总杞菊地黄丸定性鉴别和含量测定研究

总杞菊地黄丸定性鉴别和含量测定研究 杞菊地黄丸中各药材的定性鉴别及含量测定 一、处方 枸杞子40g 菊花40g 熟地黄160g 酒萸肉 80g 牡丹皮60g 山药80g 茯苓60g 泽泻60g 二、制法 以上八位味，取酒萸肉、牡丹皮、山药粉碎成细粉;泽泻、茯苓加水煎煮两次，第一次3小时，第二次2小时，滤过，滤液合并浓缩至相对密度为1.30—1.35(60—80?)的稠膏;熟地黄切片，加水煎煮三次，第一次3小时，第二次2小时，第三次1小时，滤过，滤液合并浓缩至相对浓度为1.30—1.35(60—80?)的稠膏;枸杞子以45%乙醇作溶剂，剩余的酒萸肉和牡丹皮及菊花已70%乙醇作溶剂，浸渍24小时后分别进行渗漉，收集渗漉液，合并上述渗漉液，回收乙醇浓缩至相对浓度为1.30—1.35(60—80?)的稠膏;与上述细粉与稠膏混匀，制成浓缩丸，干燥，打光，即得。 三、性状 本品为棕色至棕黑色的浓缩丸，微甜而酸。 四、各药材的定性鉴别及含量测定 1、枸杞子 定性鉴别研究 实验仪器:冷凝管3个，圆底烧瓶3个，离心管6个，硅胶G薄层板，分液漏斗1个 实验试剂:乙酸乙酯，甲醇，甜菜碱对照品，甲苯 薄层板:硅胶G薄层板 展开剂:甲苯-乙酸乙酯-甲酸(15:2:1)的上层溶液 供试品溶液的制备方法: 取本品15g，研碎，加水100ml，加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯50ml振摇提取3次，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液 。 对照药材溶液的制备: 取枸杞子对照药材0.5g，加水50ml，加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯30ml振摇提取3次乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解 ，作为对照药材溶液。 对照品溶液制备: 取甜菜碱对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液。 阴性对照溶液的制备: 取阴性样品(缺枸杞子药材的样品)，按照供试品溶液制备的条件制备样品，得阴性对照溶液。 操作方法: 照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各10微升，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(15:2:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。 2、山药 定性鉴别研究 实验仪器:冷凝管1个，圆底烧瓶1个，分液漏斗1个，蒸发皿1个，硅胶G薄层板2个，离心管2个 实验试剂:95%乙醇，乙酸乙酯，二氯甲烷，甲醇，浓氨试液，氯仿，10%磷钼酸乙醇溶液，香兰素硫酸溶液 薄层板:硅胶G薄层板 展开剂:乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(9:1:0.5);氯仿:甲醇:水(64:50:10) 显色剂:10%磷钼酸乙醇溶液;香兰素硫酸溶液 供试品溶液的制备: 取本品8粒研碎，加二氯甲烷30ml，加热回流2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷1ml使溶解，作为对照药材溶液。 对照药材溶液的制备: 取山药对照药材5g，加二氯甲烷30ml，加热回流2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷1ml使溶解，作为对照药材溶液。 操作方法(薄层色谱法) 吸取上述2种溶液各4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(9:1:0.5)或氯仿:甲醇:水(64:50:10)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以显色剂:10%磷钼酸乙醇溶液或香兰素硫酸溶液，在105?加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。 3、茯苓 定性鉴别研究 实验仪器:冷凝管1个，圆底烧瓶1个，分液漏斗1个，硅胶G薄层板2个 实验试剂:甲醇，乙醇，乙酸乙酯，乙醚，10%硫酸乙醇溶液，2%香草醛酸溶液-乙醇(4: 1)，三氯甲烷，茯苓多糖对照品。 薄层板:硅胶G板 展开剂:三氯甲烷-甲醇(3 : 1)或正丁醇-冰乙酸-水(4:1:5上层)或甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20:5:0.5) 显色剂:10%硫酸乙醇溶液或2%香草醛酸溶液-乙醇(4: 1)混合溶液 供试品溶液的制备: 取本品杞菊地黄丸(浓缩丸)15g，研碎，加水100mL，加热回流30分钟，放冷，离心，取上清夜，用乙酸乙酯50mL振摇提取3次，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。 对照品溶液的制备: 取茯苓多糖加甲醇溶液1ml制成对照品溶液。 