吸氧浓度对心肺复苏大鼠神经元特异性烯醇化酶和S100β蛋白的影响

吸氧浓度对心肺复苏大鼠神经元特异性烯醇化酶和S100β蛋白的影响 论文目: 吸氧浓度对心肺复苏大鼠神经元 特异性烯醇化酶和S100β蛋白 的影响 专 业: 病理与病理生理学 学位类型: 学术型 ? 专业型 ? 学 号: T2012003 论文相关领域1: 心肺复苏 论文相关领域2: S100β蛋白 论文相关领域3: 神经元特异性烯醇化酶 论文相关领域4: 论文相关领域5: 要求: 1、 论文题目及学号均用小二号字宋体加粗。 2、 论文在页面左侧简单装订即可。 3、 不包含在学期间科研成绩、致谢和个人简介。 4、 论文中组织学、电泳等图片必须为彩色照片。 目 录 一、摘要 中文论著摘要---------------------------------------------------------------1 英文论著摘要---------------------------------------------------------------4 二、英文缩略语???????????????????????7 三、论文 前言 ?????????????????????????8 实验材料与方法?????????????????????13 实验结果????????????????????????20 讨论??????????????????????????24 结论??????????????????????????29 四、本研究创新性的自我评价?????????????????31 五、参考文献????????????????????????32 六、附录 综述??????????????????????????38 0 ?中文论著摘要? 吸氧浓度对心肺复苏大鼠神经元特异性烯醇 化酶和S100β蛋白的影响 目 的 通过建立与成人窒息致心脏骤停( cardiac arrest，CA )更为接近的大鼠模型，模拟临床实际情况，观察给予不同浓度氧气进行心肺脑复苏( cardiopulmonary cerebral resuscitation,CPCR )时大鼠血清神经元特异性烯醇化酶( neuron-specific enolase,NSE )、S100β蛋白水平的改变，意在证实心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation，CPR)、高级生命支持过程中，吸氧浓度与CA大鼠心肺复苏的预后是否相关，为探索给予不同浓度氧气进行CPCR对脑复苏结局的影响开拓思路，并为寻找最佳的氧浓度预防和干预脑损伤提供实验依据。 方 法 选取成年SD雄性大鼠32只，按随机原则分成4组,每组8只:第1组只行麻醉，进行气管插管和血管穿刺，无CA和CPCR过程，为空白对照组。建立CA/CPCR模型，分别给予21%( 第2组 )、50%( 第3组 )和100%( 第 4 组 )浓度的氧气。不同吸氧浓度组大鼠麻醉后心电监护、气管插管并接小动物呼吸机，于呼气末夹闭气管，造成窒息致CA，立即开放呼吸机，各组大鼠吸入不同浓度的氧气，给予胸外按压，静脉注 1 入肾上腺，使得大鼠恢复自主呼吸循环，停止CPCR。对所有大鼠按照改良大鼠神经功能评分标准进行神经功能评分;分别复苏成功后0.5h、3h、6h大鼠血清NES、S100β蛋白浓度。所有大鼠于复苏成功后6h停止机械通气，拔除气管插管。若操作过程中大鼠死亡，选择与之相近的备用大鼠重新进组，死亡大鼠不进行最后的结果分析。 结 果 实验过程中未出现大鼠死亡，各组使用的大鼠鼠龄、体重比较差异无统计学意义( P,0.05 )，具有可比性。(2)S100β蛋白浓度空白对照组水平一直较低，其余3组均于复苏成功后逐渐升高，并于复苏后3h达到高峰。(3)与空白对照组进行比较，复苏组大鼠血清NSE浓度随复苏的时间不断延长逐渐升高。(4)不同氧浓度组间对比:与第2组进行比较，第3组、第4组大鼠血清NSE、S100β蛋白水平较低，差异有统计学意义( P,0.05 )，第3组大鼠血清NSE、S100β蛋白水平较第4组低，差异有统计学意义( P,0.05 )。(5)与对照组相比，第3组大鼠的改良神经功能评分相对较高，差异有统计学意义( P,0.05 )，第4组评分相对次之，差异有统计学意义( P,0.001)，第2组评分相对较低，有显著差异( P < 0.001 )，提示过高的吸氧浓度对大鼠预后不利，过低的吸氧浓度不足以大鼠机体利用。 结 论 2 实验表明，常规吸入100%浓度的氧气，大鼠脑组织可发生氧化性损伤，不利于预后;吸入50%浓度氧气的大鼠的血氧浓度就优于吸入100%浓度氧气的大鼠，因此，没有必要为防止CA/CPCR过程中的低氧血症而给予高浓度的氧气吸入，这需要进一步更多实验的证实;但21%浓度的氧气不足以满足大鼠脑组织的氧需求，最佳吸氧浓度仍需进一步实验去探讨。 关键词 NSE;S100β蛋白;心脏骤停;心肺脑复苏 ?英文论著摘要? 