海水干预诱导人肺泡上皮细胞低氧诱导因子-1α表达研究（可编辑）

海水干预诱导人肺泡上皮细胞低氧诱导因子-1α表达研究（可编辑） 解放军医学院硕 士学位论文 分类号:R563.9密 级: 公开 海水干预诱导人肺泡上皮细胞低氧诱导 因子-1 α 表达的研究 Expression of hypoxia-inducible factor-1α in alveolar epithelial cells induced by seawater作 者姓名 :王庆 学 科专业 :内科学 (呼吸 病学) 导 师 :冯华松 教授 答 辩委员 会主席: 论 文 日期:二 0 一三 年五月二 十八 日 院 校地址 :北京市 复兴 路28 号 邮 政编码 :100853解放军医学院硕 士学位论文 解 放军医 学院 研 究生学 位论 文原创 性声 明 秉承我院“忠诚、敬业、和谐、创新”的学风,本人声明:所呈交 的论 文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据 我所知,除 了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含任何其他个 人或集体己 经发表或撰写过的研究成果,也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证 书而使用过的材料,对本文的研究作出贡献的个人或集体,均已在文中做了 明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。 论文作 者签名 : 日期: 指导教师签名 : 日期: 解 放军医 学院 研 究生学 位论 文版权 使用 授权书 本人保证毕业离院后 ,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为军医 进修学院或解放军总医院 。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文 原件、复印件和电子版本 ,可以采用影印 、缩印、扫描或其它手段保存论文 以供被查阅和借阅 。学院可以公布学位论文的全部或部分 ( 保密内容除 外)。 论文作者签名 : 日期: 指导教师签名 : 日期:解放军医学院硕 士学位论文 目 录 英文缩略词中英文对照表. 1 中文摘要 3 Abstract. 5 前言. 7 材料与方法 11 1 材料 11 1.1 细胞. 11 1.2 主要试剂11 1.3 主要仪器11 1.4 人工海水配制12 2. 方法12 2.1 细胞培养12 2.2 实验分组12 2.3 细胞形态观察. 13 2.4 MTT 检测细胞增殖活性13 2.5 蛋白免疫印记法检测 HIF-1α 蛋白的表达13 2.6 放射免疫法检测细胞培养上清液中 TNF-α 、IL-6 的含量. 15 2.7 统计学处理 16 结果 17 1 瑞氏- 吉姆萨染色观察海水干预后 A549 细胞形态学的改变. 17 2 海水干预 不同时间 A549 细胞的生长曲线及细胞生长抑制率 17 3 海水干预不同时间 A549 细胞 HIF-1α 蛋白的 表达 19 4 海水干预不同时间 A549 细胞上清液中 TNF-α 、IL-6 的含 量 19 讨论 21 小结 25 参考文献26 综述一 缺氧诱导因子-1 与急性肺损伤 30 综述二 海水淹溺肺损伤的研究现状 37 攻读学位期间发表文章情况. 44 致谢 45解放军医学院硕 士学位论文 英 文缩略 词中英文 对照表 英文缩写英文全称 中文全称 ALI acute lung injury 急性肺损伤 ARDS acute respiratory distress syndrome 急性呼吸窘迫综 合征 COX cyclo-oxyge-nase 环氧合酶 EPO erythropoietin 促红细胞生成素 ET-1 endothelin-1 内皮素-1 HIF-1 hypoxia inducible factor-1 低氧诱导因子-1 HO-1 hemeoxygenase-1 血红素氧化酶-1 HRE hypoxia response elements 缺氧反应元件 IGF-2 insulin-like growth factors-2 胰岛素样生长因子-2 IL-1β interleukin-1? 白介素-1IL-6 interleukin-6 白介素-6 iNOS inducible NOS 诱导型一氧化氮合酶 IOD integrated optical density 累计光密度值 JAK Janus kinase Janus 激酶 MAPKs mitogen-activated protein kinases 丝裂原活化蛋白激酶 MTT methylthiazoletetrazolium 二甲基四氮唑兰 NF-κB nuclear factor κB 核转录因子 PE-SWD pulmonary edema of seawater drowning 海水淹溺肺水肿 PI3K phosphatidylinositol 3-kinase 磷脂酰肌醇 3-激酶 PPAR peroxisome proliferator activated receptor 过氧化物酶增殖体激活 受体 RIA radio immunoassay 