抗堆型艾美耳球虫子孢子单抗对阶段特异性抗原的识别

抗堆型艾美耳球虫子孢子单抗对阶段特异性抗原的识别 抗堆型艾美耳球虫子孢子单抗对阶段特异 性抗原的识别 48中国兽医2OO8年1月第28卷第1期C/finJVetSc/Jan.2OO8Vo1.28No.1 抗堆型艾美耳球虫子孢子单抗对阶段特异性抗原的识别 王承民,秦建华,郑素玲,何宏轩,杭柏林,魏刚才,陈桂香(1.河南科技学院细胞工程重点实验室, 河南新乡453003;2.河北农业大学动物科技学院,河北保定cr7l0ol;3.中国科学院动物研究所国家野生动物疫 病研究中心,北京100080) 摘要:为了用针对堆型艾关耳球虫子孢子的5株单抗检测各代裂殖子的反应性,分别用甲醇,丙酮,戌二醛和自然 干燥等4种固定方法处理裂殖子,观察其对染色结果的影响;并运用免疫荧光技术(IFA),对单抗和裂殖子进行染 色.结果显示,5株单抗中,单抗Easp-3H6和单抗Easp-5G10识别堆型艾关耳球虫裂殖子的抗原位于裂殖子的顶 端,单抗5B4对各阶段裂殖子有较弱的反应,而单抗Easp-3G3和5G7不与堆型艾关耳球虫任何一代的裂殖子发生 反应,明鸡堆型艾关耳球虫的侵入阶段存在共有抗原,即种内各发育阶段的抗原. 关键词:堆型艾关耳球虫;免疫荧光;裂殖子;单克隆抗体 中图分类号:$852.72文献标识码:A文章编号:11305嘏5(2008)O1.0048-03 Stage?specificantigensidentifiedbymonoclonalantibodyagainstEimeriaace~ulina sporozoites' WANGCheng-min,Q矾Jian-hua2,ZHENGSu—lingI,HEHong-xuan3,HANGBo-lin,WEIGang-cai,CHENGui— xiang(1.CellEnginee,~KeyLaboratory,HenanCollegeofScienceandTechnology, 咖,Henan 453003,China;2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,Hebei4lUn/vers/ty,B?,Hebe/ 071001,China;3.StateReseawhCenterforwi~tifiAnimalDise~Control,InstituteofZoologyinChineseA— cademyofScience,&100080,China) Abstract:Todetectstage-specificantigen0fmerozoitesbyfivemonoclonalantibodiesasaimtsporozoitesofE/mer/aacen,~一 耽.E.acenv/inamerozoiteswerefixedthrushair-dried,acetone,methanolandglutaraldehyde,thenstainedbyimmunofluo- rescenceassay(IFA)andthereactivitybeweenMcAbsandmerozoiteswasobserbed.TheresultsshowedamongthefiveMcAI~, apicalantigemc哩 bytheMcAI~Easp-3H6andEasp-5G10werelocalizedontheapicaltipofmerozoitefromallstagesof development.TheMcAb51t4reactedveryweakwithmerozoitesfromallgeneratiomwI1el脚McAbEasp-3G3and5G7didnot- actwithmemzoitesfromanygeneration,suggestingthattheinvasivestageofE/mer/aacervu//aasharethecrossreactiveantigens whichareinter-generation-specificandmightbetheeomponenlsofapotentialrecombinantvaccine. Keywords:E/mer/aacervu//aa;immunofluorescence;merozoite;monoclonalantibody 球虫病是禽类最主要的肠道寄生性原虫病,全 球广泛流行,给养禽业造成严重的经济损失【l. 1995年英国暴发的球虫病,造成高达4000万英镑 的损失3,所感染艾美耳球虫有7个种之多MJ.