3 The Influence of oxygen concentration on neuron-specific enolase and S100β protein after cardiopulmonary resuscitation in rats Objective To establish a rat model cardiac arrest which close to the model of adults, simulate clinical practice,observe the change of neuron-specific enolase and S100β, to explore the effects of different concentrations of oxygen resuscitation cerebral resuscitation outcome explore new ideas, find the best oxygen concentration, for prevention and intervention to provide experimental evidence of brain injury. Methods Selected 32 SD rats,randomly divided into 4 groups eaually.Group 1 only surgical preparation, the other three groups were given 21% (Group 2), 50% oxygen (Group 3) and 100% (Group 4) concentration.0.5h, 3h, 6h serum NES, S100β concentrations were detected after successful resuscitation.All rats stoped mechanical ventilation after successful resuscitation 6h,if the death occurred during the rats, again with similar alternate choice to r 4 e-enter the group of rats, the rats died without final results analysis. Results (1) No deaths occurred during the experiment, the difference of age and body weight in each group were not statistically significant ( P > 0.05 ). (2) The level of S100β protein concentration in the control group has been low, gradually increased after the other three groups were associated with successful resuscitation, and peaked at 6h after resuscitation. (3) Compared with the control group, the recovery group NSE concentration gradually increased. (4)Comparison between different oxygen concentratio the third group and the fons:compared with the second group， urth group of rats serum NSE and S100βprotein were lower ( P < 0.05 ). The third group of rats serum NSE concentration, S100β protein although lower than the fourth group,but the difference was statistically significant ( P < 0.05 ). Conclusions During the course of the CPCR, different concentrations of inspired oxygen, resuscitation good recovery than air, the recover 5 y of different oxygen concentrations, the effect may not be the same. Key words Neuron-specific enolase; S100β protein; Cardiac arrest; Cardiopulmonary cerebral resuscitation 6 ?英文缩略语表? 