫感染对孕鼠有毒性作用。但是, 组个/只弓形虫速殖子由于剂量较小,对孕鼠的毒性作用不明显;而组个/ 只弓形虫速殖子则由于剂量过大,对孕鼠的毒性作用较强,均不适于用作观察弓形虫急 性感染孕鼠毒性作用的剂量。 文献报道,孕妇感染弓形虫后,可导致流产、早产和异常妊娠【?。且感染越早,剂量 越大,不良妊娠越严重。实验中,染虫组、组孕鼠无流产现象,组孕鼠的流产率为 .%,组孕鼠的流产率为.%,组孕鼠解剖后只有黄体存在,未发现胎鼠,其流产 率为%。可见组剂量个/只弓形虫速殖子对胎鼠的毒性太小,未有流产现象, 不适宜作为弓形虫感染孕鼠生殖模型的剂量。山西医科大学硕: 学位论文 有研究证实,孕妇在妊娠中期感染弓形虫,多发生死胎和畸形【。在观察胎鼠存活率 中我们发现,弓形虫感染组小鼠均有死胎和吸收胎,且随着感染剂量的增加,死胎和吸收 胎的数目增加,差异与正常组比较有显著的统计学差异。半数致死量是指能杀死 一半试验总体的有害物质的剂量。组个/只弓形虫速殖子中,活胎率为.%, 有一半的胎鼠为死胎和吸收胎。组剂量个/只弓形虫速殖子对胎鼠的毒性太大, 多数为死胎和吸收胎,活胎率仅为.%,不适宜作为弓形虫感染孕鼠生殖模型的剂量。 所以,我们以个/只弓形虫速殖子接种孕鼠,通过孕中期生殖毒性模型,来观察虫体对 胎鼠的毒性作用。 山西医科人学硕士学位论文 第二章观察弓形虫感染对胎鼠的毒性作用 【摘要】 目的利用弓形虫感染孕鼠的模型,观察弓形虫对胎鼠的毒性作用。方法采用 受孕的/小鼠只,随机分为正常组和染虫组,每组各只。于受孕第 天,正常组经腹腔注射无菌./只,染虫组经腹腔注射胰酶消化后 的弓形虫速殖子最佳剂量个/只。于妊娠第天处死孕鼠,剖腹取胎鼠,用肉眼观 察胎鼠的颜色和形态,判断胎鼠的存活情况;记录活胎、死胎、吸收胎数,计算活胎率; 称胎鼠的重量,测胎鼠的体长、尾长;同时,解剖胎鼠取脑组织,观察脑有无出血、水肿 等情况。结果正常组胎鼠发育良好,仅有例吸收胎。染虫组胎鼠中有死胎、吸收 胎,胎鼠的体重明显减轻,身长及尾长短于正常组,差异有统计学意义.。解剖 镜下观察,胎鼠中有例脑出血和例脑水肿。结论弓形虫感染孕鼠,对胎鼠的生长、 发育有影响,且胎鼠有脑出血、脑水肿等病理征。 【关键词】弓形虫、胎鼠、毒性作用/. . ., . / , /., , , , ,,, . , , , ; , ,. ., , , , , .. , ., , . , ,, 西医科火学硕:学位论文 前言 先天性弓形虫病是指母代妊娠期感染弓形虫,经胎盘传播于胎儿,我国约有%的孕 妇可将感染虫体传播给抬。孕妇感染可导致胎儿宫内感染,孕妇出现流产、早产、死 胎等不良妊娠。胎儿出现畸形:脑积水、脑膨出、大脑钙化灶、脊柱裂及视网膜脉络膜炎 和精神、运动障碍。此外,可伴有发热、皮疹、呕吐、腹泻、黄疸、肝脾肿大、贫血、心 肌炎、癫痫等病症【。 国外资料报道,先天性弓形虫病中,%发生视网膜脉络膜炎、%有大脑钙化、% 有意识或运动障碍。美国学者将脉络膜视网膜炎、脑积水、脑钙 化和精神运动障碍 作为先天性弓形虫病四大征象,其中以脑钙化为独特表现。先天性弓形虫病死亡率一般为 %~%,幸存者常有严重的神经系统后遗症,年随访智力低下者占%,癫痫为%, 严重视力缺陷占%~%,脑积水和小头畸形者占%,只有%~%为完全正常儿童。 我国新生儿弓形虫感染的发生率为/~%。由此可见,弓形虫感染宿主导致的先天性 弓形虫病为严重的疾患,应积极预防。 本实验采用个/只经胰酶消化的弓形虫速殖子感染孕中期小鼠,测量胚胎的体重、 身长和尾长。