利用新的丁内酯衍生物研究血管内皮细胞凋亡与老化关联及空泡化的机制（可编辑）

利用新的丁内酯衍生物研究血管内皮细胞凋亡与老化关联及空泡化的机制（可编辑） 利用新的丁内酯衍生物研究血管内皮细胞凋亡与老化 关联及空泡化的机制 山东大学 硕士学位论文 利用新的丁内酯衍生物研究血管内皮细胞凋亡与老化关联及空 泡化的机制 姓名:王玮玮 申请学位级别:硕士 专业:细胞生物学 指导教师:苗俊英;解琨 20070506原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下, 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方 . 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 日期:竺: :生 论文作者签名:兰边边 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子版,允 许论文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编 入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇 编本 学位论文. 保密论文在解密后应遵守此规定 日期:翌:皇:男 论文作者签名:兰埠埤导师签名:.薹罐蒸中文摘要 利用新的丁内酯衍生物研究血管内皮细胞凋亡与 老化关联及空泡化的机制 血管内皮细胞控制着血管功能,其功能紊乱会导致各种心血管疾病。本论文 旨在以血管内皮细胞为模型来研究凋亡与老化的关系及空泡化的机制。 本课组在以前的研究中发现去除血清和生长因子诱导人脐静脉内皮细胞 ,?凋亡,那么,与此同时,细胞是否也发生了老化,本论文对此进行 了研究,发现去除血清和生长因子也能诱导『、,老化。接着我们从化学遗 传学角度出发,以去除血清和生长因子的『为模型,新的丁内酯衍生物 一苄基一一一硝基苯氧甲基一一丁内酯 ..琊.,为工具,对可能关联凋亡和老化的重要因 子做了研究。 空泡化与细胞凋亡、坏死有密切关系,可能在老化过程中也有作用,所以对 其机制的研究有重要的意义,本课题组在研究中发现低浓度的氯代奎宁 在人肺腺癌细胞中能诱导空泡化,但其在中的作用尚不清楚,由 此我们研究了是否能诱导的空泡化,并发现卿 ,‘ 可以诱导的空泡化,而且其作用是剂量依赖性的。接着为研究能够影 响诱导的空泡化的新因子,我们研究了对诱导的空泡化的影响。 研究方法: .血管内皮细胞的提取和培养,参考 的方法【矾 .倒置相差显微镜观察细胞形态变化 .检测细胞生长率 .吖啶橙染色结合激光扫描共聚焦显微镜观察,检测细胞核凝集 .染色检测片段化和凋亡率 .舭半乳糖苷酶染色检测细胞的老化程度 .免疫荧光化学检测膜整连蛋白 的表达山东大学硕十学位论文 .荧光探针检测表达水平 .中性红吸收法检测溶酶体空泡化程度 .一酶活性检测试剂盒检测一酶活性 研究结果: .去除血清和生长因子不但能诱导的凋亡,也能诱导其老化。 .抑制此种情况下的凋亡和老化。 水平的升高。 ..抑制此过程中膜整连蛋白 .?毗不影响细胞内的水平。 ./.能以剂量依赖的方式诱导的空泡化。 .”抑制诱导的空泡化,及酸性区室总体积的 增加。 .能增强一?皿酶的活性,而对此也有抑制作用。 结论 .本实验中我们发现除了凋亡外,去除血清和也能诱导发生 老化。此结果与血管内皮细胞的凋亡和老化相平行的观点相一致。 .我们首次发现新的小分子化合物能够抑制血管内皮细胞的凋亡和老 化,这为研究凋亡与老化的关系提供了一个有效的工具。 .膜整连蛋白参与的抗凋亡和老化作用,说明它可能是细胞凋亡和 老化的信号交联中的一个重要因子。 .在的抗凋亡和老化作用的过程中,的水平未受到影响,提示在血 管内皮细胞的凋亡和老化过程中可能存在一种不依赖于的途径。 .能诱导的空泡化,而此种空泡化也能被所抑制。说明 和可以作为一对分子探针来研究空泡化的机制。 .一?酶可能参与了抑制空泡化这一过程。 关键词 血管内皮细胞;凋亡;老化;一苄基一一一硝基苯氧甲基一一丁内酯;空泡 化、,戌 棚 叮 ?? 】:奠胍.. .. . 世.. &?脚..嗽.. 幻 灯. 酃‘ ‖ 醴 .. .聊: . 比 【 .,. 山东大学硕士学位论文 . . . . . . . . .;一. . 宅. ... 掣?? ...?“. : . . .一/. .咖曲 . ... . 即一/ .叩一叩. . .; . , ,?.山东大学硕士学位论文 . . ,, ? . 咖.?. ,. . ? . .? .. .鹞. : ; ; ; .; 缩略词表吖啶橙 小牛血清白蛋白 成纤维细胞生长因 子? 血管内皮细胞 ,人脐静脉内皮细胞 一苄基一一一硝基 一” 苯氧甲基一一丁 ?四 内酯 激光共聚焦术四甲基偶氮唑盐 ?,一, 磷酸盐缓冲液苯甲基磺酰氯活性氧缸. 