英文缩写 英文 中文 CPR Cardiopulmonary resuscitation 心肺复苏 CA Cardiac arrest 心跳骤停 Fraction of inspired oxygen Fi0 吸入氧浓度 2 concentration ROSC Restoration of spontaneous circulation 自主循环恢复 SBP systolic blood pressure 收缩压 PaC02 Arterial carbon dioxide partial pressure 动脉二氧化碳分压 Pa0 Arterial oxygen partial pressure 动脉氧分压 2 I/R Ischemia-reperfusion 缺血再灌注 MAP Mean arterial pressure 平均动脉压 CPCR Cardiopulmonary cerebral resuscitation 心肺脑复苏 ELISA enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验 神经元特异性烯醇NSE Neuron-specific enolase 化酶 PH hydrogen ion concentration 氢离子浓度指数 KCl Potassium chloride 氯化钾 7 ?论文? 吸氧浓度对心肺复苏大鼠神经元特异性烯醇 化酶和S100β蛋白的影响 前 言 心脏骤停( cardiac arrest，CA )是临床上最危重、最紧急的病症之一，死亡率高并具有显著神经系统并发症。心肺复苏( cardiopulmonary resuscitation,CPR )是挽救CA患者的重要措施，早期启动并进行高质量的CPR是增加院外CA患者生存机会的关键举措。近些年来，随着急救技术的不断进步、急救的不断完善以及急救知识的不断普及，不管在院内发生CA还是在院外发生CA，大部分患者都能得到及时有效的救助以及治疗，其中大部分的患者也都能够达到自主循环恢复( restoration of spontaneous circulation，ROSC )，在一些发达国家和地区 ROSC 率 [1-2]能够达到40 % ~ 60 %。但是部分患者会出现一些脑损伤的表现，如昏迷、意识障碍、慢性伤残等，这也是导致CA患者病情加重甚至死亡的原因之一，而CPCR后患者的最终治疗目标是使患者的神经功能完全恢复正常 [3]并最终能够出院。如何提高心肺脑复苏(cardiopulmonary cerebral resuscitation,CPCR)的成功率是我国乃至全球医务工作者需要努力解决的难题。 8 一直以来，医务人员在进行CPCR时普遍使用100%浓度的氧气作为复苏气源，以达到窒息患者在短时间内能够吸入更多的氧气的目的，以便缓解患者的缺氧状态，这种做法看起来似乎非常符合逻辑，因此在惯性思维方式下，很少有医务人员对100%浓度的氧气的疗效和安全性有疑问，应用100%浓度的氧气进行CPCR一直占据主导地位。后来，随着氧自由基的发现以及再灌注损伤理论的确立，医务人员开始了解氧的毒性作用，氧自由基的作用也得到了越来越多医务人员的重视。 [4]有报道认为高氧成为心脏骤停患者复苏后死亡的独立危险因素。给患者吸入的氧浓度越高，随之产生的氧自由基就越多，由此对组织造成的破坏可能就越大。所以，医务人员开始质疑100%浓度的氧气治疗CA患者的做法。由于这些原因，医务人员开始意识到是到了应该重新评价CPCR时应该给予患者多少氧浓度更合适的时候了。但应用100%浓度的氧气进行CPCR是否与空气(浓度为21%的氧气)进行CPCR的效果是一样的，或哪一种氧气浓度更具有优势，目前还没有完整的结论。自20世纪90年代开始，有人对应用100%浓度的氧气进行CPCR提出了置疑，开始研究应用空气作为复苏起源进行CPCR。有报道首次应用缺血缺氧性脑病新生猪模型对100%浓度的氧气CPCR与空气CPCR进行了比较性的研究，结果发现，两组新生猪的平均动脉压、心率、剩余碱、pH 值及血浆次黄嘌 9 呤恢复至正常的速度一样。其后的动物研究亦发现对于心输出量、脑血流量、脑血管阻力、各脏器的局部血流以及血压与血气恢复情况，空气复苏组与100%浓度的氧气复苏组之间进行比较，差别不大。但是也有研究表明，应用100%浓度的氧气进行CPCR时，脑皮质次黄嘌呤的活性恢复比较慢，Na-K-ATP 酶活性恢复更加困难，皮质产生的氧自由基更多，髓鞘损害更严重。应用100%浓度的氧气行CPCR的大鼠的大脑皮层细胞外次黄嘌呤水平升高明显，这表明100%浓度的氧气可能对大脑皮层和血脑屏障造成损害。在随后的临床研究中发现，应用空气作为复苏气源进行CPCR与应用100%浓度的氧气作为复苏气源进行CPCR对新生儿大脑的影响差异无统计学意义。还有临床研究表明:对于窒息的新生儿进行复苏，在选择复苏气源的时候，空气和100%浓度的氧气进行比较，空气能降低窒息新生儿的病死率，而且不增加新生儿缺血缺氧性脑病的发生率和复苏失败率。但是，根据现有的资料不能够说明应用空气作为复苏气源进行CPCR就优于应用100%浓度的氧气作为复苏气源进行CPCR，但可以说明在新生儿CPCR的过程中空气与100%浓度的氧气效果是一样的，不管是短期治疗效果还是长期的预后效果差异无统计学意义;而且应用空气作为复苏气源进行CPCR降低新生儿机体内的氧化应激反应，由此避免了高氧血症对机体造成的损害。尽管如此，经过循证医学的荟萃分析和论证，结果认为 10 目前还没有充足的证据来推荐使用空气作为复苏气源进行CPCR。 