并对胚胎的脑组织进行解剖观察,来证实弓形虫感染母代小鼠是否导致子代 的毒性作用。为探讨先天性弓形虫脑病的机制奠定基础,为干预先天性弓形虫脑病及人类 的优生优育提供理论依据。 .材料和方法 .. 实验动物 /小鼠,清洁级,?,引自中国疾病预防控制中心实验动物研究所,在本实 验室内饲养、繁殖,保持近交。将健康的~周龄/处女鼠与雄鼠:合笼,次 晨查阴栓,查到者计为孕天。将检出的小鼠按先后顺序编号,记录体重。于妊娠第天 再次称重,体重增长.以上者纳为实验鼠。 .. 弓形虫虫株 株弓形虫引自北京大学医学部寄生虫学教研室,本实验室液氮保存,常规复苏,在 /小鼠体内转种三代,用于实验。 ..主要仪器 低速台式离心机?型北京医用离心机厂,恒温水浴锅浙江嘉兴中新医疗仪 器有限公司,普通光学显微镜型同本株式会社,电子精密天平 梅特勒~托利多仪器上海有限公司,解剖显微镜日本株式会社,镀铬游标 卡尺~.,杭州量具厂。 ..实验方法 ... 弓形虫速殖子获取 :医科大学硕学位论文 收集转种三代的染虫孕鼠腹腔液,离心 ,弃上清液,将沉淀物用 无菌洗涤,再次离心,将离心沉淀物用.%胰蛋白酶液稀释,放于。 水 浴锅中消化,再离心,取沉淀物。 ...弓形虫速殖子计数 将离心后留取的沉淀物中加入无菌,震荡稀释,使沉淀物与完全混匀。 取 稀释液加入干净的血细胞计数板,于显微镜下计数弓形虫速殖子,用调整含 虫液的浓度。计算稀释液中弓形虫速殖子的浓度,公式:弓形虫速殖予数/:个大方格 速殖子总数/××稀释倍数。 ...动物分组及处理 将实验/孕鼠?,?周龄只,随机分组:组为正常对照组, 组为染虫组,每组各只。妊娠第天,正常对照组孕鼠经腹腔注射无菌./ 只,组孕鼠经腹腔注射经胰酶消化后的弓形虫速殖子个/./只。于妊娠第天处 死孕鼠,剖腹暴露子宫,打开子宫剥离胎鼠,吸干表面血迹,用止血钳夹住胎鼠近端止血, 从近胎盘处剪断。肉眼观察胎鼠的颜色,判断胎鼠的存活情况,称胎鼠的重量,测量胎鼠 的体长、尾长。同时,解剖胎鼠取脑组织,观察脑有无出血、水肿 等情况,证实弓形虫是 否对胎鼠有毒性作用。 ...结果分析 全部数据采用.统计软件录入并分析,计量资料用?表示,组间比较采用 两个独立样本检验,检验水准.。 . 结果 .. 弓形虫感染对胎鼠的毒性 解剖天的孕鼠取胎鼠、观察,正常对照组胎鼠外观形态正常,颜色红润,有活动, 均为活胎。染虫组胎鼠有活胎,也有颜色呈紫色或黑色的死胎及不成形的吸收胎。称胎鼠 的重量,与正常对照组比较:染虫组胎鼠重量均减轻,差异具有统计学意义.。 测量胎鼠的体长和尾长,均比正常组短,差异比较显著.。见表一 表弓形虫感染对胎鼠的影响 注:木. .. 弓形虫感染对胎鼠脑组织的毒性 在解剖显微镜下剥离胎鼠脑组织,并仔细观察,正常对照组形态 『常,未发现异常 情况。染虫组观察到例脑出血,例脑水肿。 【西医科大学硕士学位论文 .讨论 实验证实,孕鼠感染弓形虫可通过胎盘垂直传播于胎鼠,不仅导致孕鼠流产、早产等 不良妊娠的发生,而且,对子代的生长发育有影响【】。孕期感染弓形虫,可影响子鼠的发 育,使刚出生的子鼠体重与体长低于正常鼠,且子鼠在迷宫实验中的学习能力和分辨能力 降低【?。我们在实验中分别采用无菌./只和胰酶消化的弓形虫速殖子个 /./只,于孕天腹腔接种/小鼠,天剖取胎鼠,观察到:母鼠孕期感染弓 形虫,其胎鼠体重比正常组轻,体长、尾长比正常组短,差异均具有统计学意义.。 可见,弓形虫感染母代宿主可传播于子代,对子代有毒性作用。 