放射免疫分析法 RIP receptor-interacting protein 受体互动蛋白 SIRS systemic inflammatory response 全身炎症反应综合征 syndrome STAT signal transducer and activator of 信号转导子和转录激活 1解放军医学院硕 士学位论文 transcription 子 SWD-ALI seawater drowning induced acute lung 海水淹溺急性肺损伤 injury SW-RDS seawater respiratory distress syndrome 海水型呼吸窘迫综合征 TLRs Toll-like receptors Toll 样受体 TNF-α tumor necrosisi factor 肿瘤坏死因子 α VEGF vascular endothelial growth factor 血管内皮生长因子 2解放军医学院硕 士学位论文 作 者:王庆 学科专 业: 呼吸内科 导 师:冯华松 海 水干 预诱 导人 肺泡 上皮 细胞 低氧 诱导 因子-1α 表 达的研 究 中文摘要 目的: 建立海水淹溺肺损伤的细胞模型,通过观察 海水干预后肺泡上皮细胞 HIF-1α 蛋白的表达变化 及其与细胞损伤程度、炎性因子表达的相互关系,初 步探讨HIF-1α 在SWD-ALI 中的可能作用 。 方法: 肺泡上皮细胞来源的 A549 细胞系, 分为正常对照组C 和海水处理组S 。 C 组用新鲜培养基常规培养,S 组经灭菌配方海水孵育 0.5h、1h 、2h、4h、 8h。 1、光镜观察 瑞氏-吉姆萨染色后细胞形态变化 2、MTT 检测细胞增殖 3、蛋白免疫印记法检测各组细胞 HIF-1α 蛋 白的表达4、放射免疫法检测细胞培养上清液中 TNF-α 、IL-6 的含量 结 果: 1、 海水处理后 A549 细胞失去正常长梭形或多角形形态, 细胞变圆、 胞 体变小,部分细胞出现核浓缩、深染、核碎裂表现。 2、 与对照组相比, 海水处理组 A549 细胞的生长曲线发生变化, 海水干 预 0.5h、1h 组细胞生长抑制率较对照组比较无统计学 差异P0.05 ,海水干 预 2h、4h、8h 组细胞生长抑制率较对照组比较有统计学 差异P0.01 ;细胞 生长至 48h 和 72h 时,海水干预 4h 组细胞生长抑制率较 2h 组有统计学 差异 P0.05 ,海水干预 8h 组细胞生长抑制率较 4h 组有统计学差异P0.01 。 3解放军医学院硕 士学位论文 3、与对照组相比,HIF-1α 在海水干预 1h 后开 始升高,2h 时升高明显 P0.01 ,4h 达高峰P <0.01 , 此后 HIF-1α 蛋白表达逐渐下降, 但仍显著高 于对照组P <0.01 。 4、TNF-α 与 IL-6 在海 水干预 1h 后开始升高,2h 达高峰P <0.01 ,4h 及 8h 组较对照组 比较无统计学差异。 结论:1、 海水干预导致肺泡上皮细胞发生了不同程度的损伤, 海水长时间干预 可导致肺泡上皮细胞生长受抑。 2、 海水干预可诱导肺泡上皮细胞 TNF-α 、IL-6 的表达, 海水干预 后肺泡 上皮细胞发生了炎症反应 。 3、 海水干预可诱导肺泡上皮细胞 HIF-1α 蛋 白表达;HIF-1α 及相关 基因 表达可能参与了海水干预所致肺泡上皮细胞损伤 及炎症反应的过程。 关 健词 :海水, 肺泡上 皮细胞,低氧诱导因子-1α ,TNF- α ,IL-6本课题由海军后勤科研项目基金资助(No. BHJ08JD06 ) 4解放军医学院硕 士学位论文 Expression of hypoxia-inducible factor-1α in alveolar epithelial cells induced by seawater Abstract Purpose: To investigate the possible role of HIF-1α in SWD-ALI by observe the expression of HIF-1α in alveolar epithelial cells and its relationship with the degree of injury and the expression of inflammatory factors after seawater intervention Methods: Divided the A549 cells which derived from the alveolar epithelial cells into control groupC and seawater treatment groupS. Group C is conventionally cultured by fresh medium, and group S is cultured by sterilized seawater for 0.5h, 1h, 2h, 4h, 8h1. Observe the changes in cell morphology after Wright-Giemsa staining by optical microscope2. Detect the cell proliferation by