采用骨髓活检标本塑料包蛙方法检测幼红细胞岛血型糖蛋白相关抗原

采用骨髓活检标本塑料包蛙方法检测幼红细胞岛血型糖蛋白相关抗原 采用骨髓活检标本塑料包蛙方法检测幼红 细胞岛血型糖蛋白相关抗原 38 糟锄{钧 ClinJHemato】,January1998.Vo】19,No.1 ' 菊骨髓活检标本塑料冷包埋方法 . 幼红细胞岛血型糖蛋白相关抗原 陶英浦权V梅如张子祥刘薏芝 目前国内,国外常用的塑料包埋剂应用于血细胞 免疫组化检测时受到限制+因为乙二醇甲基丙烯酸酯 (GMA)等塑料包埋剂于室温下聚合时不仅强烈放热, 且可与蛋白质氨基终端结合而遮蔽了细胞表面之抗原 决定簇+从而抑制了抗原一抗体反应].我们采用一种简 使包埋过程控制 易骨髓活检塑料块GMA冷包埋技术, 在低温一低氧环境下进行聚合,防止了热损伤的发生,使 塑料包埋切片上也能有效进行免疫酶标反应的检测. 和方法 1取材与处理收集治疗前的骨髓增生异常综合征 (MDS)6例,包括难治性贫血(RA)5倒,RAEB1例{取 得缓解的急性髓细胞白血病(AML)M2倒,M.1例, 缓解期多发性骨髓瘤1倒.取得骨髓活检组织块应有 (2~3)mm×(10~]5)mm大小. 2改良GMA包埋剂配制 2.1甲液:将本室Hemapun865原配方-中的聚乙二 醇2丁氧乙醇替代,充分摇匀+全溶后置棕色玻璃瓶 内4?保存备用; 2.2乙液;聚乙二醇(PEG)一l?10ml,NN二甲基苯 甲胺0.8mr=垒包埋藏配制:甲{瘦45份加乙液1份. 3切片操作步骤骨髓活检块放入4CBouin激小瓶 中置冰箱内.不停摇动固定1小时.冷0.1mol/L二 甲胂酸钠缓冲液(pH74)于4C球箱内漂洗3O分钟,继 而经4C等级乙醇递增脱水,每次10分钟.活检块移置 于盛有甲液的模具底部,置CC真空装置下浸泡2,4 小时+取出包埋模具滴加乙液2,3滴而成全包埋液, 再放入真空装置4c下聚合过夜.包埋块经修整后切割 戚3,4厚之切片,冷水潜中装片,常规贴片. 4切片免疫组化染色用APAAP法+一抗为血型糖 蛋白A鼠单抗(DaKo).二抗为碱性磷酸酶结合的免疫 鼠IgG+三抗为APAAP酶标复合物.3者均于湿盒内 室温下孵育3O分钟.滴加碱性磷酸酶底物显色液20/~1 后37"C下孵育显色20分钟+自来水诜后Mayer苏术素 复染胞棱4分钟,水洗+甘油明胶封片后镜检对照切 片用正常AB血清替代一抗进行相应染色 作者单位;200233上海市第六^民医院 R,f/ 结果 我们以改良简易不脱钙骨髓活检块GMA冷包埋 技术效果良好,模块内部无气泡与洞穴形成,可于普通 轮转式切片机下获取优质半薄切片,易为一般骨髓病 理实验室中常规采用. 由于经我们改良的GMA包埋剂中以2一丁氧乙醇 替代传统的聚乙二醇,故包埋剂内含酸量低t消除了过 去背景着色的缺点我们进而证明骨髓块于4?Bouin 液中固定不仅能产生最佳的核与胞浆形态,也能显示 优良的免疫组化反应,切片中粒系,巨棱系,红系和淋 巴系细胞分化抗原定位与显色优良. 我们以APAAP免疫酶法,检测血型糖蛋白抗原 在恶性血液病患者lO倒骨髓塑料包埋切片中红系细 胞的分布,证明在所有标本中幼红细胞核周均染成环 状或模糊状玫瑰或深红色阳性反应 讨论 过去本室所用水溶性GMA包埋剂是于室温下聚 合,故反应期间强烈放热+不仅损伤了骨髓组甥构型, 也使骨髓细胞中的各类酶活性以及众多已分化的髓性 和淋巴性抗原遭破坏.为此,我们采用一种简便易行 的,将包埋过程控制在低温?低氧环境下进行聚台的.制 冷系统",在操作中使用冷却的Bouin液固定,玲的磷酸 缓冲渡漂洗,冷的各级乙醇脱水,继而置于真空器具中 于4C下缓慢聚合,有效防止了热损伤的发生.从而可 同时在同一活检块切片上同时进行常规染色,组化染 色和免疫酶标染色3者的联检,进一步提高了骨髓活 检塑料包埋在血液病临床应用中的价值. 正常人骨髓切片中的幼红细略(簇)主要定位于 小粱间区.MDS时骨髓切片内的红系病态造血表现之 一 是可检出处于同一发育阶段的幼红细胞岛].如果 簇内以中,晚劫红细胞为主,就易与淋巴细胞集簇相混 淆.已知+骨髓切片中的淋巴细胞属较难识别的细胞, 它既可单个散在分布于造血基质与脂肪细胞之间,也 可聚集形成淋巴小结或淋巴集簇.