近几年,有许多研究证实先天性弓形虫病最严重的即为心脑组织的损伤,本实验通过 观察胎鼠的脑组织,发现染虫组胎鼠有脑出血、脑水肿的病理变化,这与弓形虫感染对脑 组织损伤的研究结论一致引。 目前,弓形虫感染对胎鼠毒性作用的研究多为组织病理学观察,而致病机制方面的研 究较少。但随着相关学科知识的渗透,如蛋白质组学方法的广泛应用,可为先天性弓形虫 病致病机制的探讨提供特异性强、灵敏度高的分子生物学研究方法和手段。 烈医科大学硕士学位论文 第三章 弓形虫感染胎鼠脑组织相关蛋白质样品的制备与分离 【摘要】目的?取弓形虫感染胎鼠的脑组织;?提取胎鼠脑组织的总蛋白;?利用双向凝 胶电泳技术分离脑组织的蛋白。方法?剖取胎鼠脑组织:处死孕鼠,剖腹取胎鼠,开颅取 脑组织,每组取;用洗净后,冻于液氮中备用。?提取胎鼠脑组织的总蛋白质:将 胎鼠脑组织液氮研磨为组织粉末,用硫脲、尿素、等试剂提取两组样本的总蛋白,分 别进行蛋白质定量。?胎鼠脑组织双向电泳:根据蛋白定量结果,每块上样总蛋白, 用双向凝胶电泳仪电泳,每组次,共计块胶图。分离出的蛋白质样本,用软件进行数 据分析,计算灰度值,找出差异蛋白点。将胶图保存在弱酸性缓冲液中,以备后用。结果 ?弓形虫感染胎鼠的脑组织,利用双向凝胶电泳技术分离脑组织 总蛋白,分离到约个 蛋白点。?经蛋白质胶图分析,鉴定出差异蛋白点个。结论在弓 形虫感染胎鼠的脑组织 中约有个蛋白点;经胶图分析、鉴定有个差异蛋白点。对这些蛋 白点需要进行定 性和定量的分析。 【关键词】脑组织蛋白质、双向电泳; ? ;? :? . , , , ; ,.?, ,,.? , . : ?, , , . , ,. .?,. .;. .两医科人学硕卜学位沦文 ,? ?一?.. 日舌 双向电泳是蛋白质组学研究中的核心技术,分辨率高。它是等电聚焦电泳与? 相结合,可将分子量相同而等电点不同的蛋白质及等电点相同而分子量不同蛋白质分开, 进行蛋白质检测。因此,我们利用此技术将胎鼠的脑组织蛋白质进行双向电泳分离,获取 所需的蛋白质胶图,分析比较正常宿主与染虫组是否有差异的蛋白点。 .材料和方法 ..材料与标本来源 ...试剂 尿素、一一胆固醇氨丙基二甲基氨基卜卜丙磺酸、十二烷基磺 酸钠、丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷和低熔点琼脂糖为公司, 蛋白酶抑制剂鸡尾酒片 为公司,甘油、甲醛、戊二醛、乙酸、 乙酸钠、碳酸钠、硫代硫酸钠、乙醇、乙二胺四乙酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸 、磷酸为国产分析纯,购自北京生化化学试剂厂,标准蛋白为公司, 号化学分析滤纸为杭州富阳特种纸业有限公司。硝酸银、二硫苏 糖醇、 碘乙酰胺、过硫酸胺、、均购白公司,溴酚蓝购于公司, 胶条,,、蛋白质分子量、考马斯亮蓝购于 公司。 ...标本来源 /小鼠,清洁级,?,引自中国疾病预防控制中心实验动物研究所,在本实 验室内饲养、繁殖,保持近交。将健康的~周龄/处女鼠与雄鼠:合笼,次 晨查阴栓,查到者计为孕天。将检出的小鼠按先后顺序编号,记录体重。于妊娠第天 再次称重,体重增长.以上者纳为实验鼠。 ...主要仪器设备 冷冻离心机购自公司。超声破碎仪型购自日本公司。 电子天平型购自公司。纯水机型购自 公司。垂直 公司。固相梯度等电聚焦仪和凝胶图象扫描仪:购自 板电泳仪:购自?公司。 . 实验方法 .. 试剂配制 水化上样缓冲液:尿素.,%.,.现加, .%/?现加,.%溴酚蓝,加去离子水定容至,溶解混 匀后分装成小管,每小管,一。冰箱保存。