Trichoderma Koningii V—6菌体氨基葡萄糖与生物量的关系

Trichoderma Koningii V—6菌体氨基葡萄糖与生物量的关系 Trichoderma Koningii V—6菌体氨基葡萄 糖与生物量的关系 第33卷 vd? 第4期 No4 山东大学(自然科学舨) JOURNALOFSHANDONGUNIVERSITY 1998年12月 Dee.1998 TrichodermaKoningiiV一6菌体氨基葡萄糖 与生物量的关系 / 宋桂经黄磊高瑾孙彩云 (山东大学微生物技术国家重点实验室) 了<?1Z-/ 摘要研究了康氏木霉(TrichodermaKoningii)茵体中氨基葡萄糖N.G与菌体量 的相关性,在一定的培养条件下,N.G含量与茵体量呈线性关系在loo?, 8.5mol/LHC1水解45min,茵体中的N.G能够比较完全地释放出来.探讨了影 响 固态发酵过程中测定菌体量的诸多因素.孢子中的N.G含量约占菌体中的 225%,诈为培养基主要成分的玉米皮,麸皮的N.G均仅占4.6%.通过测定N— G,能比较准确地估游j固体曲的茸体量,从而为研究纤维素酶固态发酵过程中菌 的生长代谢与酶合成的关系,提供一个简便可靠的方法. 关键词塑墨麴堑N-G'里堡垄物墨 中围分类号Q936纤缒亳酶尿}l孽 在研究固态发酵的微生物生长和生理代谢调控方面,菌体量的测定严重地妨碍了 研 究的深入进行,这是因为菌丝非常紧密地与固体基质结合在一起,很难把它们定量分开 长期以来,由于缺乏理想的检测方法,使固态发酵纤维素酶的调控研究始终局限于培养条 件和产酶二者之问的水平上,难以比较深入地从微生物的生长代谢等一系列生理变化过 程研究酶的台成与调控, 许多研究者先后采用多种问接方法测定固态发酵过程中的菌体量.Terui和 lorimoto".利用酶降解固体曲(ricekoji)中的淀粉及蛋白类物质,以残余物作为菌体量. ugama利用培养过程中释放的二氧化碳量作为菌体生长量的指标,Grajek则利用S 菌落 直径及其延伸速率来研究菌的生长.另外也有人通过测定培养基营养成分的消耗,菌体结 难以准确地反映固态构成分的变化等进行研究0J.这些方法均存在着不同的缺点, 发酵菌 体的生长变化, 几丁质是真菌细胞壁的主要成分,它是由乙酰N-G通过..1,4糖昔键结合成的直 链高分子聚合物.有人认为,氮基葡萄糖(N—G)的多少能反映真菌的菌体量. 本文建立并完善了通过测定菌体中N-G的含量,问接估测木霉在固态发酵过程中 收穑日期:1997-o8】3 ,蝴 第4期来桂经等:Tr/chodem~,V一6菌体氨基葡萄糖与生物量的美系素469 菌体量的方法,为深入研究固态发酵过程中纤维素酶台成的调控机制和方法,提高酶的合 成能力,提供了一个科学,简便易行的固态发酵菌体量测定方法. 1材料和方法 1.1菌种 c^o出d嘶V一6为本实验室分离保藏菌株 1.2培养基 1.2.1斜面培养基15%麸皮汁琼脂培养基 1.2.2液体发酵培养基(NH4)S042.O%,KH2F041.O%,MqO.4%,cac0.2%,葡萄 糖0.5%,300rat,三角瓶装50mL培养基,3ooC160r/rain振荡培养. 1.2.3固体发酵培养基在300rnL三角瓶内,加入玉米皮6g,麸皮4g,水10mL.每个 三角瓶接种1/mL孢子悬液2mL,30oC静止培养. 1.3N-G的测定 取适当浓度的样品溶液2mL加入10mL刻度试管中,苒加1mL乙酰丙酮试剂,摇 匀,沸水浴中加热20min冷至室温,再加入无水乙醇5mL后,加lmL对二甲基氨基苯甲 醛试剂,再以无水乙醇补足反应液总体积到LOmL,充分混台后在65,7O?水浴中温热 lOn以加速C的释放,冷至室温,用水作空白对照,在波长530nrn测OD值.用标准曲 线计算样品中氨基葡萄糖含量. 1.4还原糖测定 参照3,5二硝基水杨酸比色定糖法. 1.5滤纸糖酶活力(FP-ase】测定 参照文献[8]进行. 2结果与讨论 2.1N.G的稳定性 2.1.1H0浓度对N.G的影响 取N—G10mg,在室温(25?)12mol/L浓盐酸中浸泡24h:然后将盐酸稀释成11.5, 10.0,8.5,7.0moltL,100?