这 些球虫寄生在消化道内,引起不同程度的病理变化, 产生不同的免疫原性. 目前,球虫病仍依赖化学药物预防和控制,但是 由于开发新药的成本高,艾美耳球虫抗药虫株出现 快及活疫苗的潜在危险性等原因,重组蛋白基因工 程疫苗和禽免疫性的遗传改良成为目前研究的重点 和热点.最理想的球虫疫苗应该是多种艾美耳球虫 收稿日期:2006-03.13 基金项目:河南科技学院重点资助项目(200313) 作者简介:王承民(1978-),男,硕士. 抗原及其不同阶段的共有抗原…,尤其与宿主细胞 识别和侵入有关的那些抗原【5J5.要达到这一目的, 必须先制备抗球虫的单抗,鉴定免疫保护性抗原. 但是,目前制备的多数是子孢子单抗或裂殖子单抗, 如能制备出既可识别子孢子也可以识别裂殖子的单 抗,找出子孢子和裂殖子的共有抗原,即可制备出针 对球虫侵入阶段的基因工程重组蛋白.本试验就近 2年建立的堆型艾美耳球虫子孢子的单抗,能否识 别堆型艾美耳球虫的各代裂殖子进行了研究. 1材料与方法 1.1单克隆抗体细胞株及实验动物5株抗鸡堆型 艾美耳球虫子孢子的单克隆抗体杂交瘤细胞为 5B4,5137[,Easp.3G3,Easp-5G10和Easp.3H6,其中 中国兽医2O08年1月第28卷第1期ChinJVetSciJan.2O08Vd.28No.149 5B4和5G7是河北农业大学动物科技学院秦建华教 授惠赠并经过针对子孢子的鉴定;Easp一3G3,Easp一 5G10,Easp.3H6由本实验室制备,这3株抗体是用子 孢子为抗原直接免疫动物,通过杂交瘤技术筛选出 来的.试验用27日龄的小公鸡(Hyline),无球虫环 境饲养. 1.2主要试剂羊抗鼠的荧光二抗购于华美生物 公司;其他常规试剂均购于华美生物公司;DEAE一52 纤维素(Whatman);培养基(0.25%胰蛋白酶,1%牛 胆酸盐,于HBSS中调pH值至7.4). 1.3主要仪器设备高速低温台式离心机(3K.18, Siva);紫外分光光度计(国产);荧光显微镜(日 本). 1.4单抗的纯化和质量浓度测定应用A蛋白亲 和层析法纯化单克隆抗体[.纯化的抗体采用紫外 分光光度计进行质量浓度测定,抗体质量浓度为 0.93mg/L. 1.5裂殖子的制备将孢子化的堆型艾美耳球虫 卵囊口服接种于27日龄的小公鸡(Hyline),分别以3 个剂量接种即1×los,2×107,1×106个/mL.感染 后48h折颈杀鸡,获取第1代和第2代裂殖子;感染 后72h,获取第2代和第3代裂殖子;感染后85h, 获取第3代和第4代裂殖子.裂殖子的制备具体过 程是:快速切开小肠,用冷的PBS冲洗2次,将肠壁 切成4mm×4nlln的小块,放到培养基中,在41?的 水浴中培养30min,边培养边轻微震荡.培养后的 混合物用棉纱布过滤,快速离心,5~C700×g离心2 min,以除去大碎片.裂殖子通过DEAE一52纤维素柱 进行纯化. 1.6裂殖子的固定方法 1.6.1甲醇固定将裂殖子涂于洁净的载玻片上, 用冷的甲醇固定2min,PBS冲洗3次后干燥. 1.6.2丙酮固定用丙酮固定5min,PBS冲洗3次 后干燥. 1.6.3戊二醛固定用含2%戊二醛的PBS固定l5 min,PBS冲洗2次干燥. 1.6.4空气干燥于室温干燥. 将不同方法固定了的带有裂殖子的玻璃片放置 一 20?备用. 1.7间接免疫荧光染色将不同方法固定的带有 裂殖子的载玻片于湿盒中,与100t,-L单抗抚育,室 温40min或4?过夜;PBS冲洗3次,再与100t,-L荧 光二抗(1:1000,1%的BSA/PBS)分别作用40min 或4h;用PBS冲洗3次,立即于荧光显微镜下观察. 健康非免疫鼠的血清作为阴性对照. 2结果 各种抗体与堆型艾美耳球虫裂殖子在不同固定 方法处理中的反应情况见表1.单抗Easp.5G10和 单抗Easp.3H6可以识别用不同固定方法处理的各 代裂殖子,这2株抗体所识别的抗原位于裂殖子的 顶端.总的来说,单抗Easp一5G10比Easp.3H6的染 色信号要强.在所有被单抗所识别的裂殖子中,感 染后72h收集的要比48h和85h收集的染色信号 强.