MTT3. Detect the expression of HIF-1 α in different groups by Western blot4. Detect the content of TNF-α and IL-6 in cell culture supernatant by radioimmunoassay Results: 1. Cell morphology showed obvious changes like smaller, round, nuclear enrichment, hyperchromatic nuclei, nuclear fragmentation after seawater treatment2. Compared with the control group, the growth curve of A549 cells in the seawater treatment group changed, and the growth inhibition rate of 2h, 4h, 8h groups were differentP0.05, when cells growed to 48h and 72h the growth inhibition rate of 4h, 8h groups increased with the extension of seawater treatment time5解放军医学院硕 士学位论文 3. Compared with the control group, the expression of HIF-1α increased after seawater treatment for 2h, and reached the peak at 4h P0.01, then decreased slightly, yet still higher than that in the control groupP0.014. The expressions of TNF-α and IL-6 in seawater treatment group increased after 1h, reached the peak at 2hP0.01, after 4h and 8h they didn’t show statistical differences from control groupConclusions: 1. Seawater intervention can make the growth curve of alveolar epithelial cells change. Seawater intervention for a long time can lead to the growth inhibition of alveolar epithelial cells2. Seawater intervention can induce the expressions of TNF- α and IL-6 in alveolar epithelial cells. It can lead to the inflammatory reaction in alveolar epithelial cells3. Seawater intervention can induce the expression of HIF-1 α in alveolar epithelial cells, which may play an important role in the damage of alveolar epithelial cells and inflammatory response in alveolar epithelial cells induced by seawaterKeywords: seawater, alveolar epithelial cells, hypoxia inducible factor-1α, TNF-α, IL-66解放军医学院硕 士学位论文 前言急性肺损伤 (acute lung injury ,ALI ) 是以 渗出、低氧和水肿为特征的急 [1] 性系统性炎症过程在肺部的表现 ,可由心源 性以外的各种肺内外因素所 致。严重的ALI 或ALI 的最终严重阶段被定义为急性呼吸窘迫综合征 (acute respiratory distress syndrome ,ARDS )。1994年欧美ARDS 联席会AECC 将 [2] ALI/ARDS 的病因归结为直接肺损伤和间接肺损伤两大类 。 直接肺 损伤因素 主要包括严重的肺部感染、胃内容物吸入、肺挫伤、淹溺等;间接肺损伤因 素主要包括全身炎症反应综合征 (systemic inflammatory response syndrome , SIRS )、脓毒症、休克等。目前认为,ALI/ARDS 发病的根本原因是肺内过 [3] 度、 失控的炎性反应 , 其共同病理改变是肺泡- 毛细血管膜的急性弥漫性损 伤。 海水作为ALI/ARDS 独特的致伤因素,具有低温、高渗、偏碱性和含菌 [4] 量大的特点,其对呼吸道和肺泡的直接损伤作用较淡水更为严重 。 