水解lh,从图l可以看出,在100?条件下,HC1浓度低于8.5 mol/L时,NG比较稳定,回收率在98%以上. 2.1.2水解时问对N.G的影响 用上述同样方法将NG调制成8.0mol/L,在100oC水解不同时间,结果如图2所示: 在上述条件下,水解lh以内,NG基本不被破坏. 2.2菌体中G的释放 2.2.1HC1浓度对菌体中N.G释放的影响 用G5砂芯漏斗收集液体培养的菌体,烘干后称取少量干菌体用12mopLI-IC|慢泡24 h后,按上述方法稀释成不同浓度,100oC水解lh,中和后,测定释放出的N—G,结果如图3 470山东大学(自然科学版)第33卷 所示.HC1浓度在8.5mol/L时,菌体中的N.G释放得最多.浓度过高过低都不利于N.G的 释放过低释放不完全,过高引起NG的分解.而纯N.G在HC1浓度高于85mol/L时稳 定性为98%,这可能是由于菌体的屏蔽作用致使菌体中N.G较纯且更稳定. 100 98 96 —94 曼92 90 88 86 84 1234 I,h 圈IHCI帐度对.G的影响 Fig.】rkeffects,ffHCI?址嘴a而t 8510115 }lcl/mol?L一 囝2水解时间对N-G的影响 Theeffectsh州stimemgl~lfine 2.2.2水解时问对菌体中N.G释放的影响 用上述同样样品,在浓HC1中浸泡24h,再稀释成8.5mol/L,然后在100?水解不同 的时间,中和后浊4定释放出的N.G,结果如图4所示:在100?水解45min菌体中的N.G 释放得最多. 65758.5g5105115 CH~1tmol?. 图3lu度对菌N一样放的影响 F.31'effectsof~~~.eettlraticclsHa啡tilelJtmra~on 0fc?aneflorathem}~ellum Hydt/rain 图4水解时间对菌悻F;-G释放的影响 Fig.4Theeff~tsofhsthneOnlheliberation uotfromhtem. ~cellum 2.3N-G的回收率 用下列模拟实验对上述方法进行验证:称取lOnagN:G,分别加入适量的固体曲样品 和适量的液体发酵菌体样品中,按上述最佳条件进行水解(85mol/L45min),根据下列公 式计算N.C的回收率 回收率(%)=(样品加糖的OD值一样品OD值),糖OD值 结果如表所示:菌体中N.c的回收率为100%,固体曲中的回收率为97.5%,表明样品经 上述水解方法处理后N.c的释放比较完全. 第4期朱桂经等:iVr/cboderrm~,unV一6菌体氨基葡萄糖与生物量的关系素471 】模I==l试骑 T扎1e】sinaial【 2+4固体基质及孢子中的N.G含量 为r分析发酵过程中产生的孢子以及培养基成分的影响,用上述方法对培养基的主 要成分玉米皮和麸皮及T.KoningiiV一6孢子中的NG含量分别进行测定.结果表明, 每克玉米皮和麸皮中的NG含量均为178mg,仪占茁体中的4.6%;而每克孢子中的N—G 含量为8.55n1g,约占菌体中的22.5%.因此在研究发酵过程中的菌体量变化时必须予以 适当考虑 2.5发酵过程中N.G与菌龄的关系 按l_2.2中的条件和方法进行液体摇瓶发酵,在发酵过程中,定时取样测定同发酵 阶段的菌体浓度和—G浓度,在整个发酵过程中每克菌体中的N—G基本上没有变化,为 38.2rag. 2.6培养基组成与菌的生长及酶台成的关系 在纤维素酶固态发酵过程中,培养基的组成对发酵水平有很大的影响,用麸皮含量不同 的培养基培养时,无论对菌的生长或者酶的台成影响都很大.如果按N—G与菌量的比为382 :1,那么随着麸皮含量的减少,菌体量直线下降,说明麸皮的含量越多,菌的生长越旺盛,这 可能与培养基的C,N原子数比值有关.但是酶的台成并不是生长越旺合成得越多,麸皮过 多或过少对酶的台成都极为不利麸皮含幂在20%时,酶的台成速率最大 / 225 I4646??一—??