这一现象的真正原因目前还不清楚.裂殖子的 染色强度与子孢子的染色强度极为相关,在这3种 抗体即Easp-5G10,Easp.3H6,5B4中,Easp.5G10着 色强度最大,其次是Easp.3H6和51t4,这表明它们所 识别的抗原共同存在于裂殖子和子孢子上,这种抗 原最可能是在侵入过程中具有相同的功能. 表1不同固定方法处理的堆型艾美耳球虫裂殖子 与不同抗体反应情况 单抗自然干燥甲醇固定丙酮固定戊二醛固定 5B4—7一一一 5C7一一一一 Easp-3G3?-?-?-?- E~p-5, ~lo+++一 Easp-3H6+++一 注:+为强染色信号;一/+为弱染色信号;一为无染色信号 不论用哪种固定方法固定的裂殖子,单抗5G7 和Easp-3G3都没有出现任何染色信号.而用戊二 醛固定的裂殖子,不论是哪种抗体也没有出现染色 信号,原因可能是戊二醛破坏了抗体所识别的裂殖 子抗原表位. 3讨论 因为艾美耳球虫在细胞内的发育不是同步的, 即裂殖生殖阶段互相重叠[S-lOJ.当鸡感染大量的球 虫卵囊后,子孢子侵入后会延迟发育,研究已在 感染后的至少60h在组织切片中观察到了未发育 或发育的子孢子[8,10].所以在选择获取裂殖子的时 间点上,本试验充分考虑到堆型艾美耳球虫的生活 史中出现的重叠裂殖生殖阶段,分别在感染后45, 72,85h这3个不同时间点收集虫体,可以认为所收 集的虫体中已经包含了各代的裂殖子. 本试验结果表明,自然干燥的裂殖子染色最强, 其次是丙酮和甲醇固定的裂殖子,这表明抗体对裂 殖子抗原识别的敏感性受固定液的影响,尤其是甲 50中国兽医2OO8年1月第28卷第1期Ch/nJVetSciJan.2OO8Vo1.28No.1 醇.Augustine等l_研究表明,甲醇处理的堆型艾美 耳球虫的子孢子与抗体的反应性会降低.抗原抗体 反应的敏感性降低,有机溶剂也许是一个原因,但 是,目前我们还未能通过实验手段,如蛋白质杂交方 法检测出他们的相对分子质量或通过免疫电镜技术 将其在子孢子内准确定位.戊二醛固定的虫体没有 任何染色,原因可能是戊二醛与抗原交联形成的分 子桥不允许抗体接近.Augustine等用鼠抗体和 戊二醛处理的艾美耳球虫子孢子反应的实验中也观 察到了这一现象,还发现自然干燥的子孢子染色和 戊二醛固定的子孢子染色结果是截然不同的,原因 是戊二醛可能破坏了子孢子的抗原表位. 顶体复合物在虫体.宿主细胞识别,虫体的侵入 和发育起到了重要作用.改变宿主细胞对子孢子或 裂殖子的识别或人为阻断子孢子和裂殖子的侵入应 该可以阻止球虫感染.在鸡的艾美耳球虫病中,子 孢子感染肠黏膜细胞可以激发宿主的保护性免 疫[B],裂殖生殖阶段也可以提高宿主的这种保护性 免疫.因此,艾美耳球虫侵入阶段共有抗原的鉴 定和特征研究成为各国学者研究的热点.这些共有 抗原分子所激发的保护性免疫作用,可以阻断子孢 子及其的进一步侵入和发育.2株单抗Easp.5G10 和Easp.3H6识别堆型艾美耳球虫裂殖子抗原.有 趣的是,被EASP.3H6识别的抗原正好在堆型艾美 耳球虫和布什艾美耳球虫的子孢子上,被Easp.5G10 识别的抗原也存在于鸡的所有艾美耳球虫子孢子的 顶端.这样,单抗Easp.5G10就与鸡的艾美耳球虫 侵入阶段的保守抗原反应.单抗5G7和Easp-3G3 虽与子孢子抗原反应,但是不与任何裂殖子抗原反 应,而5B4对裂殖子识别较弱.用这些单抗获得的 结果证明了鸡的堆型艾美耳球虫子孢子的顶体复合 物和各代裂殖子之间有保守的抗原表位.Danforth 等和Lillehoj等,用鼠的抗体或鸡抗体,也证明 了这种共有抗原的存在,这些抗原大多数位于艾美耳 球虫子孢子和各代裂殖子的顶端.这艾美耳球 虫侵入阶段即子孢子和裂殖子使用共同的抗原蛋白 来识别和侵入宿主细胞.这些研究结果证明了艾美 耳球虫各发育阶段存在共有抗原,因此利用这些共有 抗原去开发基因工程疫苗具有广阔的应用前景. 参考文献: [1]IalhhojHS,I~lhhojEP.Aviancoccidiosis:Areviewofac— qtlirintestinalimmunityandvaccinationsegies[J].A, vianDis,2000,44:408-425. 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