近年来有人提出了浓度氧的概念，美国是较早开展浓度氧进行CPCR的国家，但我国到目前为止还缺乏应用浓度氧进行CPCR的相关临床研究报道，缺少我国浓度氧复苏窒息患者的本土循证医学证据，目前急需开展寻找适合我国国情的复苏气源选择方面的研究工作。关于这方面的研究，目前我国的临床研究的研究对象大多是新生儿，动物实验的研究对象则是新生动物，还没有以成年人或成年动物为研究对象，并以新生动物缺血缺氧性脑损伤为研究模型，没有进行CA的环节，从而不能很好地反映窒息-CA-复苏的真实过程。因此，为使选择复苏气源问题的动物实验内容更接近人类CPR的过程，建立更为合理的动物模型是十分有必要的。 CPCR后脑损伤是影响患者生存率的重要原因，尽管目前CPCR后脑损伤治疗技术有了显著的提高，但仍然难以量化脑损伤后持续继发性损害的程度。CPCR后的延续治疗中多数都是以药物治疗为主，然而药物治疗的过程中有众多失败的病历，预测CPCR后脑损伤程度是治疗策略的重要组成部分。早期识别和预测神经元损伤对预后是至关重要的。然而，目前神经元损伤很难预测，尤其是存在大量脑损伤的情况下，因此，寻找一个可靠的标记物来预测神经元损伤对中枢神经系统感染的预后判断是有价值的。了解脑损伤生化指标的意义就凸显出来了，这对改善预后也有至关重 11 要的意义。由于缺氧造成脑损伤，血清生物标记物的浓度可能会提供相关的相对重要的病理生理学客观信息。血清S100β蛋白和血清神经元特异性烯醇化酶( neuron-specific enolase，NSE )是判断脑损伤的敏感指[5]标。血清NSE和S100β蛋白水平增高与缺血性脑损伤和心脏骤停后预 [6]后较差成正相关。有数据表明，在测定成人和儿童血清中的生物物如S100β蛋白和NSE等，可以判断神经系统感染和损伤的程度，反应对 [7][8]治疗效果的病理生理机制。?urek J等的研究也表明生物标志物水平如S100β蛋白和NSE对预测的儿童脑损伤非常有用。 S100β蛋白是细胞质钙结合蛋白，是脑特异性蛋白之一，在中枢神经 [9]系统中主要由星形胶质细胞表达，调节细胞内和细胞外钙的活性，虽然S100β蛋白的分泌机制尚不清楚，但当发生神经损伤时，该蛋白在脑脊液(CSF)和血清中的含量增加，如外伤性脑损伤、蛛网膜下腔出血以及脑梗塞、心跳骤停，血清和脑组织中S100β蛋白含量的改变可作为中枢神经 [10-14]系统损伤较特异和灵敏的标志。S100β的释放是独立于自然的细胞死亡和细胞外介质的一种状态,S100β蛋白浓度变化表示神经元损伤的程度[15]。实验证据表明，患有肺炎球菌性脑膜炎的兔子脑脊液中S100β蛋白 [16]浓度增加。细菌性脑膜炎患儿S100β蛋白水平升高与脑部病变发生的 [17]风险有关。 12 NSE是神经元和神经内分泌细胞内的几乎完全糖酵解酶。NSE水平在估计神经元损伤和患者的严重的临床表现，例如中风、头部外伤、缺氧性 [18]脑病、脑炎和癫痫持续状态观察是有用的。NSE的变化有助于判断神经元等有无损害。本研究旨在通过建立与成人窒息CA更为接近的大鼠模型，结合临床实际工作中的情况，观察应用不同浓度氧气作为复苏气源进行CPCR时大鼠血清NSE、S100β蛋白水平的改变，为探索应用不同浓度氧气作为复苏气源进行复苏对脑复苏结局的影响开拓思路，并为寻找最佳的氧浓度预防和干预脑损伤提供实验依据。 实验材料与方法 一、实验材料 (一)仪器与设备 DW-3000B小动物人工呼吸机(北京众实迪创科技发展有限责任公司) TY系列医用空气压缩机(博迈瑞压缩机械有限公司) KD-300C持续正压通气系统(北京康都) 多参数监护仪MP30(德国飞利浦公司) 微量注射泵TE-311(日本泰尔茂公司) 血气分析仪(丹麦) 13 高速低温离心机himac CR21(日立) 16G静脉穿刺导管 打印机(德国) DK-600电热恒温水浴箱(上海贺德实验设备厂) ELX-800酶标仪(宝特，美国) 台式普通离心机(上海安亨科学仪器厂) 低温冰箱(Forma公司) 上海申能7600生化仪(上海申能生物技术有限公司)。 (二)试剂与药物 盐酸氯胺酮注射液 江苏恒瑞医药股份有限公司 盐酸肾上腺素注射液 无锡济民可信山禾药业股份有限公司 15%氯化钾注射液 中国大冢制药 0.9%氯化钠注射液 中国大冢制药 5%葡萄糖氯化钠注射液 中国大冢制药 多聚甲醛(化学纯) 上海溶剂厂 S100β蛋白ELISA SIGMA公司 (三)实验动物 健康 Sprague Dawley 雄性大鼠32只，体重300,350g，日龄68,78d，禁食12小时，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。按随机原 14 则分成4组，每组8只:第1组只做麻醉、气管插管和血管穿刺，无CA和CPR过程，为空白对照组。建立CA/CPCR模型，分别给予21%( 第2组 )、50%( 第3组 )和100%( 第4组 )浓度的氧气。分别检测复苏成功后0.5h、3h、6h大鼠血清NES、S100β蛋白浓度。所有大鼠于复苏成功后6h停止机械通气，拔出气管插管。若操作过程中大鼠死亡，选择与之相近的备用大鼠重新进组，死亡大鼠不进行最后的结果分析。 二、实验方法 (一)模型制备 1、外科准备 健康SD雄性大鼠32只，体重300,350g，日龄68,78d，术前禁食12h，称重，应用氯氨酮10mg/100g经腹腔注射进行麻醉。