海水淹 溺后, 引起死亡的主要原因是海水淹溺肺水肿 (pulmonary edema of sea water drowning ,PE-SWD ) 。PE-SWD 可经过ALI 的阶段进一步发展为海水型呼吸 窘迫综合征 (sea water respiratory distress syndrome ,SW-RDS ) 。 自二 十世纪 九十年代以来, 国内外学者通过向气管内灌入海水的方法成功建立了绵羊、 兔、 犬、 大鼠等海水淹溺 肺损伤 (seawater induced acute lung injury , SWD-ALI ) 动物模型, 同时, 诸多 分子生物学研究的开展使得人们对SWD-ALI 的 研究逐 步转向炎症发生、 调控 方面, 目前认为SWD-ALI 的发病机制可能为海 水对气 [1,5] 道和肺泡上皮的直接损伤及海水淹溺后机体炎症反应的过度表 达 。 在救治 方面,确立了以机械通气为主 ,辅助糖皮质激素、血管活性药物等 的综合治 疗,这些措施虽能在一定程度上能减轻肺部过度炎症反应,提高 氧合, 但总体救治成功率不高。 我国是一个海洋大国,拥有漫长的海岸线和广阔的领海。 随着科学技术 的发展和海洋战略地位的提高,世界各国对海洋主导权的争夺日益进入白热 化,由此产生的海上危机更是层出不穷。因此无 论在平时还是战时,海洋卫 勤保障的问题都显得日益突出和重要,这使得针对海洋卫勤保障特点的研究 显得极为迫切。 7解放军医学院硕 士学位论文 氧是维持细胞生命活动所必须的基本物质。 缺氧是一种常见的病理过程。 虽然不同类型细胞对缺氧的敏感性不同,但是,随着缺氧严重程度和持续时 间的增加,最终都会引起细胞的代谢和功能障碍,甚至死亡。细胞为了对抗 这种缺氧损伤反应,可以通过氧感受器和相关的信号转导系统,启动一系列 [6,7] 内源性保护机制 。 大 量研究结果提示, 低氧 诱导因子-1 (hypoxia-inducible [8,9] factor-1,HIF-1 )可能 是这种内源性保护机制的中心环节 。 [10] HIF-1是由Semenza 等 于1992年在缺氧诱导的肝细胞癌细胞株细胞核 提取物中发现的一种转 录因子,它是由120KD 的α 亚单位和91-94KD 的β 亚单 位构成的异构二聚体,其中HIF-1α 是HIF-1的 特异性蛋白,它既是HIF-1的调 节亚基又是活性亚基,其蛋白稳定性和转录活性均受细胞内氧浓度的调节 [11,12] 。HIF-1β 又称为芳 香烃受体核转运蛋白 (aromatic hydrocarbon receptor nuclear translocator ,ARNT ),在细胞中组成性表 达,其活性不受缺氧的影 响。 在常氧条件下, HIF-1α 由其结构中的氧依赖降解结构域 (oxygen-dependent degradationdomain ,ODDD )控制,并通 过泛 素- 蛋白酶体途径迅速降解。但 在缺氧环境下, HIF-1α 蛋白降解受阻, 在细胞内聚集, 并与β 亚基形成二聚体。 HIF-1通过HIF-1α C 末 端的转录激活区域诱导辅激活蛋白CBP/P300 入 核, 共同 形成大分子复合物,与缺氧反应基因的缺氧反应元件(hypoxia response [13,14] elements ,HRE ) 上的HIF-1结合位点结合, 调 控多种基因的转录和翻译 。 [15] 目前已知受 HIF-1 调控 的基因百余种 : 促红 细胞生成素 (erythropoietin , EPO ) 、 血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor ,VEGF ) 、 诱 导型一氧化氮合酶 (inducible NOS , iNOS ) 、 血红素氧化酶-1 (hemeoxygenase , HO-1) 、 内皮素-1 (endothelin-1, ET-1)、 血小 板源性生长因子 (platete derived growth factor ,PDGF ) 、葡萄糖载体蛋白-1、3(glucose transporter-1 、3, [16] GLUT-1、3) 、 环氧合酶 (cyclo-oxyge-nase ,COX ) 等。Manalo 等 用 DNA 微数列研究后报道,动脉上皮细胞内的 HIF-1α 基因可调节超过 2% 的人类基 因。这些基因产物可通过提高糖酵解效率、促进血管生成和增加葡萄糖转运 等多种途径来维持细胞在缺氧环境中的生存,对抗缺氧损伤。 同时 HIF-1 及 其诱导表达的基因还在生理性缺氧如干细胞微环境、 胚胎发育过程 中的组织 细胞分化,以及多种病理状态如肿瘤的发展、转移中发挥着重要作用。 8解放军医学院硕 士学位论文 炎症是机体对感染和损伤的正常反应。由于炎症区域有缺氧的特征,近 [17] 年来发现了HIF-1α 的炎 症调节作用。 1999 年, Hellwig-Burgel 等 发现 , IL-1β 、 TNF-α 能激活HIF-1,诱 导关节炎中巨噬细胞HIF-1α 的产生,从而推断HIF-1 [18] 参与了炎症反应的基因表达调控过程。Yun 等 报道,阻断巨噬细胞 和中性 粒细胞在低氧条件下的糖分解途径能够抑制炎症反应。在巨噬细胞和中性粒 细胞中对HIF-1α 进行定 点缺损后,发现这些细胞不能聚集、运动和转移到损 伤组织,炎症反应因此被抑制。进一步用诱导关节炎的刺激作用用于HIF-1α 缺损的小鼠,发现不能引发相应的炎症反应。