山西医科大学硕士学位沦文 蓝。 贮存液:%乙醇,%磷酸, 贮存液 工作液:双蒸水,%乙醇,%磷酸, , 号滤纸过滤,室温保存于棕色瓶中,在使用前需要再次过滤。 碱,放于洁净的容量瓶中,加入 ./碱.:称取. 约去离子水,搅拌使固体充分溶解,用/调值至.,加去离子水定容 至,?冰箱保存。 重泡涨液:.,.,溴酚蓝痕量用双蒸去离子水调节终体积至, 一。贮存。 胶条平衡缓冲液:?.., ,%甘油,%十二 烷基硫酸钠,用双蒸去离子水调节终体积至,分装成管,一。冰箱保 存。第一次平衡:取上述平衡液,加入二硫苏糖醇 .,充分混匀,现用现配: 第二次平衡:取上述平衡液,加入碘乙酰胺.%/ .,充分混匀,现用现配。 %聚丙烯酰胺贮液:称取丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,先加入去离 子 水,搅拌溶解至溶液变为透明,再加去离子水稀释溶液至,滤纸过 滤后,放于棕色 瓶中?冰箱保存。 %聚丙烯酰胺凝胶:双蒸去离子水.,. .,%丙烯酰胺 /.%甲叉双丙烯酰胺.,% ,取出加 , ,作为 封底液。剩余液加入甩前加,用前加,总体积。 低熔点琼脂糖封胶液:.%低熔点琼脂糖., .,甘氨酸., .%,.%溴酚蓝,加入去离子水定容至。 .%考马斯亮蓝染液/:.考马斯亮蓝,%甲醇,%冰醋酸 ,加双蒸去离子水至,充分搅拌,过滤后使用。加热溶解至澄清, 室温保存。 考染脱色液:%甲醇,%冰醋酸,加双蒸去离子水定容至。 银染液:?固定液:%乙醇,%冰醋酸,加双蒸去离子水定容至。 ?增敏液:乙醇,醋酸钠,戊二醛用前加.,硫代硫酸钠用前加., 加双蒸去离子水至。?银染液:硝酸银.,甲醛,加水至。?显 色液:碳酸钠.,%甲醛用前加,加双蒸去离子水至。?终止液:乙 二胺四乙酸二钠.,加双蒸去离子水定容至。 %:加双蒸去离子水定容至。 ×电泳缓冲液.:称取碱,甘氨酸, ,用双蒸去离 子水调节终体积至,混匀后,室温保存。 。:,储存液:称取。:,.在容量瓶中定容,置于?冰箱存放。 ., 培养基:把干粉袋加入适量去离子水中,加入。., 或 调节值至.,加入去离子水至,用. 搅拌充分溶解,用 的微孔滤膜过滤除菌。 西医科大学硕学化论文 ..组织收集 将实验/孕鼠?,周龄只,随机分组:组为正常对照组, 组为染虫组,每组各只。妊娠第天,正常对照组孕鼠经腹腔注射无 菌./ 只,组孕鼠经腹腔注射经胰酶消化后的弓形虫速殖子个/./只。于 妊娠第天处 死孕鼠,解剖胎鼠取新鲜脑组织。 ..双向电泳蛋白质样品的制备 ,液氮冻融次, ...选取脑组织,液氮研磨后加裂解液,蛋白酶抑制剂 每次,超声破碎, 放置,。条件下离心×,取上清, 一?保存。 ...分别取、、、“、、、牛血清白蛋白,/,待 测样品.,加入到管中,再加入双蒸水调整终体积至,并设复管。 空白调零仅加双蒸水。 ...加入工作液并震荡混匀。 ...各取“加入酶标板中,后测值,并计算待测样品蛋白质含量测 量在内完成。 ..双向电泳 .. 第一向固相梯度等电聚焦 .... 水化上样 从冰箱中取出一。冷冻保存的水化上样缓冲液,置室温溶解。在小管中加入. 和??、各.,充分混匀。取出水化上样缓冲液,水化盘中加入 银染或考染细胞总蛋白样品,充分混匀。将干胶条?,, 线性从一。冰箱取出,室温放置。用加样枪小心的沿着水化盘中槽的边缘从左而 右线性加入样品,避免样品溶液中产生气泡进入,两端各留不加。轻轻地将 胶条胶面朝下放入胶槽,注意正负极。使胶条与电极紧密接触,不要产生气泡。