骨髓间充质干细胞减轻腹膜纤维化的研究

骨髓间充质干细胞减轻腹膜纤维化的研究 中图分类号: 学校代码: : 密级: 公开 高恐犬港 博士学位论文 骨髓间充质干细胞减轻腹膜纤维化研究 本论文为国家重点基础研究发展计划 、国家高技术研 究发展计划、“十二五”国家科技支撑计划、卫生公益性行业科研专项资助 项目 指导教师 医蚕羞 塾援 培养单位 匡堂医 研究方向王细胞迨痘腹堪红维丝 评阅人工型强鱼亚握奎墓 挞湛厦塞』塞虚 南开大学研究生院 年 月南开大学学位论文使用授权书 根据《南开大学关于研究生学位论文收藏和利用》,我校的博士、硕士学位 获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 《著作权法》规定范围内的学位论文使用权,即:学位获得者必须按规定提交学位论文包 括纸质印刷本及电子版,学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文, 并编入《南开大学博硕士学位论文全文数据库》;为教学和科研目的,学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读,在校园网上提供论文目录检索、 文摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务;根据教育部有关规定,南开大学向教育 部指定单位提交公开的学位论文;学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所及其万 方数据电子出版社和中国学术期刊光盘电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版 并收入相应学位论文数据库,通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人 保留在其他媒 体发论文的权利。 非公开学位论文,保密期限内不向外提交和提供服务,解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站:?:...:/.。 本人承诺:本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品,并已通过论文答 辩;提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致,如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份,由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字: 王摘 年月日 ? /‘ 南开大学研究生学位论文作者信息 论文目 骨髓间充质干细胞减轻腹膜纤维化研究 姓 名 王楠 学号 答辩日期 年月日 论文类别 博士?学,万硕士口硕士专业学位口 高校教师口 同等学力硕士口 院/系/所 医学院 专业 内科学 . 通信地址邮编:北京市海淀区复兴路号解放军总医院东病房楼肾科实验室层室 备注: 是否批准为非公开论文 否 注:本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写一式两份签字后交校图书 馆,非公开学位论文须附《南开大学研究生申请非公开学位论文审批表》。南开大学学位论文原创性声明掣鼎煅 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师指导下进行研究工作所 取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外,本学位论文的研究成果不包 含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究作做出贡献的其他个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本 学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名: 垂圭直 年月日 非公开学位论文标注说明 本页表中填写内容须打印 根据南开大学有关规定,非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申 请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文,公开学位论文本 说明为空白。 论文题目 口限制年 口秘密年 口机密年 申请密级 日 保密期限 年 月 日至 年 月 审批表编号 批准日期 年 月 日 南开大学学位评定委员会办公室盖章有效 注:限制?