淀粉酶活力的测定

淀粉酶活力的测定 淀粉酶活力测定 一、实验目的 以所筛选出的芽孢杆菌为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。通过本实验要掌握测定酶活的方法。 二、实验原理 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖与DNS试剂共热呈阳性反应，产生红棕色;而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。 酶活力也称酶活性，是以酶在最适温度、最适pH等条件下，催化一定的化学反应的初速度来表示。本实验是以一定量的淀粉酶液，于37?C、pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间里将淀粉转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色测定，求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力。这里规定，一个淀粉酶活力单位定义为在37?C、pH6.8的条件下，每分钟水解淀粉生成1mg还原糖所需的酶量。 三、 实验材料及设备 1、筛选出来的产淀粉酶芽孢杆菌。 2、菌种:从商丘师院土壤中分离出的产淀粉酶的芽孢杆菌 3、种子培养基:蛋白胨1 % ,酵母浸出物0. 5 % ,氯化钠1 % , pH自然 4、发酵培养基:按正交试验所选的最佳来配置 5、仪器:控温摇床、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、分光光度计、烧杯、玻璃棒、锥形瓶、离心机、刻度试管: 25mL×4、容 量 瓶: 100mL×1、烧 杯: 250mL×1、滴 管 2支、洗耳球2支、洗瓶、试管架、移液管架、移液管、玻棒: 各1支 四、 试剂的配制 1、培养基的配制 按上述配方称量、溶解、灭菌 2、 淀粉溶液(0.5%) 称取5g可溶性淀粉，溶于1000mL热水中。(临用前配制) 蔗糖溶液(1%) 3、 3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂) 将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200mL 2N NaOH溶液中(不适宜用高温促溶)，接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000mL。暗处保存备用。 4、 磷酸缓冲液(0.2mol/L，pH6.8) 5、 NaOH溶液(6mol/L) 6、 NaCl溶液(0.3%) 五、 操作步骤 1、 淀粉酶的制备 (1)菌的培养 菌种活化:将保存的菌种转接到斜面培养基,37 ?培养24 h ,备用。 种子液的制备:取一环活化的菌种,接入装量为50 mL 种子培养基的250 mL 三角瓶中,37 ?,180 r/ min 培养18 h。 摇瓶培养:分别取1 mL 种子液,接入盛有50 mL发酵培养基的200 mL三角瓶中(接种量为2 % ,V/ V) 。置摇床中,30 ?振荡培养24 h ,转速为160 r/ min (2)酶的提取:液体培养基在3000r/min的离心机中离心10min，取上清; 2、淀粉酶活力的测定 取25mL刻度试管4支，按下表编号并操作，记录实验结果。 管号 试剂(ml) 1 2 3 4 pH6.8缓冲液 1 2 1 2 蔗糖溶液 1 1 淀粉溶液 1 1 淀粉酶液 1 1 酶促反应 摇匀，37?水浴5min DNS试剂 2 显色反应 沸水浴5min 光密度 (D540) 六、 结果处理 根据上表的实验结果，以蔗糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制出 曲线。 α-淀粉酶活性由下式求得: A=(500×f/m)×〔100/(100-h)〕×(lgD1-lgD2)/(t1-t2) =500×f?b/m)×〔100/(100-h) 〕 式中: A??α-淀粉酶活性; m?? 100mL氯化钙提取的试样质量，g; h?? 试样中水分含量，,; f?? 酶提取液的稀释倍数; t1、t2?? 不同的反应时间，min; D1、D2?? 时间t1、t2时的吸光度; b?? lgD对t的曲线的斜率的绝对值; 500??系数。