将大鼠固定于大鼠手术台，备皮，切开大鼠颈部正中，分离软组织，暴露气管并插入16G静脉穿刺导管，结扎固定;分离右侧股静脉，置入套管针，以2 ml/min 的速度持续静滴 0.9% 生理氯化钠溶液，分离右侧股动脉接动脉血压监测装置，监测血压，静脉采血待化验，同时采股动脉血液进行血气分析。 2、制备心肺复苏模型 外科准备操作完成并稳定 30 min 钟后，夹闭插入气管中的 16G静脉穿刺导管体外部分，并静脉推注 4? 氯化钾( 0.12ml/100g )致大鼠呼吸心跳停止，待动脉收缩压( systolic blood pressure，SBP )降至 25 mmHg( 1 mmHg = 0.133 kPa )，持续 5 min，连接小动物呼吸机进 15 行机械通气，呼吸机设置:呼吸频率为80次/分，潮气量为2.5ml，第2-4组小动物呼吸机气源为空氧混合气体，氧气浓度分别为21,、50%、100%，同时静脉推注肾上腺素0.01mg/kg并进行胸外按压，按压频率大于100次/分，按压深度为大鼠胸廓前后径的1/3，记录动脉收缩压等参数。ROSC判断标准:大鼠出现自主心搏、SBP不低于60mmHg并持续10min以上;如持续心肺复苏3min，未出现自主心搏则试验终止。ROSC小鼠继续给予呼吸机支持(不改变参数设置)持续60min，若大鼠自主呼吸能满足自身需要，则拔除气管导管，修复好气管，结扎右股动脉、右股静脉，缝合手术伤口，每 6 小时给予 5 ml 5,GNS腹壁皮下注射。 参照实验研究的Utstein模式进行实验参数设计和实验记录。 3、记录各组大鼠基线及CA/CPR/ROSC后6小时的心率、动脉收缩压、动脉血气等基本参数变化。 4、记录循环停止时间(TCA)及自主循环恢复时间(TROSC): 循环停止时间(TCA):从实验开始到SBP降至25mmHg的时间;自主循环恢复时间(TROSC):从开始心肺复苏至出现自主心搏且SBP不低于60 mmHg的时间。 (二)标本采集、制备 复苏后 2.5小时再次以氯胺酮(10mg/100g)进行麻醉，采股动脉血液 16 进行血气分析。复苏成功后分别于0.5h、3h、6h采集静脉血1ml，置于含促凝剂和去蛋白剂的密封EP管中用于测定血清NSE和S100β蛋白，送航天中心医院检验科进行化验。0.5小时内以4? 4000r/min 离心15分钟，分离血清至于EP管内密封，至于零下80摄氏度冰箱保存待测。 1、血清S100β蛋白、NSE的测定 采用ELISA测定。采用美国ADLS100β蛋白ELISAKit和NSEELISAKit，检测灵敏度均为0.01ug,L。血清S100β蛋白、NSE ELISA测定步骤基本相同，严格按照说明书操作，具体如下: 80?冻存的血清标本恢复到室温待测; (1)- (2)取出酶标板，依照次序分别对应加入100ul标准品于空白微孔中; (3)分别标记样品编号，加入100ul待测血清于空白微孔中; (4)在标准品孔和血清孔中加入50ul的酶标记溶液，轻轻混匀15秒; (5)室温下(20?左右)孵育反应90分钟; (6)洗板机清洗5次，每次静止15秒; (7)每孔加入底物A、B液各50ul，轻轻混匀5秒; (8)室温下(20?左右)避光孵育反应15分钟; (9)每空加入501ul终止液，混匀终止反应，使得液体由蓝色全部转为黄色; 17 (10)30分钟在ELX-800酶标仪于450nm波长下测定OD值。 (三)神经功能评分( NDS ) 对基线和ROSC后6h存活大鼠从意识、基本反射、运动、感觉、行为学等方面进行神经功能评定(表1)。 (四)统计学处理 采用 SPSS19.0 统计软件进行统计分析，计量资料用均数?标准差(x?s)表示，两组间比较用t检验，多组间两两比较用单因素方差分析。不同指标间的阳性表达采用 Spearman 等级相关检验，显著性差异以 P < 0.05 为准。全部资料的统计学分析均采用在计算机上分析完成。 附表1 NDS评分 A大体表现(19分) 1意识 正常 木僵 5 昏睡 0 0 自动睁疼痛刺激睁不能睁唤醒 3 1 0 眼 眼 眼 呼吸 正常 6 异常 0 无 0 B脑干功能(21分) 嗅觉 有 3 弱 1 无 0 视觉 有 3 弱 1 无 0 瞳孔反射 有 3 弱 1 无 0 角膜反射 有 3 弱 1 无 0 惊吓反射 有 3 弱 1 无 0 18 腮须反射 有 3 弱 1 无 0 吞咽反射 有 3 弱 1 无 0 C运动评估(6分) 左侧肢体肌力 正常 3 僵硬/松弛 1 瘫痪 0 右侧肢体肌力 正常 3 僵硬/松弛 1 瘫痪 0 D感觉评估(6分) 快速回左侧肢体疼痛刺激 3 弱，异常 1 无反应 0 缩 快速回右侧肢体疼痛刺激 3 弱，异常 1 无反应 0 缩 E运动行为(6分) 步态平衡协调 正常 3 异常 1 无 0 木条平衡试验 正常 3 异常 1 无 0 F行为学(12分) 翻正反射 正常 3 异常 1 无 0 负向趋向性 正常 3 异常 1 无 0 视觉平衡 正常 3 异常 1 无 0 胡同转身试验 正常 3 异常 1 无 0 1G惊厥(10分) 无 局部 5 全身 0 0 结 果 一、各组大鼠间心跳骤停及心肺复苏的相关参数比 较 (一)各组大鼠体重及时间CA-CPR比较 各组间体重、实验开始至CA的时间和CA-CPR到ROSC的时间比较差 19 异无统计学意义( P > 0.05 )，具有可比性(表2)。