年可少于年;秘密年可少于年;机密年可少于年中文摘要 骨髓间充质干细胞减轻腹膜纤维化研究 中文摘要 背景:腹膜纤维化具有重要临床意义。如慢性腹膜纤维化导致的超滤衰竭为 终 末期肾病 ,患者腹膜透析 , 退出的重要原因,而急性腹膜纤维化导致的术后腹膜粘连可引起不育、肠 ,在维持腹膜稳态、物 梗阻。腹膜问皮细胞 质转运、炎症、组织修复等方面发挥重要作用。急性或慢性受损,可引 起炎症、腹膜纤维化及粘连,同时在慢性刺激作用下部分从上皮细胞表 型向间充质细胞表型发生转化即转分化. ,亦可启动纤维化进程,导致超滤失败或术后腹膜 ,可以通过定植、分 粘连。骨髓间充质干细胞 化和/或分泌生物活性因子以促进内源性干/祖细胞迁移与分化、抑制炎症、 抗 纤维化,从而促进损伤的修复。目前尚无与腹膜纤维化的研究。 目的:本课题旨在明确.能否通过促进急性机械性损伤修复而减轻 急性腹膜纤维化;.能否通过抑制慢性腹膜透析中的而减轻 慢性腹膜纤维化。同时探讨发挥疗效的具体作用机制。 :减轻急性腹膜纤维化的研究:建立腹膜机械性刮伤诱导的 大鼠急性腹膜粘连模型。刮伤后不同时间点,将 大鼠骨髓来源的红色荧光蛋白 ,.通过尾静脉 或腹腔注射入大鼠体内,术后,采用腹膜粘连评分观察腹膜粘连的严重程 度、明确最佳注射方式与时间点。刮伤后,将× 通过尾静脉注射 入体内。术后采用腹膜粘连评分观察腹膜粘连的严重程度,苏木精.伊红染色 法 ,观察炎症反应,三色染色观察纤维化 程度,免疫组织化学分析损伤腹膜区域中性粒细胞髓过氧化物酶 ,、单核巨噬细胞.、成纤维细胞成纤维细 胞特异性蛋白一 .,.数量及转化生长因子,.水平,免疫组化分析间皮细胞 中文摘要 ?及免疫荧光分析间皮细胞、增殖细胞核抗原 ,,以观察的修复及增殖。体外培养原代大鼠 腹膜间皮细胞,,利用共培养 系统、通过计算不同时间点的细胞迁移速度、免疫荧光分析.及 ,观察对机械性划伤修复的影响。近红外线染料标记的 在腹膜刮伤后经大鼠或重症联合免疫缺陷 .,小鼠尾静脉或腹腔注射,采用小动物活体成像系统 示踪在体内的分布。双光子显微镜、免疫荧光分析在肺脏、脾脏 等器官组织中的聚集、分布情况及其与巨噬细胞的定位关系。将×大鼠 的无血清条件培养基 ,超滤浓缩后,刮伤后 、、通过尾静脉注射入大鼠体内三次。术后采用腹膜粘连评分观察腹 膜粘连的严重程度,三色染色观察纤维化程度。采用抗体芯片技术检测 无血清饥饿、、的.,分析.中细胞因子分泌的变 化,并对变化显著的候选因子采用酶联免疫吸附试验. ,验证。采用免疫荧光分析经尾静脉注射后在肺脏 中或经腹腔静脉注射后在脾脏中积聚的的.表达情况,采用【 检测大鼠血清.水平。肿瘤坏死因子【刺激基因 , . .,.小干扰 瞬时转染,与 检测..在 中、检测.中的干扰效果。腹膜刮伤后将、 .. 通过尾静脉注射入大鼠体内;在腹膜刮伤后、、将 .、.. .或重组小鼠. .,.通过尾静脉注射入大鼠体内三次。术后,采用腹膜粘连 评分观察腹膜粘连的严重程度,三色染色观察纤维化程度。体外利用 共培养系统,通过计算细胞迁移速度、免疫荧光分析.及 ,观察、.. 及.对划伤修复的影 响。 减轻慢性腹膜纤维化的研究:建立慢性腹膜透析诱导的大鼠慢性 腹膜纤维化模型。在开始腹膜透析液.%注射后不同时间点,将 通过尾静脉注射入大鼠体内,采用三色染色观察腹膜纤维化 程度,明确治疗的最佳时间点。开始腹膜透析液注射的即刻将×中文摘要 通过尾静脉注射入体内。检测腹膜超滤功能及葡萄糖转运量,采用 三色染色观察腹膜纤维化程度,染色观察腹膜血管密度,免疫组化 【, 分析腹膜区域.、肌成纤维细胞 【.数量及.表达。 结果:术后经尾静脉注射能减轻急性腹膜粘连程度,治疗组腹 膜粘连评分低于对照组,而腹腔注射疗效不理想;治疗组在术后反应活 跃期的炎症细胞浸润及渗出减少,成纤维细胞数量及.水平减少,胶 原纤维较少、厚度较薄、质地较稀疏;反应活跃期间皮细胞的数量增多、增 殖 活性增强。与共培养组细胞在划伤后、的迁移速度增加,细胞的增 殖在划伤后开始增加,达到高峰,较对照组前移了。经尾静脉注射的 主要在肺脏积聚,高峰在,荧光信号持续至少;经腹腔注射的 则主要在脾脏、肝脏积聚,高峰在,持续至少;但均未见到损伤腹 膜区域内有明显的细胞积聚,甚至在小鼠中经腹腔注射仍未见腹膜区域 内有明显的细胞积聚。双光子显微镜及免疫荧光分析显示,尾静脉注射 后,肺脏间质中可见散在“栓子样”,肺脏数量明显下降, 但肺脏中仍可见少量,且多数未被巨噬细胞吞噬;经腹腔注射 后,脾脏中可见少量,且多数被巨噬细胞吞噬,后碎片明显 增多。尾静脉注射无血清.能减轻急性腹膜粘连的程度,并与 的疗效相似。抗体芯片分析显示,.因子的分泌在无血清饥饿的 内明显增加。