据记载0],切片内的 淋巴样集簇可有以下4种构形:?生发中心小结;?境 界清晰之小结?边缘不规则小结;?小型淋巴细胞集 簇.这些构形在切片内授易与中,晚幼豇细胞岛相混 氆弥欲旖镌圆廊身欠弘葱}1卫 中华血液学杂志lg98年1月第l9卷第1期 淆.这时,必须进行免疫组织学的处理结果证明.骨髓 塑料包埋切片内血型糖蛋白相关抗原的免疫酶标检测 有助于同一切片内幼红细胞岛与淋巴细胞集簇间的鉴 别.进而对MDS,慢性淋巴细胞白血病,淋巴细胞性淋 巴癌或其它低度恶性非霍奇金淋巴瘤病例骨髓切片内 这两种细胞簇的识另提供有益资料. 另外,我们还发现此改良冷包埋法对巨棱细胞的 膜标志抗原(CDt)检测效果极佳,这对我们在骨髓病 理切片中提高微小巨棱细胞的检出率很有帮助. ?7一 参考文献 1CaseyTT,Co~sarJ,Co1]insR.Asimplifiedplasticembed— dingandJmmunohJsto]c.ctechniquerimmuaopheao— typicanaLyinsofhumatthematopoietieandlymphoidtis一 AmJPathol,1988.13I189—189 2浦权主编.骨髓活检病理学.暗尔滨-黑龙江科学技术出版 社,19931415. 3浦权,浦杰编着.骨髓增生异常综合征的基础与临床.上海: 上海科学技术文献出版社,1996.49—45. (收穑19961125修回I1997—05—23) (校对:张吉贤) 用"乒乓效应,,和32?C培养提高重组逆转录病毒滴度厶 尹芳伍柏啪发伍志坚郑维扬周淑芸 ',牛 逆转录病毒载体是目前基因治疗研究中最常用的 外源基因转移工具.常规方法制备的重组逆转录病毒 滴度较低,不能满足转染效率的需要.我们将逆转录病 毒载体质粒转染混合培养的两种包装细胞PA317和 GPE86,并在32"C条件下培养产病毒细胞,获得了比常 规条件下滴度高一个数量级的重组逆转录病毒.现报 道如下. 材料和方法 1质粒和细胞株包装细胞PA317,GPE86,NIH/ 3T3细胞及逆转录病毒载体质粒oLNCX,oLNCIL一2, 均为美国南加州太学儿童医院周辰博士惠赠 2主要试剂脂质体转染剂Lipofectin,筛选用药物 G418瑚胞培养基DMEM均购自生命技术公司. 3细胞培养条件PA317,GPE86和NIH/3T3细胞 在37c,5CO,古l0胎牛血清和100U/L青,链霉 素的DMEM中生长 4产病毒细胞株的获得用Lipofectin将pLNCX, pLNCIL一2分别导入包装细胞PA317中,待产生G418 抗性的细胞克隆后,随机挑取8个细胞克隆,分别进行 扩大培养用改良方法则将oLNCX,pLNCIL一2分别 导入混合培养的包装细胞PA317和GPE86中.待产生 G418抗性的细胞克隆后.随机挑取l5个细胞克隆,分 别进行扩太培养. 5聚合酶链反应(PCR)鉴定混合细胞克隆中的 PA317细胞克隆获得的15个克隆细胞分别扩太培 养后,提取细胞DNA,用PA317细胞包装蛋白基因env 作者单位:510515广州,第一军医大学南方医院 的引物?进行PCR扩增.引物序列: P_5一ACCTGGAGATCACCAACC+3' 5一TACTTTGGAGAGGTCGTAGC一3'. PCR条件参照文献[1].出现411bp条带的为PA317 细胞,否则为GPE86细胞. 6病毒上清的收集 6.1常规方法:产病毒的PA317细胞在培养瓶中长至 8O,9O铺满后.换入新鲜DMEM垒培养浪.培养 24小时后收集细胞培养上清,经0.45m滤膜抽滤后, 置70C保存备用. 6.2改良方法:将细胞培养的温度改为32"C,其余与 常规方法相同. 7病毒滴度的测定参照文献[2]进行,靶细胞为 NIH/3T3细胞. 8PCR检测有复制能力的逆转录病毒(RCR)以重 组病毒感染的NIH/3T3细胞DNA为模板.扩增env 基因,条件同方法"5". 结果 1G418抗性的包装细胞克隆的形成经G418选择 培养l4天,得到的抗性细胞克隆数目见表l 衰1包装细胞经质粒DNA转染和 G418选择后形成的克隆数目 2PCR鉴定混合细胞克隆中的PA317细胞克隆由 于PA317细胞与GPE86细胞中eIIV基因来源不同?.