由此认为HIF-1α 对于炎 症反应 的过程非常重要。 目前已知IGF-1与2、IL-1β 、TNF-α 、PGE 及LPS 等致炎性 2 细胞因子能激活HIF-1α 的转录活性,提示HIF 与炎症过程的密切关系 。此后 也有大量的研究表明,氧浓度并非是调节HIF-1α 的惟一因素,在炎症环境下 某些炎性介质、 生长因子、 活性氧等对HIF-1α 诱导、DNA 结合活性以 及下游 基因的表达有重要的调节作用。 由于HIF-1 对低氧刺 激 的特异感受以及广泛参与低氧对多种 基因转录的 诱导,从而引起国内外学者的高度重视。目前国外对HIF 的研究多集 中在免 疫、炎症、代谢及干细胞生物等方面,涉及到全身诸多系统和细胞系的生理 及病理生理进程,例如HIF-1在低氧性肺动 脉 高压、缺血性心血管功能障碍、 肿瘤的发生发展、 休克及炎症中的作用等。 那么,HIF-1在急性肺损 伤中的作 用又如何呢?研究表明在缺血缺氧肺损伤中存在大量的细胞凋亡现象 ,包括 炎性细胞、 肺泡?型上皮细胞以及肺微血管内皮细胞。HIF-1在缺氧 组织细胞 凋亡中扮演着双重角色,既可发挥抗凋亡作用又可发挥促凋亡作用,其对凋 亡是促进还是抑制,文献报道观点不一,可能与受其调控的靶基因相关。 也 [19] 有报道缺氧通过HIF-1α 诱导了肺泡?型上皮细胞的凋亡 。 而关于随 之的肺 纤维化改变, 则认为HIF-1的上调可能抑制了上皮细胞损伤的修复, 提示HIF-1 的水平增加可能使损伤加剧,缺氧 肺在上皮细胞损伤后更无法产生合适的修 [20] 复反应 。ALI 的机制 尚未完全阐明, 而HIF-1作为机体氧稳态的主要调节因 子,同时也是重要的炎症调节因子, 在ALI 的 发生发展中必然起到了关键性 的调控作用, 我们应对ALI 进行更深入的分子 生物学研究, 从而探索HIF-1在 ALI 中扮演的确切角色 。 9解放军医学院硕 士学位论文 SWD-ALI 作为一种特殊 类型的ALI ,其机制更 为复杂,且病情进展快、 救治难度大、死亡率 极高,因此,深入研究海水淹溺的发生、发展机制 ,制 定科学有效的救治 , 是提高海水淹溺 救治 成功率的关键。SWD-ALI 的发 生机制仍在逐步探索中, 而HIF-1是否参与到 了SWD-ALI 过程中的 细 胞损伤、 炎症反应、增殖与修复等多个环节 亦或某个环节, 目前尚无两者相关性的研 究报道。因此本研究 希望将HIF-1作为研究SWD-ALI 的一个切 入点, 探讨 HIF-1与SWD-ALI 的 关 系以及HIF-1在SWD-ALI 中的调控作用, 通过 干预 HIF-1在SWD-ALI 中 的 各种信号通路、抑制相关受体或靶蛋白的表达等,为 治疗SWD-ALI 提供新的 途径, 也为我军海上军 事斗争及平时海难、 海 上事故 救治做好技术储备。10解放军医学院硕 士学位论文 材 料与方 法 1 材料 1.1 细胞 人肺泡腺癌细胞株 A549 „„„„„„„„„„„ 军事医学科学院惠赠 1.2 主 要 试剂 DMEM/F12K 培养基„ „„„„„„„„„„„„„ 迈晨科技有限公司 RPMI1640 培 养基 „ „ „„„ „„„ „„ „„ „„„ „ 北京 凯欣 杰公 司 0.1mol/L PBS „„ „„ „„„„„ „„„ „„ „„„„ 北 京凯欣 杰公 司 PBST „„ „„ „„ „„ „ „„ „ „„ „„ „„ „ „„ 北 京凯 欣杰 公司 胎牛血清„ „„„„ „ „„„„„ „„„ 北 京 元亨圣马生 物技术研 究 所 胰蛋白酶„ „„„„ „ „„„„„ „„„„ „ 凯欣杰生物 科技有限 公 司 瑞氏- 吉 姆 萨 染 色液 „„ „ „ „ „ „ „„ „ „ 海 军 总 医 院 血 液科 实 验室 兔抗人 HIF-1α 多克隆 抗体 „„„„„„„„„„„„ Santa Cruse 公司 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 抗体„„„ „„„„„„„KPL 公司 总蛋白提取 液 „„„ „ „„„„„ „„„„ „ „„„ 北京 康为世纪 公 司 十二烷基硫酸钠SDS „„„„„„„„„„„„„„ 美国 sigma 公司 30%Arc/Bis 丙烯酰胺 „„„„„„„„„„„„„ 美国 Amersco 公司 ECL 发光液 „„„„„ „„„„„„„„„„„„„ 美国 Millipore 公司 MTT 细胞增殖及细胞 毒性检测试剂盒 „„„凯欣杰生物科技有限公司 TNF-α 放免试剂盒 „„ „„„„„„„„„„ 北京华英生 物技术研究所 IL-6 放免试剂盒 „„„ „„„„„„„„„„ 北京华英生物技术研究所 1.3 主 要仪 器 EP 管 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 德国 Ependorf 公司 离心管„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 德国 Ependorf 公司 移液器„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 德国 Ependorf 公司 醋酸纤维素微孔滤膜0.22μm „„„„„„ 北京优晟联合科技有限公司 