一 老化相关性半乳 糖苷酶 、 酸性区室总体积 氯代奎宁 论文正文 前言 近年来,随着国民寿命的延长,国内老人人口不断增加,随之而来的脑梗死、 高血压、冠心病及糖尿病等老年性疾病也越来越多,所以老年性疾病的发生 问题 已成为各国政府与广大民众广泛关注的问题。老年性疾病,顾名思义是与年 龄相 关的,随着年龄的增大,人体的一些组织在形态结构和生理功能方面都必然 出现 一系列退行性变化,并且这些变化往往是全身性、多方面的,这就会导致一些正 常生理功能的退化,从而也就引发了多种老年性疾病。研究表明老年性疾病的发 生不仅与组织细胞的老化有关,还与组织细胞的凋亡有密切的关系,而且细胞凋 亡在各种组织的老化中也发挥有重要作用 ,。 .凋亡与老化关联的研究进展 在正常情况下,细胞凋亡在机体内的主要作用是清除对机体功能有害的细 胞。大量研究表明老化通常伴随着多种类型的细胞和组织凋亡活动的改变 ,,在免疫系统,神经系统、骨骼肌及心脏的老化中都会出现老 化相关的细胞凋亡删 。最近,等发现在小鼠正常和非 正常的老化过程中,强亡指标都有所增加,细胞凋亡及凋亡导致的一些有重要功 能的细胞的丧失,可能是引起细胞老化的主要机制 。另一方面, 细胞凋亡在组织动态平衡中有重要作用,随着机体的不断老化,组织的动态平衡 会发生紊乱,而当凋亡不能启动时也会引起组织功能的紊乱。凋亡能力的降低对 机体内部老化和外部皮肤的老化都有重要的作用?; , .然而目前对于正常老化过程中细胞凋亡的作用了解仍然较少。推测在老 化过程中凋亡可能与~些像神经元一样不能分裂的细胞的丢失有关。这些研究表 明凋亡在体内老化过程中有重要作用,然而凋亡在老化过程中所起的作用在不同 的组织中可能也不同。 就表型上而言,老化可以认为是随着年龄的增长一些正常的生理功能丢失的 过程,它可能是由于部分有特殊功能的细胞的丢失而引起的。老化机制的研究始 山东大学硕士学位论文 于整体水平和器官水平,然而整体水平的研究具有一定的局限性,而细胞生物学 的发展为研究老化的机制提供了一个新的平台。在细胞水平上,不同组织来源的 细胞在体外培养时会出现老化的现象,这也就是细胞的复制性老化 ; ,它在一定程度上重现了体内的老化现象 。 细胞老化 ?也叫复制性老化是指细胞脱离细胞周期并且不 可逆地丧失增殖能力后进入的一种相对稳定的状态,是正常细胞的必然归宿 【 ,。对于细胞老化过程中,凋亡情况的变化目前研究还并不清楚, 有的实验表明细胞老化时易发生凋亡,而有的实验结果则相反,老化的细胞 不易 发生凋亡 ..等发现老化的成纤维细胞血清饥饿时不易 凋亡,且此现象与基因有关.,,等发现损伤诱 导的依赖于的凋亡在老化的细胞中不易发:丰 .,。与此相 反,等则发现用神经酰胺、和冈田酸等处理人成纤维细胞,老化 的细胞比年轻的细胞更容易发生凋 .,,在内皮细胞中,也有 报道老化的细胞更容易发生凋亡【 ,。由此可见,老化的细胞对 凋亡的反应可能跟信号有关,有的信号诱导的凋亡在老化的细胞中容易发生而有 些则不易发生。 .与细胞凋亡与老化 . 简介 活性氧 ,是氧气被人体吸收后,在分子阶段上 产生的活性化物质,是活泼的氧自由基与具有氧自由基反应特性的其他含氧物质 的总称,故又称活性氧类,包括以自由基形式存在的和不以自由基形式存在的具 有高度活性的分子氧的代谢中间产物。包括超氧阴离子自由基?、羟自由 基?、过氧化氢以及单线态氧等 ,。 起初人们认为是人体在应激、炎症等生理、病理情况下产生的,会对人体 内的核酸、蛋白质、脂肪酸等生物大分子代谢造成损害。后来研究表明活性 氧不 止是细胞代谢的产物也参与了细胞信号的调节,它参与了许多细胞内的信号 通 路,从而引起基因表达、蛋白质合成及细胞功能的改变 ,。 ..与细胞凋亡的关系 现在普遍认为活性氧和氧胁迫在多种细胞的凋亡中具有重要作用。细胞内氧 化压力过高的一个最主要的结果就是细胞死亡 。在 高氧的条件下细胞内水平舞高,在多种细胞中水平的升高都能激活线 粒体依赖的凋亡途径。抗氧化剂和线粒体基质中的过表达能够抑制高氧 , 诱导的细胞凋亡,从而也说明了水平的升高能够诱导凋亡, 。诱导凋亡主要是通过激活酪氨酸激酶来实现的,它与受体酪氨酸激 酶结合后可能通过激活和.家族的蛋白或,使线粒体渗透性 ; 和的活化而诱导凋三 发生改变释放细胞色素,及 ;. ’】? .. 与细老化的关系 目前,大多数研究认为活性氧在细胞老化中有重要作用。在高氧条件下 %细胞会比正常情况下更容易老化,而降解线粒体所释放则能够抑 制这种高氧诱导的加速老化,这为线粒体产生的是正常老化的重要原因这 一假说提供了有力论证。.线粒体假说认为线粒体功能异常是老化的。 主要原因。的生成可导致线粒体突变损伤使线粒体功能异常,而线粒 体功能异常可进一步增加的产生;又可以促进第二次突变, 引起线粒体功能的进一步恶化和的产生,脂质过氧化的形成,致使线粒体 功能的降低从而形成了一个恶性循环降低细胞的存活率并导致老化 。实验表明在人类和动物器官的老化过程中,线粒体氧化损伤确实是 增加的,而线粒体氧化损伤的程度又与机体的寿命成反比.