室温放 置后,取卜覆盖油缓慢覆盖胶条目的:防止进行等电聚焦时液体蒸发尿素 析出、蛋白氧化及产生冷凝水。对好正、负极,盖好胶槽盖后置 于固相梯度等电聚焦 仪上。在?设定等电聚焦程序,设置?,一,一, 一,一,?。结束后立即进行平衡,或置于一?冰箱保存。 配制两块%的聚丙烯酰胺均胶质××,待下层分离胶凝固后,灌入 上层浓缩胶,完全凝固后,于?冰箱保存备用。 ....胶条的平衡 等电聚焦结束后,将聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上,将另一张厚滤纸用去 离子水浸湿,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。 每根胶条用含的平衡液平衡两次,每次,第一次为还原过程,平衡液内 列医科大学硕士学位论文 加/ ;第二次为烷基化过程,平衡液内加/碘乙酰胺。平衡过程中, 含样品的胶条的水化盘在摇床上缓慢摇晃。每次结束后彻底倒掉平衡缓冲液,并将胶 条竖在滤纸上吸去多余的平衡液。 将琼脂糖封胶液进行加热溶解。 电泳缓冲液稀释成×电泳缓冲液,赶去上层气 泡。配制好的%的聚丙烯酰胺凝胶从冰箱取出备用。 .... 第二向.电泳 将平衡好的胶条从样品水化盘中移出,用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸在 ×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上,酸性端在左侧,碱性端在右侧碱性端容易泡胀, 放在凝胶的长玻璃板上。用镊子轻推胶条,排除气泡,使之与胶面完全接触。碱性端旁置 蛋白质分子量,与胶条平行放置,在凝胶上方加入低熔点琼脂糖封胶液封胶,放置 ,使封胶液彻底凝固。将凝胶转移至电泳槽中,加入电泳缓冲液,接通电源。起始用 胶电泳,使样品完全走出胶条,浓缩成一条线,换用/胶,直至溴酚 蓝指示剂前沿抵达玻璃板下缘,即可停止电泳。结束后轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶。 .. 染色 ... 银染 ?凝胶在银染固定液中于摇床上固定,在增敏剂中增敏,用去离 子水洗×。之后在银反应液中反应,再用去离子水洗×。用新鲜配制 的显色液显影约直至蛋白点出现后倒掉显影液,用终止液终止,最后用去离 子水洗×。 ...考马斯亮蓝染色 取出凝胶板,置于足量的考马斯亮蓝染液中,于摇床上染色小时以上;染色 结束后倒掉染液。加入脱色液,在摇床上脱色过夜,直至背景脱净为止。 ..蛋白图象采集与分析 ... 双向凝胶电泳图象采集 双向电泳后的凝胶放置在扫描仪平板上适当位置,在胶块与扫描仪玻璃板之间小心滴 加双蒸水赶走气泡,滤纸吸干周围多余水分。 进入 扫描应用软件的扫描方式。 确定扫描范围,预览扫描结果图象。 调整扫描窗口大小和扫描设置参数并重新预览结果。 选择适当的扫描区域,启动扫描程序。 扫描灰度尺并进行亮度矫『。 对图象进行角度矫正、噪声过滤等进一步修正。 发送图象至的软件分析程序进行下一步凝胶图象的分析。西医科大学硕学位沦文 ...双向凝胶电泳图象分析 检测 激活点检测向导,选择凝胶中需要检测的面积,通过调整向导中设置的算子数和灵敏 度等参数确定被检测的点,进一步进行手工编辑,调整峰值、边缘以及利用子模式中的增 删、分割等功能反复操作直至满意检测出图像中所有的点。 背景扣除 使用软件程序按照非点模式对背景强度进行计算机完全自动化背景扣除,在点密集处 设置抽样区域,程序自动运算产生背景强度图后,进行手工背景扣除。 