经尾静脉注射内,在肺脏积聚的表达一,且尾静脉 注射 ,大鼠血清一的水平明显升高,而经腹腔注射在脾脏积聚的 不表达.,且血清.水平与对照组无差异。干扰.的表达、 降低其分泌后,肺脏积聚留的无明显.表达,血清.的水平无 明显升高,且.. 、.. .对腹膜粘连的治疗 作用、.. 对划伤迁移或增殖的促进作用均减弱。而单 独采用.可以减轻腹膜粘连程度、促进划伤的迁移及增殖。 腹膜透析液开始注射后即刻经尾静脉注射能明显减轻慢性腹膜纤维 化程度。后治疗组腹膜超滤量、葡萄糖转运量与正常组无差异,腹膜 血管密度低于对照组,而腹膜化程度轻于对照组。后治疗组腹膜区域 间皮细胞数量多于对照组,、肌成纤维细胞数量少于对照组,而 .水平低于对照组。 中文摘要 结论:经静脉注射的能够促进迁移与增殖能力、抑制炎症细胞浸 润、减少成纤维细胞数量、下调.水平,从而促进腹膜损伤、减轻急性纤 维化:的治疗作用不是通过定植,而是通过在肺脏中积聚并分泌一 入血的远隔作用方式来实现的。尚可抑制由腹膜透析液诱导的发生 ,减轻慢性腹膜纤维化、改善腹膜超滤功能。 关键词;间充质干细胞腹膜损伤纤维化肿瘤坏死因子。刺激基因 上皮.问充质转分化 目目擅自?鲤 ;滞裔吉品 慧噎圜 \里篓。. 川竺 、 , 作月机制 起赫式 露雨露 舅‘ 露 一一???????????????????????????????????????????????????一 . :,,. , , ; 一/ , . ; ... . . . , . ?, , , ?. ,. .: .. ., .. : , .:觑. . ,. , , , ’. ,, ‘ . . . ./ , . , ,, . , . , . , , . ,’. , ,?.. 一 一 ,一. 一, , ./,, , ?,一,, . , ’ ? ./ , ,一一 ,... :. ,’. , . , ’ . , ,., . . :, .; . ; ; .. , . ./ , , . ;, . , , ., , .? ,,; . ,? ?. , ? ? .,,一 . 一, ., , 一 . ,,一 , 出 , ,, : , , ?, , 一, , 口 : 一? 露:棠“ 册?越自 ?目录 目录 引言 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究?一 第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 一、前言.. 二、实验材料、主要试剂与仪器??.. 三、实验方法?.. 一细胞培养.. 二实验动物处理?.. 三腹膜粘连肉眼评分四病理染色?。 五病理三色染色.. 六免疫组化分析? 七腹膜组织的免疫荧光分析八原代机械性划伤模型. 九机械性划伤的迁移速度测定. 十的免疫荧光分析??一 十一统计学处理? 四、结果 一特征性表面标志物鉴定 二成骨分化潜能的鉴定?. 三成脂分化潜能的鉴定?. 四治疗急性腹膜粘连的最佳注射方式与时间点. 五尾静脉注射可减轻急性腹膜粘连程度 六尾静脉注射可减轻急性腹膜粘连的病理改交 七尾静脉注射可改善急性腹膜粘连的炎症、纤维化反应八尾静脉注射可促进 损伤的修复 九原代培养的鉴定促进体外机械性损伤的修复.迁移能力?.. ×目录 十一促进体外机械性损伤的修复.增殖能力? 五、讨论. 六、小结 七、参考文献? 第二节减轻急性腹膜纤维化的作用方式研究. 一、前言 二、实验材料、主要试剂与仪器一实验动物与细胞 二主要试剂 三主要仪器 四其他三、实验方法? 一大鼠骨髓来源培养与操作.. 二实验动物处理? 三小动物活体成像技术示踪??. 四双光子显微镜技术示踪. 五免疫荧光分析? 六腹膜粘连肉眼评分七病理三色染色.. 八统计学处理四、结果 一尾静脉注射不在大鼠损伤的腹膜区域积聚? 二尾静脉注射主要在大鼠肺脏积聚三尾静脉注射在大鼠肺脏中未被巨噬细 胞吞噬 四腹腔注射不在大鼠损伤的腹膜区域积聚五腹腔注射主要在大鼠脾脏积聚 六腹腔注射在大鼠脾脏中被巨噬细胞吞噬七腹腔注射不在小鼠损伤的腹膜 区域积聚??. 八尾静脉注射.可减轻急性腹膜粘连程度?. 九尾静脉注射.可减轻急性腹膜粘连的病理改变?. 五、讨论 六、小结? ×目录 七、参考文献? 第三节通过分泌方式减轻急性腹膜纤维化的机制研究??. 一、前言 二、实验材料、主要试剂与仪器一实验动物与细胞. 二主要试剂. 三主要仪器 四其他三、实验方法? 一细胞培养 二抗体芯片检测无血清.细胞因子成分??. 三... 四??. 五原代机械性划伤模型. 六机械性划伤的迁移速度测定.. 七的免疫荧光分析??.. 八实验动物处理??九腹膜粘连肉眼评分十病理三色染色.. 十一检测.浓度十二免疫荧光分析 十三统计学处理? 四、结果 一抗体芯片技术检测无血清?中细胞因子分泌的变化??. 二验证无血清.