阴性对照品溶液的制备: 取阴性样品(缺茯苓药材的样品)，按照供试品溶液制备的条件制备样品，得阴性对照溶液。 对照药材溶液的制备; 取茯苓对照药材1g，加乙醚50ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，制成对照药材溶液。 操作方法: 照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述供试品溶液,对照药材溶液,阴性对照液，分别点于同一块硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇(3 : 1)或正丁醇-冰乙酸-水(4:1:5上层)或甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20:5:0.5)或为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液或2%香草醛酸溶液-乙醇(4: 1)混合溶液，在105?C加热至斑点显色清晰，在紫外光(365nm)下检视。 4、泽泻 定性鉴别研究 实验仪器: 冷凝管3个、圆底烧瓶3个、硅胶G薄层板2个、离心管2个 实验试剂: 乙酸乙酯、乙醇、乙醚、丙酮，环己烷，石油醚，5%硅钨酸乙醇溶液， 薄层板: 硅胶G薄层板 展开剂: 环己烷-乙酸乙酯(1 : 1)或石油醚-乙酸乙酯(3:1)或三氯甲烷-丙酮(3:1) 硅钨酸乙醇溶液 显色剂: 5% 供试品溶液的制备: 方法1 取本品杞菊地黄丸(浓缩丸)15g,加水100ml,加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯50ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。 方法2 取本品杞菊地黄丸(浓缩丸)6g，研碎，加乙醚40ml,加热回流1小时3次，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮1ml使溶解，作为供试品溶液。 方法3 取本品杞菊地黄丸(浓缩丸)3g,研细，加乙醇40ml,加热回流30分钟3次，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。 对照药材溶液制备: 方法1 取泽泻对照药材0.5g,加水50ml,加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯30ml振摇提取3次，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。 方法2 取泽泻对照药材1g,加乙醚40ml,加热回流1小时，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮1ml使溶解，作为对照药材溶液。 方法3 取泽泻对照药材1g,加60%乙醇40ml,加热回流30分钟，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。 阴性对照溶液的制备: 按处方比例称取除泽泻外的其他药材同法制成阴性对照品溶液。 操作方法: 照薄层色谱法(通则0502)试验，分别吸取上述供试品溶液,对照药材溶液,对照品溶液和阴性对照液各5 μL、3 μL、3 μL、5μL点于同一块硅胶G板上，以环己烷-乙酸乙酯(1 : 1)或石油醚-乙酸乙酯(3:1)或三氯甲烷-丙酮(3:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷5%硅钨酸乙醇溶液，在105?加热至斑点显色清晰。 5、熟地黄 定性鉴别研究 实验仪器:容量瓶，玻璃漏斗1个，分液漏斗1个，硅胶G薄层板2个 实验试剂:水饱和正丁醇，甲醇，毛蕊花糖苷对照品,0.1% 2 ,2 -二苯基-1-苦胼基无水乙醇溶液 薄层板:硅胶G薄层板 展开剂:乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16 : 0. 5 : 2) 显色剂:0.1% 2 ,2 -二苯基-1-苦胼基无水乙醇溶液 供试品溶液的制备: 取本品(以下“本品”均指:杞菊地黄丸，2010版药典中规定每8丸相当于饮片3g)8粒，研碎，加80%甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过,滤液蒸干，残渣加水5ml使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4 次 ，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。 对照药材溶液的制备: 取熟地黄药材粉末lg ,同法制成对照药材溶液。 对照品溶液制备: 取毛蕊花糖苷对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液。 阴性对照溶液的制备: 取阴性样品(缺熟地黄药材的样品)，按照供试品溶液制备的条件制备样品，得阴性对照溶液。 操作方法: 照薄层色谱法(通则 0502)试验 ，吸取供试品溶液5^1,对照品溶液2pl，分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16:0.5:2)为展开剂，展开，取出，晾干，用0.1%的2,2 -二苯基-1-苦胼基无水乙醇溶液浸渍,晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点。 