匹配 在已经进行完点校正检测的凝胶之间找出代表同一蛋白质的点,以比较不同凝胶中的 蛋白表达情况。激活主工具栏中的匹配按钮,设置进行匹配的参数,点击参考点和对比点, 产生匹配向量线,观察重叠匹配的效果以及匹配趋势。 标准化 激活标准化导航,设定标准化参数,对点的量值进行标准化运算,设置标准化域查看 实验数据,通过表达、剪辑、图形等窗口显示凝胶中精确的各点检测值,在不同凝胶之间 进行点的精确对比。 图象较正 分为三种:第一、光强度校正。定义灰度尺数值点和尺列表,设置灰度尺单位并选择 线性对数曲线,放置样点,对所有凝胶进行校正。第二、单向校正。建立? 的分子量梯度,精确放置分子量梯度的梯档,使之与凝胶两侧显示的标准分子量蛋白泳道 中的相应条带位置对齐,执行分子量校正,选择梯度?,调整并将梯度垂直放置在 凝胶对应位置,校正凝胶值。第三、双向校正。激活双向校正按钮,创建一个蛋白列 表加入蛋白相关描述和数据,将这些蛋白指定给参考胶,进行双向校正。 建立凝胶和点的实验数据 ..差异点的标示 本研究鉴定出来的差异蛋白点标示在相应的分析胶上,弓形虫感染的胎鼠脑组织细胞 和正常对照组胎鼠脑组织细胞中高表达、低表达和特异性表达的蛋白点用阿拉伯数字标 示,排列先后顺序不代表任何意义。 ..统计学方法 不同样本之间的各蛋白点的表达量用?方法进行检验判定其差异 是否具有统计 的检验方法来判定其 学意义。相应的差异蛋白点是否可作为标志蛋白,用 统计学意义。.为具有统计学意义。 .结果 .为了观察和探讨弓形虫感染孕鼠后胎鼠脑组织中蛋白质表达的变化,我们收集了弓形 山西医科大学硕士学位论文 虫感染组和正常对照组胎鼠的脑组织,进行裂解,经第一向等电聚焦和第二向? 垂直平板电泳,对胎鼠脑组织的蛋白质进行分离、显色,建立了两组的蛋白质图谱见图。并用 .软件分析及手工分析的方法,对两组蛋白质图谱进 行了比较和分析,发现每块一胶图上可以分离出约个蛋白点,不同批次之间的匹 配率为%,但每种蛋白质点的强度变化无显著差异。 聚 一 萋 蔫沁嚣。 ‘ .。 ‘“。 乡。 摊氇 ’ 一 ? 霉 ??????????、。..一...?瞄迅。. 正常对照组 弓形虫感染组 .软件 图、 结果 .将两组胶图分析到的个蛋白点经过软件分析和人工对比,我们 共发现了个蛋白 点,它们的表达量具有显著性差异,其分子量多分布于之间,等电 点为之间 ’ ?一钆:。‘。。,奄;筘 .??、 一删啊????’一鬲’??? .一一一~?濑,皇?一 正常组 图、胎鼠脑组织差异蛋白点幽医科大学硕:学位论文 .讨论 双向电泳可以将蛋白质按照不同等电点和分子量逐一分开,具有 分辨率高的优点。但 是,由于样品制备时蛋白的丢失,胶条的范围的限制和胶块对蛋白分子量的局限性, 不能观察到整个细胞的全部蛋白质。而且,实验中试剂的选择、样品的制备、上样量的多 少、胶条的平衡时间、垂直电泳分离的时间、染色方法的选择以及蛋白质的修饰作用都会 对最后结果造成较大的影响。 我们利用双向电泳技术分离到约个蛋白点,经过分析和比较最终得到个差异 显著的蛋白点。但是,这些蛋白点的种类、结构、功能以及这些蛋白在先天性弓形虫脑病 中的致病机制都是未知的,所以我们需要用生物质谱的方法进一步的进行分析。山西医科大学硕::学位论文 第四章弓形虫感染相关差异蛋白质谱鉴定与 生物信息学分析 【摘要】目的用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定弓形虫感染小鼠脑组织的差异 蛋白点:对鉴定出的蛋白质用生物信息学软件分类和功能分析。