中.分泌的变化 三尾静脉注射后大鼠血清中.浓度一过性升高? 四尾静脉注射后在肺脏中积聚的表达.? 五腹腔注射后在脾脏中积聚的不表达.? 六水平..的效果??.. 七细胞蛋白水平..的效果?,, 八对分泌.的效果?.. 九尾静脉注射.. 大鼠血清.无明显升高目录 不明显表达.? 十尾静脉注射后在肺脏中积聚的.. 十一分泌.促进机械损伤修复.迁移能力??.. 十二分泌.促进机械损伤修复.增殖能力??.. 十三可通过分泌.减轻急性腹膜粘连程度 十四可通过分泌.减轻急性腹膜粘连的病理改变 五、讨论. 六、小结? 七、参考文献? 第二章减轻慢性腹膜纤维化的研究? 第一节减轻慢性腹膜纤维化的疗效研究??. 一、前言 二、实验材料、主要试剂与仪器一实验动物与细胞 二主要试剂 三主要仪器 四其他三、实验方法? 一细胞培养 二实验动物处理? 三病理三色染色.. 四腹膜超滤量检测 五腹膜葡萄糖转运量检测 六病理染色?。 七免疫组化分析? 八统计学处理四、结果??.. 一治疗慢性腹膜纤维化的最佳注射时间点二尾静脉注射可改善腹膜透析的 腹膜超滤功能??.. 三尾静脉注射可降低腹膜透析的腹膜葡萄糖转运功能??.. 四尾静脉注射可减轻腹膜透析的腹膜纤维化程度?.. 五尾静脉注射可降低腹膜透析的腹膜血管密度??..目录 六尾静脉注射可抑制腹膜透析的减少.. 七尾静脉注射可减少腹膜透析腹膜肌成纤维细胞数量??一 八尾静脉注射可减少腹膜透析腹膜.表达五、讨论??.. 六、小结. 七、参考文献.. 第三章全文总结??. 第四章文献综述??. 间充质干细胞减轻损伤与纤维化的研究进展 第一节简介一、的发现简史 二、的多向分化潜能? 三、的表面标志物第二节发挥治疗效应的作用方式一、的定植作用方式? 二、的旁分泌作用方式 第三节促进损伤修复、抗纤维化的作用机制 一、趋化??一 二、免疫调节.. 三、抑制炎症反应?一 四、抗菌 五、活化内源性干/祖细胞?. 六、降低内皮细胞通透性?.. 七、促进新生血管生成??一 八、抗凋亡?.. 九、抗纤维化.. 第四节治疗各器官、组织损伤与纤维化的研究一、关节 二、肺脏. 三、肝脏??.. 四、神经系统.. 目录 五、。【:’狂. 六、肾脏. 第五节临床试验研究.. 第六节治疗的副作用? 第七节小结及现存问题??一 参考文献 致射?. 个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果英文缩略词表 英文缩略词表 缩略词 英文全称 中文全称肾上腺髓质素 碱性成纤维生长因子 条件培养基中性粒细胞化学趋化因子 结缔组织生长因子 ’,一 ’,二脒基..苯吲哚 焦碳酸二乙酯 二甲基亚砜 细胞外基质 ? 酶联免疫吸附试验 上皮细胞.间充质转分化? 终末期肾脏病 . 一 成纤维细胞特异性蛋白. 血液透析苏木精.伊红染色法 肝细胞生长因子 . 胰岛素样生长因子白细胞介素 . .受体拮抗物 ?? 脂多糖诱导的化学趋 ? 促分裂原活化蛋白激酶 . 一 基质金属蛋白酶一 髓过氧化物酶 间充质干细胞 阴性对照 磷酸盐缓冲液增殖细胞核抗原腹膜透析 ? 血小板源性生长因子前列腺素 腹膜间皮细胞 红色荧光蛋白 .. 重组小鼠.大鼠腹膜间皮细胞 英文缩略词表 重症联合免疫缺陷 大鼠 小干扰 无特定病原体级. 转化生长因子肿瘤坏死因子 . 肿瘤坏死因子【刺激基因 .美国肾脏数据登记系统 . 血管内皮生长因子 毡. 仅平滑肌肌动蛋白 引言 己言 日 腹膜纤维化一种常见的腹膜病变,具有重要的临床意义。如慢性腹膜纤维 化导致的超滤衰竭己成为患者退出的主要原因,而术后急性腹膜纤维化导致 的腹膜粘连亦可引起慢性腹痛、女性不育、机械性肠梗阻等。在调节腹膜 炎症反应、局部微循环和纤维蛋白溶解稳态等方面起重要作用。急性或慢性 间 皮细胞层损伤后,即可启动一系列的修复过程。这一过程的主要特点表现在 损 伤区域的炎症反应,如再间皮化,新生血管及间皮下层细胞外基质 ,积聚,进而导致腹膜纤维化及粘连。在长期接受治疗的患者 中可见到腹膜间皮细胞层损伤、脱落及发生现象,启动腹膜纤维化进程, 并最终导致腹膜透析超滤衰竭。因此,间皮细胞层的重建是保障长期进行腹 透 治疗患者预后良好的关键。损伤和脱落在急性手术后腹膜粘连的发生过程 中亦起重要作用。然而不幸的是,目前临床上针对腹膜纤维化的治疗方法大多 不理想。新近研究表明,促进迁移及增殖、抑制发生可以减 轻腹膜纤维化的程度。 是一种多种组织来源的具有多向分化潜能的成纤维样干细胞,具备易 于扩增、免疫原性弱、靶向损伤部位、对损伤严重程度动态反应、安全性良好、 能稳定高效表达外源基因等优点。因此,是较为理想的临床治疗用靶细胞。 研究显示,能有效修复组织损伤、抑制发生,进而减少胶原沉积与 重塑。