6、牡丹皮 定性鉴别研究 实验仪器:冷凝管3个，圆底烧瓶3个，硅胶G薄层板2个，玻璃漏斗1个 实验试剂:乙醚，丙酮，环己烷，三氯甲烷，丹皮酚对照品,盐酸酸性5%三氯化铁乙醇溶液 薄层板:硅胶G薄层板两个 展开剂:环己烷-乙酸乙酯(3:1);环己烷-三氯甲烷-无水乙醇(7:3:1) 显色剂:盐酸酸性5%三氯化铁乙醇溶液 供试品溶液的制备: 取本品6g，研碎，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮 l ml使溶解，作为供试品溶液。 对照药材溶液制备: 取牡丹皮对照药材lg，同法制成对照药材溶液。 对照品溶液制备: 取丹皮酚对照品，加丙酮制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。 阴性对照溶液的制备: 按处方比例称取除牡丹皮外的其他药材同法制成阴性对照品溶液。 阴性对照溶液制备其它各药材用量 药材名称 枸杞子 菊花 熟地黄 酒萸肉 山药 茯苓 泽泻 用量(g) 0.4138 0.4138 1.6552 0.8276 0.8276 0.6207 0.6207 操作方法: 照薄层色谱法通则(0502)试验，吸取供试品溶液，对照品溶液，阴性对照溶液各10ul分别点于同一硅胶 G薄层板上,使成条状,以环己烷-乙酸乙酯( 3 : 1)或者环己烷-三氯甲烷-无水乙醇(7:3:1) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性 5%三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的条斑。同时用阴性对照品与对照药材对比以排除浓缩丸中其他药材的干扰。 定量鉴别研究 本品方中牡丹皮为较主要的一味中药，故选其为测定对象。根据文献的有关报道，牡丹皮中有效成分为丹皮酚及芍药苷等，中国药典2015年版该方中以丹皮酚为其含量测定项目， 故本品以丹皮酚为含量测定指标，采用HPLC色谱法，并参考有关文献进行系统的方法学研究。 实验仪器:高效液相色谱仪，具塞锥形瓶2个，25ml移液管1个，1ml移液管1个，分析天平(万分之一)，冷凝管2个，圆底烧瓶2个。 实验试剂:70 %甲醇，甲醇-水(7:3)，丹皮酚对照品。 供试品溶液的制备: 取本品1.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70 %甲醇 25ml ，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 对照品溶液制备: 取丹皮酚对照品适量，精密称定，加7 0 % 甲醇制成每 l ml中含丹皮酚 45ug的溶液 ,即得。 阴性对照溶液的制备: 按处方比例称取除牡丹皮外的其他药材,按杞菊地黄丸的制备工艺及供试品的制备方法制备阴性溶液。 阴性对照溶液其它各药材用量 药材名称 枸杞子 菊花 熟地黄 酒萸肉 山药 茯苓 泽泻 用量(g) 0.1035 0.1035 0.4138 0.2069 0.2069 0.1552 0.1552 色谱条件选择 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱;以甲醇-水(70:30)为流动性;检测波长为274nm。 理论塔板数(n)的计算 2 n=16(t /w)R 理论塔板数按丹皮酚峰计算不得少于3500。 拖尾因子 据公式T=W/2d计算 ， 0.05h1 T范围在0.95-1.05之间。 分离度 据公式R=2(tR2-tR1)/(w1+w2)计算分离度(R?1.5)。 阴性对照试验 将供试品溶液(按正文中条件制备)，阴性对照溶液，丹皮酚对照品溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定。(应该得到三个色谱图)结果阴性应无干扰。 线性试验 分别精密吸取对照品溶液4、8、12、16、20μl,按上述色谱条件,测定峰面积。以色谱峰峰面积(y)为纵坐标,对照品进样量(x)为横坐标,绘制标准曲线并进行线性回归,得回归方程，相关系数r应不低于0.999。 精密度试验 重复性:分别取同一批供试品,按供试品测定项下方法,重复制备样品6次,进行测定，计算含量平均值，结果用RSD值表示，一般要求RSD,,3,。 中间精密度: 在同一个实验室，不同时间由不同分析人员,用不同设备测定结果之间的精密度，结果用RSD值表示，一般要求RSD,,3,。 准确性(回收率) 取已知含量的样品，共6份，精密称定，分别精密加入一定量丹皮酚对照品，按照前述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，定容。按上述色谱条件进行测定，计算回收率，一般要求回收率应在95-105%之间, RSD,,3,。 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液,分别在制备后0、1、2、3、4、6、8、12h进样,测定色谱峰峰面积, 计算峰面积积分平均值，结果用RSD值表示，一般要求RSD,,3,。 