一些人体和动物 的实 验表明随着机体的老化,线粒体的呼吸能力和合成酶的活性降低。在线虫 中,用超氧化物歧化酶活过氧化氢酶的类似物可以延缓其老化。最近有文献 报道 线粒体中过表达过氧化氢酶的小鼠寿命比野生型小鼠要长 。然而与以上研究相矛盾的是,最近等的报道则表明虽 然老化与线粒体有关,但是可能并未参与此过程 . 山东大学硕十学位论文 .膜整连蛋白 与细胞凋亡与老化 ..膜整连蛋白简介 膜整连蛋白是一种跨膜的异质二聚体,是一类介导细胞外基质粘附的 细胞表面受体家族,广泛分布于多种动植物细胞。它由两个非共价结合的跨 膜亚 基,即和亚基所组成,目前发现的亚单位有种,亚单位有种,以 不同方式组合可以组成至少种膜整连蛋白分子。 膜整连蛋白通常与 亚基结合形成 异二聚体,与其他亚基相 比 亚基的胞质区较长,由个氨基酸残基构成,与其它整连蛋白的亚 基没有同源性。膜整连蛋白 以层粘连蛋白为配体,形成半桥粒从而介导上皮 与基膜之间的连接和癌细胞的迁移 ,;。 .. 膜整连蚤白 与细胞凋亡的关系 除了结构功能外,膜整连蛋白 可以和受体酪氨酸激酶结合传递信号,从 而影响细胞的增殖、分化和存活等多种生物学功能。多项研究表明在细胞凋亡方 在皮肤基细胞瘤、 面,膜整连蛋白 在不同的细胞中的作用是不同的。 乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等癌细胞以及血管内皮细胞中诱导凋亡,而在肝癌、 肺癌、胰腺癌、宫颈癌、甲状腺癌等癌细胞和角质形成细胞中则抑制凋亡。最近 功能上的细胞特异性与其下游信号分子有关, 能够 有研究表明:? 引起细胞凋亡的作用是通过激活肿瘤抑制因子的活性来完成的。在野生型表达的细胞中, 的表达能够激活的活性从而引起凋亡的发生;但 是在缺陷型的细胞中 引起的凋亡功能能够得到抑制。表达缺陷型 的角质形成细胞中 促进细胞存活的功能就是一个很好的例子 .。 能够激活许多信号分子,包括,,峨和等。乳 腺癌上皮细胞中 的连接反应能够调节组织极性,在基膜上形成的三维极性 结 构,促进半桥粒的形成,从而激活 的活性,抑制细胞的凋亡 , 通过/激酶信号通路使人的表皮瘤样细胞系细胞发生 是通过/信号通 。。在角质形成细胞中, 凋亡反应 路调节细胞的增殖的 ,。另外,本课题组的研究表明在多种山东大学硕士学 位论文 因素诱导的血管内皮细胞凋亡中,膜整连蛋白 , 的水平都是上升的; ; 。 ’ ..膜整连蛋白与老化 在老化过程中膜整连蛋白 的作用目前研究较少.用不易亲水的培养皿培 养人的包皮角化细胞,细胞增殖能力增强,细胞寿命也随之增长,而在此过程 中 膜整连蛋白的表达也是升高 ,。这说明表达 水平的升高可能抑制人的包皮角化细胞的老化。但是并未见有别的报道. .空泡化 .细胞空泡化 细胞中的空泡一般指在光学显微镜下可见的,具有不同于细胞 质光学特征的泡状物。空泡一般由膜包绕,内部充满水溶液,也有些空泡内部充 满脂类。细胞中形成空泡的过程和现象称为空泡化.空泡化是生 物体中普遍存在的一种现象,除了动物细胞外,一些低等的真核生物在正常的生 理条件下,细胞中一些较大的膜泡也可称为空泡,例如草履虫的伸缩泡,酵母和 植物细胞的液泡。草履虫的伸缩泡起着收集和排泄代谢废物的作用,酵母和植物 细胞的液泡起着代谢、贮存营养物质、调节细胞质渗透压和的作用等。另外, 植物细胞与动物细胞一个很大的区别是植物细胞有液泡,这也是一种空泡。 空泡化可由于细胞内部原因而自发产生,也能由外部环境和诱导物诱导产 生。其一般过程如下:膜性细胞器内容物发生积累,导致细胞器肿胀。同时,同 种或异种膜性细胞器发生相互融合,使膜泡体积变大,从而使细胞呈现出空泡化 现象。? 在多种细胞空泡化现象中,溶酶体空泡化与细胞的各种功能关系最紧密 .目前,对细胞溶酶体空泡化的分子机制研究才刚刚起步,主要集中 于对空泡毒素引起的溶酶体空泡化作用机制的研究。人们已经发现多种蛋 白、脂类和细胞组分参与哺乳动物细胞的溶酶体空泡化过程。这些蛋白包括: ; 相关蛋自超家族的亚族 、蛋白、蛋白【 ,、蛋白 ,;隋森芳, 山东大学硕十学位论文 】、酶 ,,脂类包括胆固醇、糖基鞘磷脂、肌醇磷 脂。脂筏在溶酶体空泡化过程中也有重要作用 ,。 .空泡化与细胞凋亡的关系 有研究表明,在多种细胞的凋亡过程中,细胞质中都会出现空泡【李煜等, ; ,; ,; ,,而这些空泡现象大多与溶 酶体有关。空泡化的溶酶体更容易破裂,释放出酸性水解酶。溶酶体组织蛋 白酶 和的释放,会促进线粒体释放细胞色素,进而诱发凋亡。过多的酸性水解 ,; 酶可水解细胞膜,造成细胞膜破裂,使细胞坏死 ,。 .空泡化与细胞老化 在老化细胞中,溶酶体的性质会发生改变,通过检测可推断溶酶体内 含物容量的变化。细胞老化过程中伴随着的增大和质膜破裂几率的增加。 老化细胞易于破裂的倾向可能是某些老年人慢性炎症增多的原因『 , 。另外,老化的成纤维细胞和内皮细胞细胞质都会有空泡的出现,这也说,; , 明了空泡化与细胞老化很可能有密切的关系 ; ,? 