说明不同吸氧浓度对大鼠CA/CPR存活率没有影响。 表2 各组大鼠体重及复苏参数比较(x?s) 窒息至CA CA至ROSC 组别 N 体重(g) 时间(min) 时间(min) 第1组 8 311.38?23.54 - - 第2组 8 310.45?24.38 3.8?1.0 16.4?2.1 第3组 8 316.39?19.40 4.6?1.2 14.5?2.3 第4组 8 306.75?14.78 3.5?1.4 15.6?2.2 (二)各组基线和处死前的动脉血气分析变化: 各组实验CA-CPR前的动脉血气分析统计学，P>0.05，无明显差异。处死前动脉血气分析的PH值较基线有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05);PaCO2比较亦无统计学差异(P>0.05)，但各组间PaO2比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，表明PaO度显著相关，吸氧浓与吸氧浓2 度越高，氧分压越高 (表3-4)。 二、神经功能评分 对各组实验动物用改良大鼠神经功能评分法进行评分(表5)，空白对照组(假手术组)评分正常，CA/CPCR各组神经功能评分均比空白对照组下降，第3组组评分相对较高，有显著差异(P<0.05)，第4组评分相对次之，有 20 显著差异(P<0.05)，第2组评分相对较高，有显著差异(P<0.05)，提示过高 的吸氧浓度对大鼠预后不利，过低的吸氧浓度不足以大鼠机体利用。 表3 各组及对照组基线的动脉血气变化(x?s) PaCO2PaO 2 组别 PH (%) SaO2 (mmHg) (mmHg) 第1组 7.38?0.03 34.5?2.27 108.1?3.6 98.5?1.31 第2组 7.36?0.06 33.8?2.8 106.1?4.3 98.8?1.0 第3组 7.33?0.07 35.0?2.7 108.1?3.6 97.8?1.2 第4组 7.37?0.04 34.8?2.1 107.8?4.1 99.3?0.89 表4 各组及对照组ROSC后3小时的动脉血气变化(x?s) PaCO2 组别 PH PaO(mmHg) SaO(%) 22 (mmHg) 第1组 7.25?0.06 34.4?3.7 108.9?4.0 99.1?1.1 第2组 7.10?0.09 35.6?2.8 74.8?16.6 93.9?2.0 第3组 7.17?0.02 36.0?2.6 127.6?4.5 96.4?1.5 第4组 7.18?0.02 34.0?3.3 348.6?9.3 99.8?0.5 表5 各组大鼠神经功能评分比较(x?s) 组别 NDS评分 P值 第1组 80.00?0.0 **第2组 53.10?14.01 <0.001 *第3组 79.13?13.71 0.041 **第4组 69.72?2.82 <0.001 *** 注:与第1组进行比较，P<0.05，P<0.001 21 图1 各组大鼠神经功能评分比较 三、各组血清NSE浓度、S100β蛋白比较 (一)血清S100β蛋白 空白对照组水平一直较低，其余3组均于复苏成功后逐渐升高，并于复苏后3h达到高峰(表6)。 (二)血清NSE浓度 与空白对照组进行比较，复苏组(第2-4组)大鼠血清NSE浓度逐渐升高(表7)。 (三)不同氧浓度组间对比 与第二组进行比较，第三组、第四组大鼠血清NSE浓度、S100β蛋白较低，差异有统计学意义(P,0.05)，第三组大鼠血清NSE浓度、S100β蛋白较第四组低，差异有统计学意义(P,0.05)。 表6 各组大鼠血清S100β蛋白浓度比较(x?s，μg/L，N=8) 22 组别 0.5h 3h 6h 第1组 0.72?0.05 0.82?0.05 0.78?0.05 第2组 0.84?0.10 1.74?0.07 1.45?0.10 ***第3组 0.73?0.06 1.26?0.07 1.17?0.07 *a*a*a第4组 0.86?0.10 1.76?0.10 1.48?0.11 * 注:与第1组进行比较，P<0.05;与第2组进行比较，P<0.05;与第 a3组进行比较，P<0.05. 表7 各组大鼠血清NSE浓度比较(x?s，μg/L，N=8) 组别 0.5h 3h 6h 第1组 0.64?0.08 0.74?0.05 0.68?0.63 第2组 1.05?0.16 1.69?0.21 2.54?0.25 ***第3组 0.87?0.63 1.48?0.15 2.16?0.15 *a*a*a第4组 0.97?0.09 1.83?0.12 2.50?0.17 * 注:与第1组进行比较，P<0.05;与第2组进行比较，P<0.05;与第 a3组进行比较，P<0.05. 23 讨 论 早期有效的对CA患者进行CPR能够改善神经功能，并能提高存活率。这样做带来的好处的机制尚未完全了解。进行CPR的同时限制缺血，特别是防止再灌注损伤。通过CPR产生的循环的好处是多方面的，具体包括通过提供分级血液流向心脏和大脑衰减再灌注损伤。