JD-4 电子天平 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 北京衡达公司 双人单面超 净工作台 „ „„„„„ „„„„ 北 京冠鹏净化 设备有限 公 司 11解放军医学院硕 士学位论文 Revco Ultima II CO 细胞培养箱„„„„„„„„„„ 美国 Revco 公司 2 Multiskan MK3 酶标仪„„„„„„„„„„„„„„ 美国 Thermo 公司 光学显微镜 „„„„„„„„„„„„„„„„„„ 日本 Olympus 公司 B320A 医用低速离心机 „„„„„„„„„„ 北京白洋离心机有限公司 湘仪 H1650 台式高速离心机„„„„„„ 湖南湘仪离心机仪器有限公司 回旋式脱色 摇床 „„ „ „„„„„ „„„„ „ „„„ 江苏 金坛精达 公 司 凝胶电泳成像分析系统 „„„„„„„„„„„„„ 美国 Bio-Rad 公司 r-911 全自动放免计数 仪 „„„„„„„„„ 中国科技大学实业总公司 1.4 人 工 海水 配制 按照中国国家海洋局第三海洋研究所海洋生化研究室提供的我国东南沿 海海水主要成分 配制:NaCl 26.518g/L ,MgCl 2.447 g /L ,MgSO 3.305 g 2 4 /L ,CaCl 1.141 g /L ,KCl 0.725 g /L ,NaHCO 0.202 g /L ,NaBr 0.083 g 2 3 /L ;渗透压 1300 mmol /L ,pH 8.2 ,比重 1.05-1.06。海水现 配现用,所配海 水 8h 后遗弃不 再使用。 2. 方法 2.1 细 胞培 养 将 A549 细胞接种于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基,常规置于含 5%CO 的 37? 饱和湿 度的恒温密闭培养箱内 培养。定期观察细胞生长情况, 2 每 2~3 天换液 1 次,4~5 天用 0.25% 胰酶消化传代。选取对数生长期的细胞 作为实验对象。 2.2 实 验分 组 按实验需要将细胞接种于 6 孔板或 96 孔板,随机分为对照组C 、海水 干预 0.5hS 、1hS 、2hS 、4hS 、8hS 组,蛋白免疫印记 增加 16hS 1 2 3 4 5 6 组。对照组用新鲜培养基常规进行培养, 海水干预组将 0.22μm 滤膜 过滤除菌 的海水与 DMEM 培养基以 1 :3 的比例 渗透压相当于 350mosm/L 混合后孵 育细胞,各组细胞干预相应时间后收集上清液和细胞用于指标检测,实验重 复三次。 12解放军医学院硕 士学位论文 2.3 细 胞 形态 观察 1 用金属镊子夹住盖玻 片,在70% 乙醇中浸泡后置于火焰上烤干。 2 在无菌状态下将干燥 的玻片放置于6孔培养板中,将细胞接种于已放 置小盖片的6孔板内。随机分为正常对照组和海水干预24h组。 3 当细胞生长至70%~80% 时, 吸出培养液, 取出盖玻片, 在室温下通风 晾干。 4 将细胞爬片固定于玻 片上, 2% 吉姆萨染色液染色5min , 轻轻冲去染 液。 5 普通光学显微镜下观 察细胞形态,并予拍照记录。 2.4 MTT 检 测细 胞增殖活 性 3 1 选择对数生长期细胞 ,先制成2×10 个/ml A549细胞悬液,接种于96 孔板内,每孔200μl 。 2 待细胞完全贴壁后, 按分组予海水干预不同时间,每组设6个 复孔, 分别培养24h、48h、72h。 3 每孔加入MTT5mg/mL10μl ,在37?细胞 培养箱内继续孵育4h。 4 每孔加入Formanzan 溶解液100ul ,在培养箱内继续孵育,直至光镜下 观察formanzan 全部溶 解。 5 以无细胞培养基作为 空白调整本底,在570nm 处测定吸光度值A 。 6 以时间为横坐标,吸 光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 7 按以下计算细胞 生长抑制率: 细胞生长抑制率 1? 实验孔测定值/ 对照孔测定值×100 % 。 2.5 蛋 白免 疫印 记法western blot检测 HIF-1α 蛋 白的 表达 1 组织蛋白抽提 ?细胞收集好,加入 1ml 总蛋白提取液,充分吹打 ,然后冰上放置 10~20min 后,再吹 5min~20min ,将匀浆液吸出放到 1.5ml 离心管中。 ?超声 3 次,每次 3s 。 ?9000rpm ,离心 10min ,取适量上清置于新的 1.5ml 离心管中。 ?-20?冻存。 2 蛋白浓度测定: 由于 采用内参法校正, 省略根据总蛋白浓度估算点样 法。 13解放军医学院硕 士学位论文 3SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE 凝胶电泳 ?准备蛋白样品:按每孔上样 50ug 计算上样 体积,加入上样缓冲液 体 积比为 5:1 ,混匀,在 100?加热三分钟以使蛋白质变性。 ?加入电泳缓冲液,上样。 ?将电泳装置与电源连接好,在 200V 恒定电压下电泳至溴酚蓝迁移到 分离胶底部 0.5cm 处,关闭电源。 ?从电泳装置上卸下凝胶玻璃板,用去离子水冲洗干净。 4 转膜 ?将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中,浸泡 15~20min 。 ?裁剪好滤纸Whatman ,3MM CHR 和电转膜,滤纸和膜大小为 83mm×75mm ,尽量避免污染滤纸和膜,将裁减好的滤纸和膜浸泡在电泳转 移缓冲液中,并注意排去留于膜上的气泡。 ?打开转移盒并放置浅盘中,用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后 将其放 在转移盒壁上,海绵上再放置一张浸湿的 Whatman ,3mm 滤纸。 ?小心将凝胶放置于滤纸上,避免气泡。 ?用去离子水清洗缓冲液槽,在缓冲液槽中放入搅拌子,将另一块海绵 用转移缓冲液浸透后放在凝胶- 膜上,关上转移盒并插入转移槽。 ?将冰盒装入缓冲液槽,注满 4?预冷的转移缓冲液。 ?将整个装置放在磁力搅拌器上并开始搅拌,连接好转移电极恒 流 300mA 转移 70min 。 ?电转完毕后,将电转膜置于 5% 的脱脂奶粉PBS 配制 中封闭,37?2 小时过夜。 5 抗体孵育 ?封闭的膜用 PBST 漂洗 3 次,每次 5min 。 ?将加样槽洗涤干净, 用蒸馏 水润洗, 晾干, 将膜用一次性手套覆盖好, 按标记和实验设计切下膜条 一般为 3 mm 宽左右 按顺序置于加样槽中, 加入 相应的一抗约 1ml ,4?摇床缓慢振摇孵育过夜。 ?弃去一抗,加 PBST 于摇床上缓慢振摇洗涤 3 次,每次 5min 。 ?弃去 PBST ,加入稀释好的 HRP 标记的二抗,室温下于摇床孵育 1h。 14解放军医学院硕 士学位论文 ?弃去二抗,加入 PBST 于摇床缓慢振摇洗涤 3 次,每次 5min 。 6 化学发光,显影,定 影 2 ?按照 ECL 发光试剂 盒说明,将 ECL 液按 10cm 膜加 1ml 工作液 的比 例均匀覆盖在 PVDF 膜 上,避光反应 3-5min 。 ?将背景较高的底片放入 PIERCE 公司 X 光片 背景去除液中, 观察到理 想的结果时,终止反应,用清水漂洗。 7 图像分析 阳性条带以 Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其 IODintegrated optical density ,累积光密度参 考值 。分析实验中 HIF-1α 蛋白 2 的灰度值INT×mm , 同时以内参 GAPDH 蛋 白表达的强度为基准,按下式 计算相对系数:表达强度 相对系数 转录因子/GAPDH 的灰度值。 未观察 到电泳条带或条带位置不正确者判为阴性。 2.6 放 射免 疫法radio immunoassay ,RIA 检 测细 胞培养 上 清 液中 TNF-α 、 IL-6 的 含量 收集细胞培养上清液,3000rpm/min 离心5min , 取上清, 严格 按试剂 盒说 明书进行操作,以IL-6 为例加以说明。 ?采用平衡法,取聚苯乙烯试管编号,按下表操作。 IL-6 RIA 加液程序( 单位:ul ) The procedures of adding liquid with IL-6 RIA 试 剂 T NSB S S -S 样品 0 1 5 缓冲液 ? 200 100 ? ? 标准品 ? ?? 100? 样 品 ? ?? ? 100 抗 体 ? ?100 100100 125 I-IL-6 100100 100 100100 摇匀 4? 放置 24 小时 分离剂 ? 500 500 500 500 15解放军医学院硕 士学位论文 充分混匀,室温放置15分钟后,3500 转/ 分4?离心25分钟,弃上清液, 测沉淀cpm 数。 ?结果计算: 以自动γ 计数器预先编制程序, 直接给出有关参数, 标准曲线及 样本浓度。 NSB%NSB 管的cpm 数?T 管的cpm 数×100% B %B 管的cpm 数-NSB 管的cpm 数?T 管的数×100% 0 0 B/ B % 标准或样本管 的数- NSB 管的cpm 数?B 管的cpm 数-NSB管的cpm 0 0 数×100% 2.7 统 计学 处理 计量数据以均数? 标准差 ?x?s 表示。多组间比较采用单因素方差分析, 两组间比较采用 t 检验。以上统计学分析均以 SPSS 18.0 统计软件进行处理。 P0.05 表示差异有统计学意义。 16解放军医学院硕 士学位论文 结果 1 瑞氏- 吉姆 萨染 色观察 海水 干预后 A549 细胞 形态 学 的改 变 对照组A549 细胞呈梭形或多角形,胞核为椭圆或类圆形(图A )。海水 处理后A549 细胞失去正常长梭形或多角形形态, 细胞变圆、 胞体变小, 部分 细胞出现核浓缩、深染、核碎裂(图B )表现 。A 对照组 B 海水 干预组 图1 海水对A549 细胞形态学的影响 (瑞氏- 吉姆萨染色,10×40) 2 海 水干 预 不 同时间 A549 细 胞的 生长 曲线及细 胞生 长抑制 率 MTT 结果显示, 海水干预后A549 细胞的生长曲线发生了变化(图2)。 海水干预0.5hS 、1hS 组细胞在24h、48h、72h测得细胞生长抑制率较对照 1 2 组比较无统计学 差异S vs C , S vs C , P0.05 , 海水干预2hS 、 4hS 、 8hS 1 2 3 4 5 组细胞在24h、 48h 、 72h 测得细胞生长抑制率较对照组比较有统计学 差异S vs 3 C ,S vs C ,S vs C ,P0.01 ; 细胞生长至48h 和72h时, 海水 干预4h S 组细 4 5 4 17解放军医学院硕 士学位论文 胞生长抑制率较2h S 组有统计学 差异S vs S ,P0.05 ,海水 干预8h S 3 4 3 5 组细胞生长抑制率较4h S 组有统计学 差异S vs S ,P0.01 ( 表 1) 。 