探讨这些蛋白质在先天性 弓形虫脑中的致病作用。方法切取胶块上的差异蛋白点,进过蛋白酶解和肽段提取, 用工一 进行肽质量指纹图谱鉴定,鉴定后用进行数据库检索,对图谱进 行分析,根据系统打分值的高低、分子量、等电点、序列覆盖率等信息判断鉴定的可靠性。 根据数据库鉴定得到的蛋白质进行分析,对蛋白进行功能分类,利用分析 的结果探讨特异性蛋白是否与先天性弓形虫脑病发生有相关性。结果个表达差异显著 的蛋白点经过鉴定和功能分析,主要是以下几种:结蛋白和肌动蛋白是维持细胞结构的蛋 白;血清白蛋白具有抑制血小板聚集、抗凝血和维持血液胶体渗透压的作用;葡萄糖调节 蛋白是一种应激蛋白,可以保护细胞结构;蛋白质二硫键异构酶可催化蛋白质二硫键的形 成和错配二硫键的修整;膜联蛋白参与细胞膜表面的物质转运。这些蛋白在弓形虫感染鼠 分析和生物信息学的手段对个 脑组织中的表达均低于正常鼠。结论利用? 特异性蛋白点进行分类和功能分析。发现主要是肌动蛋白、结蛋白、血清白蛋白、蛋白质 这些蛋白在染虫鼠脑组织中低表达,说明弓 二硫键异构酶、膜联蛋白和葡萄糖调节蛋白, 形虫对宿主脑组织细胞的结构和功能有影响, 可引发先天性弓 形虫脑病。此研究为先天性 弓形虫脑病的诊断及治疗奠定了理论基础。 【关键词】蛋白质组、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱【】 ; . , ., , , ,, ., ,四医科人学硕:学位论文; : ; , ,,; ;. , . . ,,,,. . , , ’. , ., ? 一?. 丑舌 ? 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术是把样品分子离子化后, 根据不同离子间质核比/的差异来分离并确定相对分子量。由于分子质量是一个蛋 白质、多肽或氨基酸最基本的特征,所以利用蛋白质的分子质量可区分氨基酸的组成、序 列、修饰方式、蛋白质问的结合方式和位点的差异。 应用生物质谱技术鉴定蛋白质主要是根据蛋白质酶解后的肽指纹谱 ,和肽序列信息去搜索蛋白质或核酸序列库。该方法与传统方法相 比,? 技术具有灵敏度高,速度快、通量大的优点,适用于双向凝胶电泳分离 的蛋白质的鉴定,也是目前蛋白质鉴定最有效的方法。因此,我们在实验中用对获取 的个差异蛋白点进行鉴定,并用生物信息学软件在数据库中检索,对蛋白功能进行分 析,探讨这些蛋白在先天性弓形虫脑病中的致病作用,为先天性弓形虫脑病的机制和诊治 提供理论依据。 .材料和方法 ..材料与标本来源 ... 试剂 三氟乙酸公司,乙腈公司,测序级经修饰的胰蛋白酶 峨医科大学硕卜学位论文 诊断公司,一氰基~羟基肉桂酸 ,, 为公司,娃哈哈纯净水。 ...标本来源 按照第三部分双向电泳的方法,在弓形虫感染孕鼠后,取胚胎脑 组织,将蛋白的上样 量增大为,并且用考马斯亮蓝染色。双向凝胶电泳匹配后找到的 差异蛋白点。由于 有的蛋白点含量较少我们采取多块胶复集的方法达到检测需要 的量。 ...主要仪器设备 ? 型质谱仪购自公司。水浴锅购自北京市长风仪器仪表公司。 . 实验方法 .. 试剂配制 基质用溶剂:%乙腈的水溶液,加入.%。 脱盐液:%乙腈的水溶液,加入%甲酸。 洗脱液:%乙腈的水溶液。 饱和溶液:取过量,加入饱和用溶液,充分震荡使下面沉淀清晰可见,最后离 心?保存。 ..肽质量
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