另外,空泡化主要是与溶酶体相关,而溶酶体可能是关联凋亡和老化的重要 细胞器。最近有人提出了线粒体.溶酶体轴观点。此观点认为线粒体功能随着年 龄增长而降低,这就导致了生成的下降和氧化损伤的增加,而氧化胁迫则 导致了溶酶体膜不稳定从而释放水解酶到细胞质中,进而水解酶直接或间接激活 磷酸酶和促凋亡蛋白引起细胞的凋亡。所以对于空泡化机制的研究可能有助于了 解凋亡和老化的关系 ,。 .血管内皮细胞 .血管内皮细胞简介 血管内皮细胞,内衬于血管的管腔中,形成 了血管的内壁,它与多种血管功能有关比如血管的收缩,凝血等。其功能的紊乱 与多种心血管疾病如动脉硬化、高血压、糖尿病、冠心病等密切相关.血管 的萎缩和衰退导致人类产生多种疾病并且在临床上呈上升趋势,严重危害人类的山东大学硕士学位论文 健康,血管的萎缩衰退与血管内皮细胞的凋亡和老化之间存在着直接关系。在动 脉粥样硬化斑块形成的早期发现了的凋亡和老化,这意味着内皮细胞凋亡 和可能是动脉粥样硬化形成过程中的初始变化曹仁贤,.多项研究结果已 表明促使动脉粥样硬化形成的介质如血管紧张素?、氧化型、氧自由基等 均能诱导的凋亡,抑制动脉粥样硬化形成的因子如、氧化抑制剂等 可防止内皮细胞凋亡杨永宗等,.后来有研究发现在动脉硬化斑块中除了,; 检测到凋亡的内皮细胞外,还有老化的内皮细胞 虬所以,研究血管内皮细胞凋亡与老化关联的分子机制不仅具有重要的理 论意义,而且可以为解决上述老年性疾病提供新的切入点。而人脐带静脉血管内 皮细胞在体外不断老化的过程中会出现年龄相关的细胞凋亡。因此,脐静脉血管 , 内皮细胞为研究细胞凋亡与老化关联分子机制提供了很好模型 .老化的血管内皮细胞的生物学特征 体外培养的血管内皮细胞会不断老化,并且发生一系列的形态变化,老化的 血管内皮细胞较大且铺展的较厉害,细胞核变大,出现双核或多核现象,细胞内 代谢颗粒和空泡增多,常出现多倍体和非整倍体【【? ;除了形态的变化外,老化的血管内皮细胞还表现为老化相关性半乳糖苷酶 .染色阳性.是少数已被广为接受的细胞老化的生物学标 志物之一【 . .血管内皮细胞凋亡与老化的关联 最近的研究已经发现了一些关联人脐静脉内皮细胞?的凋亡与老 化的因子。比如用神经酰胺处理,使水平升高时与年轻的 相比,老化的、,更容易发生凋亡【等发现/ 除了在糖基化的胶原诱导的凋亡中有作用外,也参与诱导的内皮细 胞的老化,近期研究发现高糖在诱导内皮细胞的凋亡和老化时是通过激活凋 亡 信号调节激酶而起作用的 ,;等发现抑制磷脂酰胆碱特 ,的活性可 异性磷脂酶;另 以抑制蛇毒诱导的凋亡和此过程中表达的升高山东大学硕士学位论文 外,和在血管内皮细胞的凋亡和老化的关联中也有重要作用 【 “,;,过表达能抑制双氧水诱导的 的凋亡和老化 ,。除了上述因子外,基因表达发 现在内皮细胞的老化中,一些调控细胞凋亡的因子如白介素、、结合 蛋白和等的表达水平都有很大程度的提高 。 .丁内醋 丁内酯是无毒透明的油状液体,可溶于乙醇、乙醚、苯和 丙酮,能溶解多种有机和无机化合物;能与水完全互溶;是一种沸点高、溶解 性 强、电性能及稳定性好的溶剂。 丁内酯环状结构是一类非常重要的结构单元,许多天然产物和合成药物中都 含有该结构单元,所以其衍生物在最近几年受到了很广泛的关注【胎 ,; 的代,。它最初是在 谢物中被发现的,后来在曲霉菌的培养基中被分离出来 。研究发现丁内酯是结合的竞争性抑制剂,还是一个有效的细胞周期 抑制剂 ,;在体内,它可以抑制/激活的蛋白的磷酸 。年 化和/激活的组蛋白的磷酸化 等发现两种人工合成的.亚甲基吖丁内酯衍生物和能够 抑制一基因的表达,单核细胞的黏附,并且在人肺癌细胞中,通过 , 靶向复合体抑制癌细胞的侵润和细胞和细胞的黏附 。很明显,丁内酯可以影响多种细胞的生长,然而目前对其研究主要局限 于肿瘤细胞中,而在正常细胞中研究的较少。 .化学遗传学 随着后基因组时代的到来,蛋白功能尤其是在细胞内和活体内的功能是一重 大课题,人们希望有一种快速的大规模的方法来解决各种复杂的问题。由此, 一 门新兴交叉科学??化学遗传学 便应运而生,利用大量的 小分子化合物研究基因的功能。目前它在细胞信号转导,功能基因组和创新 药物 研究中的应用已受到很大的关注。。 化学遗传学 是指利用现代有机合成化学所产生的细胞 渗透性的小分子化合物作为探针或者配体,特异性地靶向某些蛋白,从而激活或 灭活这些靶蛋白,并由此探索在正常或病理状态下蛋白质在细胞或组织中的功能 ,。 及其作用机制 正如传统遗传学有正向遗传学和反向遗传学之分一样,化学遗传学也分为正 向化学遗传学 和反向化学遗传学螂 .。它们均以小分子化合物库作为研究工具,分别从表型或蛋白 质入手来研究蛋白质的功能 地.正向的化学遗传学采用各种小 分子化合物处理细胞,诱导细胞出现表型变异,然后经过筛选,寻找小分子作用 的靶标通常是蛋白质.而反向遗传学则是用生物活性小分子来处理靶蛋白, 以研究其在体内的生物学功能。首先选取所感兴趣的靶蛋白,然后从文库中筛选 其抑制剂,最后由抑制剂诱发表型,据此分析蛋白功能。 