虽然CPR产生再灌注病理生理学，从CPR限制再灌注损伤特别是通过减轻氧化基板的最高水 [19]平，并激活保护对抗氧化应激途径缺血后的调理机制的低流量。实验研究脑缺血大大有助于缺血性损伤机制的认识，但是从临床治疗策略来看，其相关性是受到影响的。其原因之一是利用实验模型和方法仅部分复制天 [20]然存在的脑局部缺血的病理生理学。 脑组织缺乏储备氧的能力，储备的能量也比较少，其储存的葡萄糖在缺氧状态下仅能够维持1-2分钟，所以说大脑对缺血、缺氧是十分敏感的，发生不可逆性的脑损伤的时限是脑内血液循环停止5分钟。患者发生CA后，对大脑的能量供给迅速变少，从而中断了能量的供应，导致机体内启动代偿性的加速无氧酵解，这同时可引发乳酸盐、脂肪酸的大量积聚，从而导致细胞膜破坏，造成细胞功能失调，造成钙超载和细胞水肿，从而产生很多的氨基酸、代谢产物以及氧自由基，细胞损伤进一步加重。通过检测进入血液或脑脊液的代谢物的含量，可以评估神经元或细胞的受损程度，从而在一定程度上能够预测CPCR的预后。对CA患者实施CPCR后，患 24 者脑组织血流由原来的中断状态得到再灌注，这样就发生了更加复杂的病理生理改变，这样就形成了一个恶性循环，降低患者的生存率以及脑功能恢复的速度。 在实施CPR以后，一旦患者实现ROSC，在技术上患者是处在活的状态的。应该寻找一个更有效的方法来预防CA后综合征以及CPR后的各个阶段。当患者实现ROSC后的早期死亡率在不同国家、地区间是存在差异的，这种影响因素是多方面的，包括变异的患者人群、报告方法、以及CA/CPR后的高级生命支持。 CA患者由于心脏突然停跳而发生了脑缺血，经过CPR后，脑部血液再灌注，这一系列的过程导致细胞内钙超载，产生自由基，破坏线粒体的结构和功能，从而造成细胞的能量代谢障碍，这样加剧了一些酶促反应，导致细胞损伤的速度加快、产生更过的氧自由基，产生细胞毒性作用。同时，由于钙超载，脑血管痉挛，脑缺血缺氧程度进一步加重。当存在脑缺氧的状态时，即使会出现短暂的脑充血，但是也能产生副作用，那就是可导致血管麻痹15,30min。 对于发生CA后早期接受CPCR的患者，大脑的缺氧-缺血性损伤是导致其死亡和致残的主要原因。在CPCR后存活的患者中，80,都经历了不同时间的昏迷，其中40,的患者进入了持续植物状态，80,的患者在1年内 25 死亡。成功的CPCR不仅仅是成功地恢复ROSC，其最终目的是保护或尽可能恢复完整的脑功能。成功复苏患者的预后主要由脑缺氧损伤的程度决定，而心脏骤停时的全脑缺氧损伤和随后的再灌注损伤是引起脑损伤的主要原因。因此，减轻CPCR后大脑的缺血再灌注损伤，对于促进大脑功能的恢复，实现真正的CPCR具有重要意义。 NSE是神经元损伤的一种特定血清标记物，能透过血脑屏障入血。但是测试NSE的最佳时间和截止值的说法有很多种。然而，这些生物标志物 [21]的细胞类型和大脑区域的特异性直到现在还未研究清楚。有研究表明，脑脊液中的NSE水平与血清中的NSE水平相关性非常高，能够准确的反映脑组织损伤的程度。NSE是神经细胞受损后释放入脑脊液，脑脊液/血清 [22]NSE比率可能是结核性脑膜样早期诊断的有用的参数。有研究显示，NSE是糖酵解途径的关键酶，特异性定位在神经元和神经内分泌细胞内， [23]NSE的水平与癫痫发作的频率有关。阿尔茨海默氏病常见于痴呆的老年 [24]人，有研究显示NSE水平与阿尔茨海默氏病患者脑萎缩相关。美国神经学会2006年发布CPR后幸存的昏迷者预后判断指南提出NSE的血清浓度可作为预后不良判断的有效证据。 从CPCR后脑损伤开始就要预测患者的预后，以便能够有针对性的开展早期康复。反映脑损伤的程度的外围标记可能会提供可能的不良后遗症 26 的客观指示。有研究显示，初步评估具有高水平的S100β蛋白的患者， [25]表示脑损伤后残疾的风险很高。血清S100β蛋白反映脑损伤的损伤程 [26]度，能够提高结果的预测水平。 S100蛋白仅表达在脊椎动物，为显示细胞特异性的表达模式。S100蛋白家族由24名成员组成，按照分布、功能分为三个主要亚组:只产生细胞内调节的作用、参与细胞内和细胞外调节和主要产生细胞外调节的作用。在一些情况下，一个特定的S100蛋白可诱导不表达它在正常生理条件下的细胞类型的病理情况。细胞内的S100蛋白通过与多种靶蛋白包括酶、细胞骨架亚基、受体、转录因子和核酸的相互作用，参与细胞增殖、分化、凋亡、钙稳态、能量代谢、炎症和迁移/侵袭调控。胞外S100蛋白分布在单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞、关节软骨细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞、神经元、星形胶质细胞、上皮细胞、成肌细胞和心肌细胞，从而参与先天监管活动及适应性免疫应答、细胞迁移和趋化、组织发育和修复以及白细胞和肿瘤细胞的侵袭。这些蛋白质的一种独特的特点是，各个成员被定位在特定的细胞区室，从其中的一些能够通过与特异于每个S100蛋白不同的目标进行交互以重新定位时钙激活，在一个时间和空间的方式转导的钙信号。近年来，S100蛋白已经受到越来越多的关注，因为它们与几个人类疾病包括心肌病、神经退行性疾病 27 和癌症密切相关。