但目前尚不明确发挥治疗效应的作用方式,推测可能与定 植、直接分化以替代损伤组织、细胞和/或旁分泌促进损伤修复的细胞因子有关。 是对于损伤信号反应所产生的一种以抗炎作用为主的多功能细胞 因子,可以通过透明质酸/保护损伤组织免于发生过度的炎症反应。如在酵 母菌诱导的腹膜炎模型中,注射.后中性粒细胞浸润明显减轻、巨噬细胞 活化程度减低、炎症因子产生下调,从而使正常的修复过程顺利进行。 我们建立了腹膜机械性划伤诱导的大鼠急性腹膜粘连模型,在体外建立了 机械性划伤导致的损伤模型,旨在研究对于损伤和急性腹 膜纤维化的作用及其发挥疗效的作用方式、具体作用机制。同时我们建立了慢 性腹膜透析诱导的大鼠慢性腹膜纤维化模型,旨在研究对于的 和慢性腹膜纤维化的作用。 】第一章减轻急性腹膜纤维化的研究第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究 第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 址 一、刖罱 腹膜纤维化一种常见的腹膜病变。慢性腹膜纤维化导致的超滤衰竭为患 者退出的重要原因,而术后急性腹膜纤维化导致的腹膜粘连亦可引起慢性腹 痛、 女性不育、机械性肠梗阻。在维持腹膜稳态、液体与细胞的转运、炎症识 别、纤溶、组织修复等方面均发挥重要作用。在长期接受治疗的患者中, 可见到腹膜间皮细胞层损伤、脱落的现象。间皮细胞层损伤后,即开始发生 一系列的修复过程,引起炎症浸润、血管新生、间皮下层积聚等改变, 进而导致腹膜纤维化、粘连。由于腹膜纤维化所引起的超滤衰竭己逐渐成为 患者退出的主要原因.。因此,间皮细胞层的重建是保障长期进行患者预 后良好的关键【。此外,损伤和脱落在急性手术后腹膜粘连的发生过程中 亦起重要作用,,新近研究表明,促进迁移及增殖可以减轻急性腹膜 粘连的程度,。 是一种多种组织来源的具有多向分化潜能的成纤维样干细胞,具 备来源方便、易于扩增、免疫原性弱、、靶向损伤部位、对损伤严重程度动 态反 应、安全性良好、能稳定高效表达外源基因等优点】。研究显示,能有 效修复组织损伤、减轻纤维化进程,。其可能机制为:选择性的向损伤部 位靶点归巢、直接分化为相应的组织细胞和/或分泌多种生物活性因子,以促 进损伤的 修复。目前已有治疗心脏、肺脏】、肝脏】、。肾脏损伤及纤维化的 研究,但尚无与非感染性腹膜损伤、纤维化的研究报道。 本部分实验我们在体外建立了腹膜机械性划伤诱导的大鼠急性腹膜粘连模 型,在体外建立了机械性划伤导致的损伤模型,旨在研究对于 损伤和急性腹膜粘连、纤维化的作用。 二、实验材料、主要试剂与仪器 一实验动物与细胞 第一章.减轻急性腹膜纤维化的研究第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 .实验动物 ,、 选用无特定病原体级 周龄、体重~ 、雄性大鼠只由军事医学科学院实验动物中心提供。自由饮水, 每日次喂食,昼夜周期,室温为。,相对湿度为%。开始实验前至 少适应环境周。 .实验细胞 大鼠骨髓来源.购自美国公司 原代由级、周~周龄、体重一、雄性大鼠 提取 二主要试剂 .大鼠骨髓来源专用培养基美国公司 .正常糖细胞培养粉剂美国 公司 .细胞培养粉剂美国 公司 月台牛血清美国 公司 公司 ..%胰酶含.%.粉剂美国 ./、鼠抗大鼠、单抗美国 公司 公司 .小鼠抗大鼠、 单抗英国 公司 .兔抗人.多抗美国 公司 .兔抗人.多抗美国 .兔抗人多抗美国 公司 .兔抗人.多抗美国 公司 .兔抗人.多抗英国公司 .山羊抗兔偶联二抗丹麦公司 .试剂盒美国 .小鼠抗人单抗美国 公司 公司 小鼠抗人 单抗美国 ./、鼠抗人肌成纤维细胞.单抗美国.公司 .山羊抗小鼠偶联二抗美国 .山羊抗兔偶联二抗北京中杉金桥公司 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 .含’,二脒基..苯吲哚’,.,的防 淬灭剂北京中杉金桥公司 三主要仪器 .两气细胞培养箱德国公司 .倒置显微镜日本公司 .数码照相机日本公司 .低温离心机德国公司 公司 ,美国 .流式细胞仪 .恒温台式振荡器 .型,中国江苏省太仓鹿河电讯器材厂 .精密电子天平,上海第二天平仪器厂 .单光子激光共聚焦显微镜日本公司 .超净工作台北京半导体设备一厂 .冰冻切片机美国公司 .石蜡切片机美国公司 四其他 .细胞培养瓶美国公司 .孔板美国公司 .孔板聚酯膜,孔径..美国公司 .二甲基亚砜 ,美国公司 .多聚赖氨酸北京中杉金桥公司 .多聚甲醛美国.公司 ....包埋剂美国 公司 .蔗糖粉剂美国公司 .牛血清白蛋白美国.公司 .戊巴比妥钠粉剂美国公司 .粉剂北京中杉金桥公司 .