耐用性试验 不同品牌或不同批号的同类型色谱柱 ;流动相的组成比例的变化;柱温;流速，检测波长等。 样品的含量测定 取不同批号制剂样品，分别按供试品溶液的制备方法制备，按上述色谱条件测定计算出样品中丹皮酚的含量，RSD,,3,。 7、酒萸肉 定性鉴别研究 实验仪器:冷凝管4个，圆底烧瓶4个，离心管2个，分液漏斗1个，硅胶G薄层板2个 实验试剂:甲醇，30%乙醇，乙酸乙酯，乙醚，三氯甲烷，熊果酸对照品，10%硫酸乙醇 薄层板:硅胶G薄层板 展开剂:三氯甲烷-甲醇(3 : 1);正丁醇-冰乙酸-水(4:1:5上层);三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2下层) 显色剂:10%硫酸乙醇 供试品溶液的制备: 取本品杞菊地黄丸(浓缩丸)15g，研碎，加水100mL，加热回流30分钟，放冷，离心，取上清夜，用乙酸乙酯50mL振摇提取3次，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。 对照品溶液的制备: 取熊果酸对照品 ，加乙酸乙酯制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。 对照药材溶液的制备: 取山茱萸对照药材1g，加乙醚40ml，加热回流1h，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1ml溶解，作为对照药材溶液。 阴性对照药材溶液的制备: 按处方比例和制法制备不含山茱萸的阴性样品，制成阴性样品溶液。称取泽泻0.75g、茯苓0.75g和熟地黄2g，30ml水加热回流提取1个小时，过滤，提取液浓缩至一定浓度;取枸杞子0.5g、牡丹皮0.75g和菊花0.5g，70%乙醇加热回流提取1个小时，过滤，浓缩成适当浓度;合并以上两种浓缩液，加山药细粉1g;加70%乙醇20mL，加热回流提取1个小时，滤过，蒸干，加适量水溶解，分别用10ml乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为阴性对照溶液。 操作方法: 按照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述供试品溶液,对照品溶液，对照药材溶液,阴性对照液，分别点于同一块硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇(3 : 1)或正丁醇-冰乙酸-水(4:1:5上层)或三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2下层)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105?C加热至斑点显色清晰，在紫外光(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上:，显相同颜色的突光斑点。 8、菊花 定性鉴别 实验仪器:冷凝管2个，圆底烧瓶2个，硅胶G薄层板2个，玻璃漏斗1个，分液漏斗1个 实验试剂:硅藻土4g、稀盐酸，其中甲醇、乙醚、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、冰醋酸均为分析纯，绿原酸对照品 薄层板:硅胶G薄层板 展开剂:甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(24:8:1) 显色剂:10%的硫酸乙醇溶液 供试品溶液的制备 方法1:取本品(以下“本品”均指:杞菊地黄丸，2010版药典中规定每8丸相当于饮片3g)8粒，研碎，加硅藻土4g，研匀。加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮1ml使溶解，作为供试品溶液。 方法2:取本品8粒研碎，加蒸馏水100ml使溶解，加热回流30分钟，放冷，离心，用乙酸乙酯50ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。 对照品溶液的制备:对绿原酸对照品适量，精密称定，至棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1ml含绿原酸35μg的对照品溶液，即得(10?以下保存)。 阴性对照溶液的制备: 取阴性样品(缺菊花药材的样品)，按照供试品溶液制备的条件制备样品，得阴性对照溶液。 对照药材溶液的制备: 取菊花对照药材1g，剪碎，加石油醚(30~60?)20ml，超声处理10分钟，弃去石油醚，药渣挥干，加稀盐酸1ml与乙酸乙酯50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液。 操作方法: 依据薄层色谱法(中国药典2010版一部附录?B)试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(24:8:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，在105?烘至斑点显色清晰，并对结果进行分析。供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点。