它们也被证明在诊断这些疾病中是有价值的，可以改善临床管理，预测患者预后和存活率。 S100β蛋白通过与激酶底物相互作用抑制蛋白磷酸化，在组装细胞结构的重要组成部分发挥作用,星形胶质细胞分泌的S100β蛋白功能知之甚少，但证据大量表明S100β蛋白浓度的改变取决于神经细胞营养或毒性作用。在正常水平，S100β蛋白可能具有神经保护作用抵抗谷氨酸毒性。该蛋白质刺激神经突增生，提高损伤神经元的存活率，有报道S100β蛋白的 [27-30]局部作用为刺激损伤大鼠坐骨神经的体内再生。与此相反，高浓度的S100β蛋白或反应性星形胶质细胞增生导致加剧神经炎症和神经元损伤。最近的观察表明，高浓度的S100β蛋白质诱导凋亡。多种中枢神经系统障碍是S100β蛋白水平升高。虽然S100β蛋白释放可能是条件，而不是原因，但仍然与神经元损害高度相关，因此，是中枢神经系统损伤标志物的 [31]有力候选。Connolly等报道S100β蛋白浓度和颈动脉内膜切除后的神经认知衰退之间具有相关性。谵妄与S100β蛋白的水平增加可能表明脑损伤或者是由于精神错乱或导致谵妄有关。更高水平的S100β蛋白之间谵妄期间和可能的关联谵妄后患痴呆症的风险较高是一个有趣的领域未来的研究。需要更多的研究来阐明S100β蛋白蛋白质的作用，在病理生理途径， [32]导致精神错乱，并探讨其可能作为生物标志物的谵妄。 28 本研究显示，不同浓度氧气复苏组大鼠在接受CPCR后0.5h血清S100β蛋白、NSE水平开始增加，提示在复苏的早期就已经出现脑损伤。 S100β蛋白浓度空白对照组水平一直较低，其余3组均于复苏成功后逐渐升高，并于复苏后3h达到高峰。与空白对照组进行比较，复苏组大鼠血清NSE浓度随复苏的时间不断延长逐渐升高。不同氧浓度组间对比:与第2组进行比较，第3组、第4组大鼠血清NSE、S100β蛋白水平较低，差异有统计学意义( P,0.05 )，第3组大鼠血清NSE、S100β蛋白水平较第4组低，差异有统计学意义( P,0.05 )。与对照组相比，第3组大鼠的改良神经功能评分相对较高，差异有统计学意义( P,0.05 )，第4组评分相对次之，差异有统计学意义( P,0.001)，第2组评分相对较低，有显著差异( P < 0.001 )，提示过高的吸氧浓度对大鼠预后不利，过低的吸氧浓度不足以大鼠机体利用。 结 论 实验表明，常规吸入100%浓度的氧气，大鼠脑组织可发生氧化性损伤，不利于预后;吸入50%浓度氧气的大鼠的血氧浓度就优于吸入100%浓度氧气的大鼠，因此，没有必要为防止CA/CPCR过程中的低氧血症而给予高浓度的氧气吸入，这需要进一步更多实验的证实;但21%浓度的氧气不足以满足大鼠脑组织的氧需求，最佳吸氧浓度仍需进一步实验去探讨。 NSE及S100β蛋白对预后的评估有临床价值，但其测定时间及数值 29 仍有较大争议。希望以后能有大样本量、多中心的研究。 ?本研究创新性的自我评价? 一、理论上的创新 针对目前临床上CPCR时氧气浓度选择不清楚的现状，本项目首次系 30 统研究大鼠CPCR采用不同浓度氧气对预后的影响，可为防治脑缺氧损伤开拓新思路，丰富该领域的理论基础。目前国内外关于复苏采用空气和纯氧对大脑影响的动物实验研究局限于新生动物，而无以成年动物为研究对象，由于新生动物和成年动物大脑对缺氧的耐受和对高氧的反应差异较大，因此有必要采用成年动物作为研究对象，进一步探讨复苏采用不同浓度氧对成年动物大脑的影响。 二、方法上的创新 CPCR后器官的损伤不但与其自身的缺血再灌注损伤有关，还与器官之间的相互作用、内环境有关。因此准确模拟CA/CPCR的临床状态对评估复苏疗效非常重要。本研究中所用的在体动物模型更接近临床麻醉中(如气管导管脱出等)循环骤停后复苏的过程，有较大的临床意义。研究结果将为提高CPCR质量及安全性提供理论及实验依据。 ?参考文献? 1 Thel MC，O’Connor CM(Cardiopulmonary resuscitation:historical pers pective to recent investigations[J](Am Heart J，1999，137(1):39-48( 2 Peberdy MA,Kaye W,Ornato JP,et al(Cardiopulmonary resuscitation of 31 adults in the hospital:a report of 14720 cardiac arrests from the Nationa l Registry of Cardiopulmonary Resuscitation[J](Resuscitation,2003,58 (3):297-308( 3 沈洪,王士雯.2003:中国心肺复苏的关注问题[J]. 中国危重病急救医学,2003,15 (5):262-264. 4 Bellomo R, Bailey M, Eastwood GM,et al.Arterial hyperoxia and in-hospi tal mortality after resuscitation from cardiac arrest[J].Crit Care, 2011,15 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