专用冻存液美国公司 三、实验方法 一细胞培养 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究 第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 .大鼠骨髓来源培养与操作 复苏 ?从液氮中取出冻存,、内解冻; ?将冻存细胞液加入到的无血清培养液中,轻轻混匀; ?离心,; ?弃上清: ?加入 专用培养基,反复吹打混匀; ?将洗悬液移入细胞培养瓶中,。、%条件下培养。 传代 在专用培养基中,。、%条件下培养。每、细胞%汇合 时,以:比例传代。 ?胰酶消化细胞/培养瓶、./培养瓶,。孵育 ,以倍胰酶体积的含%月牛血清的培养液终止消化; ?培养瓶中液体转移至离心管; ?离心,; ?弃上清; ?加入 专用培养基/培养瓶、/培养瓶,反复吹打 混匀; ?将洗悬液移入细胞培养瓶中,。、%条件下培养。 细胞注射前处理 第代~代,当细胞%汇合时,清洗次,换用无血清 培养基培养后进行细胞收取。 ?胰酶消化细胞./培养瓶,孵育,以倍胰酶体积 的含%胎牛血清的培养液终止消化; ?培养瓶中液体转移至离心管; ?离心,; ?弃上清; ?加入无血清培养基重悬至/,反复吹打混匀; ?将悬液放置于条件下短期保存。 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 冻存 第代~代,当细胞%汇合时,进行冻存保存。 ?胰酶消化细胞/培养瓶、./培养瓶,。孵育 ,以倍胰酶体积的含%胎牛血清的培养液终止消化; ?培养瓶中液体转移至离心管; ?离心,; ?弃上清; ?加入 专用冻存液; ?迅速将细胞后移至.?冰箱保存; ?后将细胞转移入液氮中长期保存。 流式细胞仪细胞表面标志物鉴定 第代,当细胞%汇合时,进行流式细胞仪细胞表面标志物鉴 定。 ?胰酶消化细胞/培养瓶,。孵育,以倍胰酶体积的 含%胎牛血清的培养液终止消化; ?培养瓶中液体转移至离心管; ?离心,,弃上清; ?细胞计数; ?以/密度重悬于冰的管中; 、各/.; ?加入抗体、各./肛, ??避光孵育; ?清洗次; 重悬细胞; ?各加入. ?流式细胞仪上以或激发,检测阳性细胞比率。 细胞成骨分化潜能鉴定 第代,当细胞%汇合时,进行成骨分化潜能鉴定,采用 染色检测细胞外钙磷沉积情况。 ?配制细胞成骨分化诱导培养基:培养基加入%胎牛血清、地塞 米松终浓度. /、抗坏血酸磷酸盐终浓度./及磷酸甘 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 油钠终浓度/: ?细胞换用成骨分化诱导培养基,每天换液,共周; ?%多聚甲醛室温下固定细胞; ?蒸馏水清洗次; ?浸入%硝酸银水溶液中,紫外光照射; ?蒸馏水清洗次: ?浸入%硫代硫酸钠溶液中; ?吸出残留液体; ?室温下晾干,中性树胶封片; ?光镜下观察,放大倍数为。 细胞成脂分化潜能鉴定 第代,当细胞%汇合时,进行成脂分化潜能鉴定,采用油红染 色检测细胞内脂滴形成情况。 ?配制细胞成脂分化诱导培养基:诱导液:高糖培养基加入%台 牛血清、地塞米松终浓度/、胰岛素终浓度./及异丁基甲 基嘌呤终浓度.//、吲哚美辛终浓度/。维持液:高 糖培养基加入%胎牛血清、胰岛素终浓度./; ?诱导液培养天,换为维持液天,再换为诱导液培养天,如此进行 个循环后,换为诱导液培养天; ?%中性甲醛室温下固定细胞; ?.油红干粉,溶于异丙醇。用时以:与去离子水混匀,过滤后 室温下静置 ; ?油红染色室温下; ?异丙醇清洗次; ?加入光镜下观察,放大倍数为。 .原代培养与操作 提取与培养 经解放军总医院伦理委员会批准,从只大鼠中提取、分离原代 。 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 ?%戊巴比妥以/的剂量、经腹腔麻醉; ?待麻醉生效后,固定大鼠,腹腔注射.%胰酶; ?后收集腹腔液体至离心管; ?离心,; ?弃上清; ?清洗次; ?重悬于%胎牛血清/培养基中,于。、%下培养。 ?后清除未贴壁细胞; ?待细胞汇合后,以:传代。 传代 在%台牛血清/培养基中,?、%条件下培 养。每、细胞%汇合时、以:比例传代。 ?胰酶消化细胞/培养瓶,。孵育,以倍胰酶体积的 含%胎牛血清的培养液终止消化: ?培养瓶中液体转移至离心管; ?离心,; ?弃上清; ?加入 %胎牛血清/培养基/培养瓶,反复吹打混 匀; ?将洗悬液移入细胞培养瓶中,。、%条件下培养。 细胞实验前处理 第代~代,当细胞%合时,清洗次,换用无血清 /培养基培养后进行实验。 冻存 第代~代,当细胞%汇合时,进行冻存保存。 ?胰酶消化细胞/培养瓶,?孵育,以倍胰酶体积 的含%胎牛血清的培养液终止消化; ?培养瓶中液体转移至离心管; ?