4 5 4 t/h 图2 海水干预各组与对照组A549 细胞的生长曲线 表1 海水干预各组A549 细胞的生长抑制率n3 ,% ?x?s Group 24h 48h 72h C - - - S 2.54?2.28 4.28?3.00 8.92?3.00 1 S 2.46?0.86 4.83?3.64 6.58?6.41 2 ## S 11.36?6.84** 7.04?5.79* 12.12?8.74* 3 # # S 13.29?2.49** 14.25?3.61** 23.13?6.60** 4 ## ## S 18.59?1.43** 27.73?2.09** 39.23?3.78** 5 注: 海水干预各组与对照组比较*P0.05 ,**P0.01 , 海水干预各组 与前 # ## 一组比较 P0.05 , P0.01 18 A570nm 解放军医学院硕 士学位论文 3 海 水 干预不 同时 间 A549 细胞 HIF- 1α 蛋白的 表达 与对照组比较,HIF-1α 蛋白表达于 海水干预2h时升高明显S vs C , 3 P0.01 ,4h时达高峰S vs C ,P0.01 ,此后HIF-1α 蛋白表达逐渐下 降,8h 4 及16h时HIF-1α 蛋白表 达仍 明显高于对照组S vs C ,S vs C ,P0.01 (图3、 5 6 4)。 ?HIF-1 α 132 kD C S S S S S S 1 2 3 4 5 6 ?GAPDH 37 kD 图3 海水干预不同时间A549 细胞HIF-1α 的表达图4 海水干预各组HIF-1α 与GAPDH 的IOD 比 值(与对照组比较*P0.05 , **P0.01 ) 4 海 水干 预不 同时间 A549 细 胞上 清液 中 TNF-α 、IL-6 的含 量 海水干预1h 后, 细胞上清液中的TNF-α 开始升 高S vs C ,P0.05,至2h 2 达最高峰S vs C ,P0.01 , 此后下降,4h及8h组TNF-α 与对照组比较 无统计 3 19解放军医学院硕 士学位论文 学差异S vs C ,S vs C ,P0.05 ; 海水干预1h后, 细胞上清液中的IL-6升高 4 5 S vs C ,P0.05,至2h 达最高峰S vs C ,P0.01 , 此后下降,4h及8h组IL-6 2 3 与对照组比较无统计学差异S vs C ,S vs C ,P0.05 (表2)。 4 5表2 海水干预不同时间A549 细胞上清液中TNF-α 、IL-6的含量 (n3,% ?x?s ) Group TNF-α IL-6 C 0.1208?0.0136 14.99?2.99 S1 0.1238?0.0077 19.30?4.82 * * S2 0.14?0.0107 24.99?6.22 ** ** S3 0.1573?0.0155 34.83?10.12 S4 0.1278?0.0129 20.52?5.77 S5 0.1153?0.0075 16.88?2.77 注:海水干预各组与对照组比较* P0.05 ,**P0.01 20解放军医学院硕 士学位论文 讨论肺泡上皮细胞的完整性对于保持肺功能如气体交换、屏障、分泌表面活 性物质等极其重要。作为海水淹溺后首先受损的靶细胞之一,其结构和功能 的改变, 决定着SWD-ALI 的发展和病情严重程 度。 既往在SWD-ALI 动 物模型 中观察到,肺泡 ?型和?型上皮细胞受损、胞体肿胀、板层小体严重破坏, [21] 并有排空现象, 线粒体嵴断裂或空泡化改变明显 。A549 细胞是来源 于肺泡 上皮细胞的肺腺癌细胞系,具有肺泡上皮细胞的重要特性,其细胞株稳定性 好, 易于培养, 因此本实验以A549 细胞为载体, 进行海水 干预致 肺泡上皮细 胞损伤及HIF-1α 蛋白表 达 变化的研究。 我们发现, 海水干预后,A549 细胞出 现细胞体积缩小、变圆,核浓缩、深染,核碎裂等凋亡特征性改变 ,且与对 照组相比, 海水干预后A549 细胞生长曲线发生了变化, 海水干预2h、4h及8h 组细胞活性减低、 增殖受到明显抑制, 海水干预4h、 8h组细胞生长至48h和72h 时生长抑制率随海水干预时间延长而增加, 以上均说明海水干预导致了肺泡 上皮细胞的损伤,且随着细胞生长时间的增加,细胞损伤程度与海水干预时 间呈正相关。 HIF 属于bHIF-PAS 蛋白家族,HIF 基因定位 于人染色体14q21-q24, HIF-1α 和其识别序列 缺氧反应元件Hypoxia response element,HRE 是细胞 对缺氧环境的主要调节者。 研究表明,低氧状态下哺乳动物细胞内HIF-1α 蛋 [22] [23] 白水平急剧增加 。Palmer 等 发现急、 慢性 缺氧时,HIF-1α mRNA 表达水 平在肺组织中增加, 其中以肺泡、 支气管上皮细胞及血管内皮细胞最多。Yu , AY 和Semenza GL 等研 究发现,HIF-1在缺 氧 性肺血管重建中起着重要作用, 目前已知的几个重要的