化学遗传学应用于整个基因组范围就形成了化学基因组学 ,它是在化学配基的合成、筛选和确认的精密技术快速发展的 背景下产生的,整合了组合化学、基因组学、蛋白质组学、分子生物学、药 物学 等领域的相关技术,采用具有生物活性的化学小分子配体作为探针,研究与人类 疾病密切相关的基因、蛋白质的生物功能,同时为新药开发提供具有高亲和性的 药物先导化合物【 】. 从化学遗传学角度出发,本实验室合成了一系列丁内酯衍生物,并对其进行 筛选,我们已经发现苄基一硝基苯氧甲基一一丁内酯 ?羽?缸卜由.习啪,能够抑制 肺癌细胞的生长【沙磊等,.为了寻找能够用来研究凋亡和老化相关 联的机制的小分子化合物,我们在本文研究了对的影响,发 现可以抑制去除血清和生长因子诱导的的凋亡和老化。进而, 、等在的凋亡与老化 以为化学探针研究了膜整连蛋白 关联中的作用,寻找参与血管内皮细胞凋亡和老化调控的新因子.接下来,又从 空泡化角度出发,研究了对空泡化的作用。山东大学硕士学位论文 第一章抑制人脐静脉内皮细胞凋亡和老化的研究 一.刖昌 凋亡与老化一直是两个倍受关注的问题。许多研究表明在正常和非正常的老 化过程中,细胞对凋亡的敏感性会发生变化,也就是说凋亡与老化存在密切的关 系。然而对于凋亡与老化的关系并未搞清。 研究表明体外培养的人脐静脉内皮细胞礤?能不断老化。而且在此, 过程中凋亡细胞的增加可能是一个很重要的特征 ,; ;。这就为研究凋亡与老化的关联提供了一个很好的模型。另外血管内皮细 胞的凋亡与老化直接控制着血管功能,血管功能的失调不仅引发血管 疾病,还会导致人体的多种疾病。因此,研究清楚血管内皮细胞凋亡与老化关 联 的分子机制,可为防治多种老年性疾病提供理论依据和开发新药物。 化学遗传学,即利用小分子化合物作为探针,对细胞活动进行干扰,以研究 细胞活动的机制。这一新兴交叉学科已在信号转导,创新药物等方面的研究 中得 到了广泛的应匪 .,。从化学遗传学的角度,我们合成并筛选了一 系列新的丁内酯衍生物, 一苄基一硝基苯氧甲基一一丁内酯 一叫一母,能够抑制 肺癌细胞的生长沙磊等,。为了寻找能够用来研究凋亡和老化相关 联的机制的小分子化合物,我们在本文研究了对的影响,发现 可以抑制去除血清和生长因子诱导的的凋亡和老化。进而,以 为化学探针研究了膜整连蛋白 、等在.的凋亡与老化关联 中的作用,寻找参与血管内皮细胞凋亡和老化调控的新因子。 二.材料与方法 .主要仪器设备 倒置相差显微镜日本公司 荧光显微镜 激光扫描共聚焦显微镜德国莱卡公司山东大学硕士学位论文 培养箱 ?医用净化工作台苏州净化设备厂 精密数显酸度计浙江象山县石浦海天电子仪器厂 .型干燥箱上海实验仪器总厂 超低温冰箱日本公司 型蒸汽消毒器山东新华医疗机器厂 立式灭菌器山东新华医疗器械股份有限公司 自动双重纯水蒸馏器上海象华化工有限公司 电子天平上海天平仪器厂 电子恒温水浴锅黄骅市综合电器厂 酶标仪. 微量移液器 日本 扫描仪清华紫光 台式离心机 微量移液器 .实验材料与试剂 .实验材料 新生小牛牛脑购于山东省医学科学院 健康产妇脐带取自齐鲁医院产科,解放军第四五六医院产科 培养皿美国公司 生长因子珠海东大生物制药有限公司 .实验试剂及耗材 培养基美国公司 小牛血清山东省医学科学院 胰酶、胶原酶上海生工 明胶美国公司 培养皿美国公司 培养板孔、孔,孔、孔美国公司 一次性滤器美国公司 山东大学硕十学佗论文 山东大学化学院赵宝祥老师实验室 .:宝生物工程有限公司 ,??,美国公司 吖啶橙公司 试剂盒;美国公司 ., ’, .主要溶液及试剂配方 ..血管内皮细胞的分离、培养 新生小牛血清补体灭活 将新生小牛血清置于。温水浴处理, 于超净工作台中进行分装, 置于.。密闭保存。 不含、原液 . 。 . . 加定容至 使用液 用将稀释倍即可 .%胶原酶 胶原酶 . 溶于缓冲液中 推滤,分装一?保存 培养液 / 小袋 . 加入充分混匀,最后定容至 , 抽滤灭菌,保存山东大学硕十学位论文 血管内皮细胞培养液 踟 培养液小牛血清 使用时加入生长因子./ %明胶储存液 明胶 × 混合后高压灭菌 .%明胶使用液 %明胶用前在水浴融化 × 胰酶使用液用于内皮细胞.% .%胰酶 × .. . 储存液配方. 粉末溶于中制成. 储存液 ..染色 固定液 甲醛 /. 戊二醛 × 染液不含助液 . 酬‰‘ . × 柠檬酸调值至. 助液 粉末 柏 二甲基甲酰胺 含.的染液 不含.的染液 助液 ..细胞存活率检测 贮存液配方/ 粉 ×定容至 ./滤膜推滤除菌,。避光密闭保存 .吖啶橙染色 吖啶橙染料贮存液 / 吖啶橙 充分溶解,置于棕色瓶中。冰箱保存 吖啶橙染料应用液. / 吖啶橙染料贮存液 ×。 ..免疫细胞化学 %多聚甲醛 多聚甲醛 .?水浴,混匀,然后加入少量 正常血清封闭液% 血清原液 . 一抗使用液 一抗原液 加抗体稀释液 二抗使用液山东大学硕士学位论文 二抗原液 加抗体稀释液 . .可.. 加入中 ..?陌检测活性氧 储存液 的储存液, 将’,’溶于,配成 口管分装,保存。 