一 100 — 80 60 40 20 0 1spore2.myceliu不13bran4combran'L. 5葬址【歧埘龋体和前的澎l?6v一6忠发斛过中鼬的歧违牢 ?5Eff~tsrmediunl?np'【1lmmycelium1d1"3…Fig6S)~ltheti<'ratelin~Jliil 【L1fvln~ltalil?_ 参考文献 fI'cndC.MllnIJournal'[~'emlenlati~]]'echnoh~'1956;f34";575 2岛HS?O~xkiN?Gm~thl『?a1f^昭ljIISOry, ml甜med~aJ,~mlal—}emlentali—m1h? ~ae1』 472山东大学(自然科学舨)第33卷 1979;【s7):4?,412 3GreIcw.P州u曲Pn~elnThern~0hidieFungifTr~nSugonSeetPulpinSolid—s.?}IrIdlli~gtl噼;(32):255 — 26O 4R~ehe31Nen~eAu0fCNfinNea~'nenttoEstimate?,Ln叩心inSolidstakFe~tetion—Ci,ou~'lhncsBi[卜 teeh~utv,l哪;【11):677—683 5De%.n'an~C.,I/B1,ciTr嘎IinSolidStalerrr目Tt丑li嘎I.I.Ma,~ualb{0c}Gntdl0d 穹.ApplNie~bMBimdl|l0I, 1995;35:200—2D5 6JungHoeKimDI)Y.Ryu.Cell~eseProductionbyaSolidStateCuisinesystem.BieledmolBi ~eng.1985~27:1445—1450 7北京太学q:物系生物化学教研室.生物化学实验指导.北京:^民教育出版 {上.1979.22—24 8张树政.酶工业{下册).北京:科学出版社,1哪606一黜 9fi0chN.VenagueA.It~eeh,1993;(11):岍一683 }?C0RRLEA?0NBErWEENIH?EGLUCOSAMINEOFMYCEUUM ANDTHEC0NrENTS0FMYCELIUM0Fr,.}_(0^f^f_GU s0I1gGuijing,Huanglei,GaoJin,SunCaiyun (State研.ofM/crob/d.Ted,.,ShandongUmv.,如W) 1l1erelationsbetweentheduc咖'meinT.,她eeUwallandmyeeliumwerestudied.Un- derthesarI1ecultivatingconditions,duoomcontentshavestraightrelati~tnstomyeelimn.Hydro- ly捌by8.5moltLH(=lf0rforty— fiveminutesat100?,theghJc0samjneinthecdlwallcafIbe releasedeorr~letely.Kojimyceliumcanbeaccuratelyestimatedduringlneasuringglue~ninthath providesamredependablemethodtostudytherelationsbetweenthegrowthandenzymeformation insolidstatefermentation.Inadditlcns.$11chtersasinfluencetheestimation0fthemyeeliumin SSFarestudiedfuer.Ifthemediaareditierent.theglueos~ninecontentsintheeeUarealsodif- ferent.1l1eglueosar~neco~ltentsinthesporesaecourltfor22.5percerlllcInecontentsinthe cel1.while~2Or[1branandwheatbranaonly46percent. Keywordsglucosamine;solidstalefermenlation;mycelium