离心,; 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 ?弃上清; ?加入.冻存液%的血清%的,反复吹打混匀; ?将混合后的液体移至冻存管,置于.?保存; ?后移至.?冰箱保存。 ?后将细胞转移入液氮中长期保存。 二实验动物处理 .大鼠急性腹膜粘连模型 经解放军总医院伦理委员会批准,只大鼠分批次只/次行手 术建立模型,均在无菌层流动物手术室中由一位术者操作完成。 %戊巴比妥以的剂量、经腹腔麻醉; 待麻醉生效后,固定大鼠,腹部皮肤以%硫化钠脱毛; %乙醇常规消毒; 腹中线开纵行切口,干纱布在盲肠腹侧、背侧表面摩擦 次至出现出血点,将盲肠放回原位; 同样处理对应壁层腹膜; /线逐层缝合腹壁; 术后单笼饲养。 .大鼠急性腹膜粘连模型治疗 腹膜刮伤术后将大鼠随机分为术后即刻治疗组、术后治疗组、术后 治疗组、术后治疗组和各时间点无血清对照组经尾静脉或腹腔注 射,每个时间点每组。 ×或无血清在上述时间 点分别通过尾静脉或腹腔注射入大鼠体内。 确定治疗的最佳注射方式与时间点后,在腹膜刮伤后将 ×或无血清通过尾静脉注射入大鼠体内每个时间点每组 。 .标本取材与处理 在腹膜刮伤术后、、、、、根据具体实验而定经%戊 巴比妥腹腔麻醉后处死大鼠。取腹正中切口,切取壁层腹膜未形成粘连时 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 或粘连带形成粘连时组织份,约..。份放置于%甲醛中, ?固定后行石蜡包埋,用于病理和免疫组化染色;份放置于%多聚甲醛 中,。固定后,采用%、%和%蔗糖梯度在。下脱水各,采 用...包埋剂包埋组织块,保存于.?,用于制备冰冻切片,行免疫荧光染 色。 三腹膜粘连肉眼评分 腹膜刮伤后、、处死大鼠,由一名独立观察者对腹膜粘连面积评 分。:,%;,%;,%%:,%~%;,%~%粘 连面积。 四病理染色 %甲醛固定充分后的组织块用于染色,以观察腹膜组织炎症病理表 现。 .常规乙醇脱水: .常规石蜡包埋; 。切片; .二甲苯脱蜡:二甲苯甲苯%乙醇 %的乙醇,%乙醇%乙醇蒸馏水洗; .苏木素染色,蒸馏水冲洗; .盐酸乙醇分化,蒸馏水浸泡; .伊红液染色; .常规脱水,透明,封片:%乙醇%乙醇, %乙醇%乙醇,甲苯石碳酸:二甲 苯争甲苯一中性树脂封固; .倒置显微镜下观察病理变化,放大倍数为、; .放大倍数为下,由一位独立观察者随机选取个视野/切片,对炎症 程度进行评分。标准:,正常;,少量;,中等量;,大量。 五病理三色染色 %醛固定充分后的组织块用于三色染色,以观察腹膜组织纤维化 病理表现。 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 .常规乙醇脱水; .常规石蜡包埋; .切片: .二甲苯脱蜡:二甲苯一二甲苯,%乙醇, %的乙醇?%乙醇,%乙醇一蒸馏水洗; .苏木素染色,蒸馏水冲洗; .丽春红酸性复红液染色; .%冰醋酸水溶液浸洗; .%磷铝酸水溶液分化: .光绿液染色: .%冰醋酸水溶液浸洗; .常规脱水,透明,封片:%乙醇%乙醇, %乙醇%乙醇一二甲苯石碳酸:甲 苯叶二甲苯中性树脂封固; .倒置显微镜下观察病理变化,放大倍数为×、×; .放大倍数为下,由一位独立观察者随机选取个视野/切片,对纤维 化程度进行评分。标准:,正常;,少量;,中等量;,大量。 六免疫组化分析 %甲醛固定充分后的组织块,采用法免组化学分析,按照试剂盒说明 进行,测定具体步骤如下: .常规乙醇脱水; .常规石蜡包埋; .切片置于多聚赖氨酸防脱片的载玻片上; .清洗; .置于%的过氧化氢甲醇溶液,? .清洗×; .置于.%透化; .清洗×; .%牛血清白蛋白室温封闭 .一抗?孵育过夜:.:、:、一: 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究 第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 、:、一:: .清洗×; .偶联二抗:室温孵育; .清洗×: .加入复合物:稀释,室温孵育; .清洗×;蒸馏水迅速冲次; .加入显色液,~显微镜下进行观察,待细胞着色而背底颜色 较淡时马上吸去显色液,用蒸馏水迅速冲次,终止反应; .苏木素复染,蒸馏水冲洗; .常规脱水,封片; .倒置显微镜下观察病理变化,放大倍数为× 、; 。放大倍数为×下,由一位独立观察者随机选取个视野/切片,对免疫 组化结果进行评价。按阳性所占比例进行评分,标准如下:,阴性;, %%; ,%%:,%%;,%%。。 七腹膜组织的免疫荧光分析 %多聚甲醛固定、蔗糖梯度脱水并包埋于...复合物中的组织块用于免 疫荧光染色。 ..切片置于多聚赖氨酸防脱片载玻片; .