使用液? 储存液。溶于 培养液 .实验方法 .人脐带血管内皮细胞的分离和培养按方法 .提 取 取健康产妇分娩后小时以内的脐带,用冲洗脐静脉以洗净淤血,两 端插管并用线扎紧,注入.%胶原酶,消化分钟,吸出酶液,离心,取沉淀 细胞层,用培养液重悬,并调整细胞数达~×个,然后分装在铺有明胶 的塑料培养皿中,每“生长因子,置于、%饱和湿度的培养箱 中培养。第二天换液,以后每天换液一次,一周后长成单层细胞,可传代培 养。实验中所用的细胞的倍增水平一代。 .%明胶铺平板的方法如下: 取.%明胶储存液铺入平板中,紫外照射小时后弃明胶,× 冲洗一次,包以铝箔置于无菌操作台中备用. .实验分组 .活性变化的实验外,在其他 除了去除血清和生长因子的 的实验中将细胞分为三组:正常组、对照组和实验组,正常组的细胞是在正常 条山东大学硕士学位论文 件下培养的;对照组细胞是在去除血清和的培养液中培养的;实验组是 在去除血清和的同时用处理细胞。 .倒置相差显微镜观察细胞形态 种植细胞:将处于对数生长期的细胞种植到孔板中。 处理细胞:种板后第 ,移弃各孔中原有培养液 向实验组各孔中分别加入含一定浓度的培养液,每孔 ; 。 向对照组各孔中均只加入细胞培养液,每孔 每隔一定时间于倒置相差显微镜下观察一次细胞形态。 细胞形态学变化并且拍照。 . 染色 弃孔板中的旧培养液,用洗两次 室温下用固定液固定 ×洗两次再用不含?的染液洗一次 加入含助液的染液,于无的环境中 弃染液,用×洗一次 在显微镜下观察,随机选取个视野,统计阳性细胞数和细胞总数,计 算细胞阳性率 .盯检测细胞存活率 种植细胞:将处于对数生长期的细胞按预先种植到孔板中。空白 组各孔均不加细胞,仅分别加入.细胞培养液。 加入:待细胞长满,吸弃各孔中的旧培养液。向实验组各孔中分别 加入含不同浓度的培养液,每孔/;向空白组及对照组各孔中 均只加入细胞培养液,每孔/。 加入:在药物作用时间结束之前 ,直接向各组每孔中分别 。 加入 贮液,置于培养箱内继续培养 。 溶解:弃各孔上清液,分别加入 /,室温下摇床 检测:以空白组为准调零,酶标仪检测各样品于姗下的值。 计算细胞存活率:存活率实验组/对照组%注: 对照组存活率为%山东大学硕士学位论文 .吖啶橙染色 用处理后,吸弃细胞培养液,滴入滴./吖啶 橙, 后在激光扫描共聚焦显微镜下观察核凝聚及片断化 . 检测 按照试剂盒操作步骤进行。 .免疫细胞化学法 弃孔板中细胞培养液,用.液轻轻冲洗细胞,次 %多聚甲醛固定 弃%多聚甲醛,.缓冲液洗次,每次 弃. 缓冲液,加入正常血清封闭液应用液,室温封闭 弃封闭液,加入一抗用做阴性对照,湿盒中过夜 以上“ 弃一抗,用.缓冲液洗次,每次 弃. 缓冲液,加入二抗,反应? 弃抗,用.缓冲液洗次,每次弃. 缓冲液,加入:孵育 用.缓冲液洗次,每次 弃. 缓冲液,用水溶性封片剂封片可省去此步操作 用激光扫描共聚焦显微镜观察、分析结果 . 水平测定 。 用 冲洗细胞,将应用液代替细胞培养液,?孵育 冲洗次,加入新的细胞培养液,激光扫描共聚焦显微镜下观察,用软件随 机选取视野分析荧光亮度。 .统计学分析 取至少三次独立实验的结果,进行检验.结果以平均值?差的形式表 示。.为差异显著 三.结果 .去除血清和生长因子的 卜活性变化山东大学硕士学位论文 以前的研究已经发现在去除血清和时,会发生凋亡『 ,】,为了检测此种情况是否会老化,我们分别在、、、 和对其进行了.活性的检测。结果发现在前,去除血清和 生长因子并不能引起 ?活性的变化,而 后一活性 则明显升高.图.这说明去除血清和不但能使凋亡, 也能使其老化。 .对形态的影响 去除血清和 和 时,细胞会逐渐变圆,脱离培养皿底部并形 成凋亡小体,而在去除血清和同时用,的处理细胞则发现细 胞凋亡小体明显变少,贴壁细胞与对照组相比拉长图。 . 对存活率的影响 用法检测对的存活率的影响图,用叽,咄, 吮的分别处理去除血清和的细胞,发现在三种浓度都能 抑制去除血清和诱导的存活率的降低,而且随着浓度的升高其 的对细胞的存活率影响 作用也逐渐升高.,,在,吮 不大,而毗和吮的能够明显抑制存活率的降低,且蛳 的作用更明显。由此可见,在 时,作用较比明显,所以我们在 以后的实验中都选用 这一时间点来研究,州和?两个浓度都有明显 作用,所以我们选用了较为经济的埘来进行以后的研究. . 对细胞核片段化的影响 为了进一步确定的抗凋亡作用,我们用染色检测了处理的细 胞核的片段化和凝集的变化图,细胞核凝集或片段化是细胞凋亡的典型特 征,并可作为鉴定细胞凋亡的依据 ,】。结果对照组中可以看到明显 的核片段化,并且有大量的核破碎,而在处理的细胞中核片段化和破碎 现象则明显减少。 .对 阳性率的影响 用染色检测处理对细胞凋亡率的影响图。对其定 量的结果表明,在去除血清和时,凋亡细胞的比例为.?.%, 这比正常组细胞的凋亡率要高很多.。而处理的细胞其凋亡率则下山东大学 硕士学位论文 降至.?.%?.,此结果进一步表明了去除血清和诱导的 凋亡能够被所抑制。 . 对去除血清和生长因子的州 活性升高的影响 在鉴定的抑凋亡作用后,我们用?染色检测了对细胞 .%, 老化的影响图.在此实验中正常组细胞.阳性率为. 而去除血清和后,.阳性率上升到了. .%《.,在用 处理过的细胞中,阳性率又降低到了.垃.%..。这些结果表 明,不但能够抑制去除血清和引起的的凋亡,也能抑制 此种条件所引起的的老化。 . 对中膜整联蛋白 表达的影响 为了了解抑制的凋亡和老化的作用机制,我们首先检测了 膜整联蛋白在此过程中的作用图。免疫细胞化学结果显示对照组细胞膜 整联蛋白 的表达比正常组细胞明显要高函.。但是用处理的细胞 膜整联蛋白 的表达比对照组显著降低‘..这表明在抑制去除血 清和诱导的的凋亡和老化中,膜整联蛋白 的表达是升高的。 . 对中活性氧水平的影响 我们用探针检测了细胞内活性氧的水平图,在正常组细胞中活 性氧的水平很低,而对照组也就是去除了血清和后荧光表达明显上升 函..处理组的细胞活性氧水平与对照组相比没有明显变化加.。 这说明尽管在去除血清和诱导凋亡和老化的过程中,活性氧的 水平是升高的。但是在抑制这种凋亡和老化时,活性氧的水平并未发生 变化。 四.讨论 血管内皮细胞的凋亡与老化与许多血管疾病有关。研究表明血管内皮细胞的 凋亡和老化在动脉硬化发生和发展的过程中,都有重要作用,但是目前对血 管内 皮细胞凋亡和老化的关系研究的并不很清楚。在本研究中,我们以作 为模型来研究血管内皮细胞凋亡与老化的关系。 在老化过程中凋亡率的变化情况目前已有很多研究。在体内,山东大学硕士 学位论文 ???????????????????????????????? ????日????????????????????????????? ? 在老化的血管中凋亡的情况在不同组织是不同的,比如在年老的猴子中大动 脉, 股动脉内皮细胞凋亡增强,而在血管壁中层凋亡则是减弱的 。在体外,血管内皮细胞的凋亡与老化之间的关系目前研究的观点则不统 一。等在体外研究了前代细胞的生长动力学,发现在 中凋亡与老化并不相关 。但是代对于内皮细胞来说 可能太短而不足于表现出凋亡随代数增加的变化。后来,等将 培养到了代发现老化的凋亡程度明显升高 ,。本 课题组以前的研究发现去除血清和时,会发生凋亡 , 本实验中我们发现除了凋亡外,去除血清和也能诱导发生 老化。此结果与等的研究结果相一致,支持了血管内皮细胞的凋亡和老 化是相平行的的观点,为研究凋亡和老化的关系提供了新的证据。 化学遗传学是一门新兴的交叉学科,目前已经广泛应用于生物学的多种领 域,包括信号转导、蛋白质之间的相互作用、发育生物学、转基因及创新药 物等 【。在此研究中我们从化学遗传学的角度出发,试图寻找一种新型的 可以用来研究凋亡与老化的关联机制的小分子化合物。我们发现 .吮可以抑制去除血清和诱导的的凋亡和老化,这说明 可以作为化学探针来研究凋亡与老化的关联,这为凋亡与老化关联的研究 提供了一个非常有力的工具。 目前,已经发现一些在的凋亡和老化的关联中起作用的因子,但,; ; 是凋亡与老化间信号的交联研究并不清楚 ;。因此我们以为工具研究了一些可能参与的凋 亡和老化的新因子。 膜整连蛋白 是一个重要的与信号转导相关的膜蛋白。我们以前的研究发 现多种因素诱导的血管内皮细胞凋亡过程中,膜整连蛋白 的水平都是上升 , 的,比如去除血清和、蛇毒、黄樟素氧化物等 ,; ; ;。另外,在处理的血管内皮细胞凋亡中,膜整连 蛋白 的上调了倍。细胞内总的及细胞表面的膜整连蛋白均显 , 著增高 ,。此研究结果和我们的研究结果一致,进一步说明膜 整连蛋白 在血管内皮细胞增殖和凋亡中发挥重要作用。但其在老化 过程中的作用目前尚未有研究,我们用//的处理去除血清和山东大学硕士学 位论文 的.,发现在抑制的凋亡和老化的过程中,膜整连蛋白 的水平也是受抑制的.这说明膜整连蛋白 可能参与了抑制的 的凋亡和老化,它很可能是关联凋亡和老化的重要因子. 是凋亡过程中一种重要的信号分子。在凋亡的时候水平升 高 。然而在老化过程中的作用则存在争议.传统的自由, 基学说认为氧自由基、在老化过程中有重要作用 和 的中水平的变化 。等分别研究了 及其对诱导的凋亡的敏感度,发现可能在凋亡与老化的关 联中起重要作用 。然而也有研究表明在老化过程表达并 没有变化也就是说可能并不参与老化 。此研究中,我们 发现尽管在去除血清和生长因子诱导发生凋亡和老化的过程中水 平是上升的,的抗凋亡和老化过程中水平并无明显变化.此研究结 果看似与等的结果相矛盾,实际上可能由于两种情况下诱导凋亡和老化 的因素不同,抑制凋亡和老化的过程可能是不依赖于的. ? 概而言之,我们的研究结果表明,在去除血清和时,凋亡和老化都 的水平来抑制凋亡和老 会发生,.嘞可以通过抑制膜整连蛋白 化,但此过程中的水平并未受抑制。这为凋亡和老化关系的研究提供了一 个新的理论证据,而小分子化合物对的抗凋亡和抗老化作用则 为我们提供了一个研究凋亡和老化关联机制的新工具。