清洗×; .%牛血清白蛋白室温封闭: .一抗。孵育过夜:.:,:; .清洗; .:或:偶联二抗室温避光孵育; .清洗×; .含防淬灭剂封片; .激光共聚焦显微镜观察,放大倍数:,必要时。 八原代机械性划伤模型 细胞以./孔的密度铺到孔板孔底的玻璃盖玻片上预先采用% 明胶铺板。汇合后无血清/培养基同步。无菌玻璃棒 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 刮伤单细胞层。清洗次后,无血清培养基培养或与 中种植在上层的/孑共培养。 九机械性划伤的迁移速度测定 、 、 、 、 、 、 、 原代机械性划伤后、 、,光镜观察细胞,计算各时间点、随机处细胞向刮伤空隙的迁移速度 。放大倍数:×。 十的免疫荧光分析 、 、 、 、 、 、 原代提取后,以及机械性划伤后 、,分别进行免疫荧光分析。 .细胞于%多聚甲醛中室温固定,固定; .清洗×: .%牛血清白蛋白室温封闭; .一抗孵育过夜:.:, :, 【.:,:: .清洗; .:或:偶联二抗室温避光孵育; .清洗×; .含防淬灭剂封片; .激光共聚焦显微镜观察,放大倍数:。 十一统计学处理 统计学处理采用 .统计软件包,所有计量资料使用均数标准差 检验,非参数用 泌表示,参数采用单因素方差. 检验比较组间差异。.时,有统计学意义。 四、结果 一特征性表面标志物鉴定 采用流式细胞荧光分析第代的特征性表面标志物。细胞的 阳性率为.%、为。%, 为.%,为.%。符合 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 表面标志物的特点围..。 一?】;? 。 二成骨分化潜能的鉴定 在成骨分化诱导的条件下,检测第代的成骨分化能力,采用 。 染色显示细胞外钙磷沉积。放大倍数图苎二空竖壁堑叁性腹膜纤维化的研究 第一节减轻急性腹膜纤维化的疗教研究 图 成骨分化能力评价染色,× 岫 “、 三成脂分化潜能的鉴定 在成腊分化诱导的条件下,检测第代的成骨分化能力,采用油红 。 染色显示细胞内有脂滴积聚。放大倍数图 图 , . 四治疗急性腹膜粘连的最佳注射方式与时间点 腹膜刮伤术后即刻、、、,分别通过经尾静脉或腹腔方式注射 ,以无血清尾静脉注射为对照组。术后,腹膜 粘连肉眼评分显示,对照组腹膜粘连明显,平均评分分值高。术后、尾静脉注 射可明显减少粘连的严重程度平均评分:. ; ,每组 ,腹腔注射方式组腹膜粘连程度稍有减轻,但无统计学差异平均评分: ?”斌脂分化黧评价啪红染色。第一章亡减轻急性腹膜纤维化的研究第一节 减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 .坩 : ,《。其余各时间点、不同注射方式的疗效均不理想图 。 ? 们口。一, ????????,;。 ,???????:;;。 ???????:;:。 ????????:::一 ,??????:;。 ..???????::;: ,??????:;;; ??????.;:;。 ?...........『 ???????::;:悔 『山?????::;。“ ??????::;二 『???::;。 屿对照组相比., 图 不同注射方式与时间点注射治疗急性腹膜粘连的疗效比较 , ’ . .髂 五尾静脉注射可减轻急性腹膜粘连程度 腹膜刮伤术后,通过尾静脉方式注射 ,以无血清 尾静脉注射为对照组。在术后、、,腹膜粘连肉眼评分显示, 对照组腹膜粘连明显,平均评分分值高。而尾静脉注射可明显减少粘连 的严重程度平均评分:,. .;,.坩.;,. ; 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 .每时间点每组图 ?与对照组相比,. 图 术后尾静脉注射明显减轻急性腹膜粘连的程度 ? 六尾静脉注射可减轻急性腹膜粘连的病理改变 腹膜刮伤术后,通过尾静脉方式注射 .以无血清 尾静脉注射为对照组。病理染色及三色染色分析在腹膜刮伤 后急性腹膜粘连的病理变化情况。结果显示,刮伤后在闻皮层及问皮下层出 现大量炎症细胞漫润及渗出,出现纤维粘连带。后细胞数量减少,粘 连带成熟,主要成分为脂肪组织、血管、胶原及少量细胞。能够减少炎 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究 第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 症细胞的浸润平均评分: ..;.,每时间点每组图 ,. ..,同时减轻胶原纤维的沉积平均评分: ,.坩..; ,. ..; ..;.,每时间点每组图..。 ,. 第一章减轻急性腹膜纤维化的研究第一节减轻急性腹膜纤维化的疗效研究 木与对照组相比,.,