总之,我们的研究结 果表 明膜整连蛋白是一个关联凋亡和老化的重要因子,在的凋亡和老化 过程中可能存在不依赖于的途径。附图 一苄基一一一硝基苯氧甲基一一丁内酯 图 的化学结构式 一。螗秀 稻?;?笛己幅位 毫葛啐《? . 图去除血清和生长因子的州染色结果 丸相差显微镜下?染色照片 .正常细胞 ,去除血清和.去除血清和 ,去除血清和 。去除血清和 去除血清和 ...染色定量结果显示一阳性细胞比例与对照相比,’., 、。 图 对形态的影响 和正常培养和的细胞 和去除血清和和的细胞 和 处理和的细胞 己 ? ? ? 幂一空 柏 加 , 图 对存活率的影响 ?表示与对照组相七.,?表示与对照组相.,图 处理的细胞染色照片 .正常组.对照组.处理组 钙?:;?筠?佰位 一零一?茜?芑芎堙兰卜处理的细胞染色照片 图 正常组.对照组.处理组 .染色柱形图显示阳性细胞比例槲表示与正常组相七., ?表示与对照组相.,。,一誉一坊? 钙?弱?巧?俘竹 皇竹官。《? 图 处理的细胞 染色照片 屯正常组.对照组.处理组 ...染色定量结果显示.阳性细胞比例表示与正常组相比 .,表示与对照组相比., 复 氅 虽 芑 暑.?. ?他? .?鼍。一。。宝等面茁 图 处理的 水平变化图 九正常组.对照组.处理组 .细胞内水平变化柱形图槲表示与正常组相七.,表示与对 照组相.,。自,、节硕节伸论文 第二章抑制引起的的空泡化的研究 一.前言 空泡化是舀:细胞的凋亡、分化、坏死中常见的一种现象. 。也有研究表明老化的细胞中也经常出现空泡现象【,;, ; , ,说明空泡化可能与细胞老化也有密切关系。目前对于哺乳 动物细胞中空泡化现象研究较多的是溶酶体的空泡化。溶酶体是细胞内一种 非常 重要的细胞器,它的主要功能是进行细胞内消化。现在有研究表明溶酶体可 能是 ,。所以对溶酶体空泡化的 关联细胞凋亡和老化的重要细胞器 研究对于了解凋亡和老化的关联有十分重要的意义. 氯代奎宁,是奎宁的衍生物,是广泛使用的抗疟疾药物,也 是溶酶体抑制剂。富集于细胞质中的酸性膜泡中,能够提高膜泡中的值。 溶酶体中值的升高会影响细胞内吞、外排和自吞噬作用【 ,.; 。能够增大溶酶体体积,随后还增大质膜面积 ,。有人发现可以诱导包括人类血管内皮细胞在内的多种细胞的凋亡 『 ;。我们以前的研究发现能诱导人肺癌细胞的空泡化 ,,在此实验中我们研究了对的作用,发现也能 诱导的空泡化。由于在中具有抗凋亡作用,我们推测 它可能会抑制诱导的空泡化,所以研究了在中对诱导 的空泡化的影响。 二.材料与方法 .主要仪嚣设备 同第一章 .实验材料与试剂 .实验材料 同第一章 .实验试剂及耗材 磷酸氯代奎宁济南市历城区防疫站惠赠自.夫学硕’学俯沦丈 中性红公叫 一酶试制龠 其余同第一章 .主要溶液及试剂配方 .. 血管内皮细胞的分离、培养 同第一章 ..磷酸氯代奎宁贮存液.? 磷酸氯代奎宁 . 水 旋涡混匀后推滤。以每份”无菌分装后于一:。密闭贮存备用。 .. 储存液配方吼饥 同第一章 ..吖啶橙染色同第一章 ..中性红染液 中性红粉末 .%溶液 旋涡混匀后过滤,制备成.%储液,常温避光密闭保存. 在使用时.%中性红储液。水浴加热分钟 倍稀释于”。的×。 ..蛋白提取溶液和蛋白浓度测定试剂配制 .配制 水 调至. 水定容到 苯甲基磺酰氯配制 . 异丙醇 分装入 管中,置于?。保存。山自、大学硕学俺论文 /抑胃队酶. / . /亮抑肚酶配制 ‘ 才 蛋白裂解液配制贮存液 .? . 甘油 .%溴酚蓝 . 水定容到 分装入 管中,置于。密闭保存。 蛋白裂解液应用液配制贮存液 蛋白裂解液×贮存液 .“ ./ 一巯基乙醇 / 水.? 考马斯亮蓝染料溶液配方 考马斯亮蓝一 %乙醇 %磷酸 加水,避光搅拌小时考马斯亮蓝颗粒极难溶解,否则极难过滤。 加水稀释到。双层滤纸过滤,。棕色瓶中保存。 .实验方法 .人脐带血管内皮细胞的分离和培养 同第一章山?;大学硕十学何论文 .实验分组 在研究对诱导的的空泡化时分二组进行实验:对照组、 处珲组,和共同处理组。对照组细胞用应用液培养:处 理组是蚪禽的应用液处理细胞;和共同处珲努是用和 同时处理细胞。 .倒置相差显微镜观察细胞形态 同第一章 .吖啶橙染色 按照上述方法处理 后,吸弃细胞培养液,滴入滴. / 吖啶橙, 后在荧光显微镜下观察,绿色的是细胞核,橙色的是空泡。 .酸性区室总体积的测定 参考等人的方法,,并适当修改。 ..测定中性红吸收量 对数生长期细胞以的密度接种于直径的培养皿中. 小时后吸出旧培养液,加入含不同浓度氯代奎宁的培养液,含 %牛血清。 小时后,吸出培养液,用洗皿次,每次分钟。 加入中性红孵育液.%中性红贮液倍稀释于×,置于培养箱 中孵育分钟。 吸出孵育液,用洗次,每次分钟。 加入酸乙醇含%乙醇,%乙酸,%水,提取出细胞酸性膜 泡所吸收的中性红. 将中性红的酸乙醇溶液在 分光光度计上 测其波长的值。 ..细胞总蛋白提取 将培养皿用洗次,每次分钟。 加入细胞裂解液,提取蛋白质冰上操作。 收集蛋白质样品于管冰上操作。 用×将各组蛋白质样品调整为相同体积。