【doc】A群链球菌疫苗研究：历史的要略和新的视角

【doc】A群链球菌疫苗研究：历史的要略和新的视角 A群链球菌疫苗研究:历史的要略和新的视 角 十A群链球菌疫苗研究:历史的要略和新的视角 SeanD.Reid等 A群链球菌分布,致病性,重新爆发及其严重性 化脓性链球菌通常是指1.ancefield分类中的A群链球菌(GAS),它是一群革兰阳性致病 菌,能引起人们包括咽炎,腥红热,化脓性筋膜炎和链球菌毒素中毒性休克综合症(streptococ— caltoxicshocksyndrome,STSS)等在内的广泛的疾病.感染后遗症有急性风湿热(acuterheu— maticfever,ARF),并发病症有风湿性心脏病(rheumaticheartdisease,RHD),并且感染A群链 球菌后也会发生急性肾小球性肾炎(acuteglomerulonephritis).ARF和RHD是全球引发可预 防的d,JD心脏病最常见的诱因.现在GAS唯一已知的宿主是人,它主要通过有症状的皮肤粘 膜感染者传播,但有时无症状的病菌携带者同样可以传播病菌.在美国GAS是引起所有年龄 组上呼吸道感染的主要原因之一.及时的诊断和治疗GAS引起的急性咽炎对于减少GAS的 一章中我传播风险,阻止化脓性的并发症及链球菌感染后遗症是十分必要的.在这们将回顾 一 下GAS疫苗研究的概况,探讨最近的研究进展,同时展望一下其未来发展前景. 美国及其他西方国家的发病情况 据估计在美国每年约有1500万链球菌咽炎病例发生,在这些急性咽炎病例中 15%, 30%是儿童,5%,10%为成人.每年直接与咽炎有关的医疗费用约2O亿美元. 历史上,GAS感染是美国主要的发病和死亡的原因之一.例如,在1895,1905年间,波士 顿城市医院有将近25000例病人因为腥红热住院,病例死亡率高达近15%.以此同时,猩红 热被认为是全国性流行疾病,并且许多病例在英国等欧洲大陆被报道.虽然多数的报道在20 世纪以前并没有区别猩红热和咽炎,但其数量是惊人的. 急性风湿热的发病率在20世纪初的美国同样是很高的,由风湿热导致的死亡率为7/10 万.二战期间,一场大规模风湿热在美国大湖地区的新兵中爆发,在美国海军训练中心,记录 有21209例病例.此外,在1943年的1300万人伍新兵中确诊有近100000例风湿热和风湿 性心脏病病例. 战后,由GAS感染及其感染后遗症引发的发病率和死亡率逐渐下降,到1965年美国报告 的风湿热病例数量已经下降至4998例,到1984年病例数更是减少到117例.1981年风湿热 的死亡率为0.5/10万.抗生素在治疗GAS咽炎中的大规模的使用和医疗条件的改善是GAS 感染及其感染后遗症引发的死亡率和发病率下降的原因之一,更好的营养和卫生条件同样起 到了十分重要的作用. 然而,急性风湿热病例下降的趋势并没有持续下去.2O世纪8O年代和9O年代初期急性 风湿热在美国的犹他州,俄亥俄州,纽约,田纳西州,密苏里州爆发,但是其从新爆发的原因至 今仍然不清楚.类似的病例增加现象在欧洲未见报道. 疾病的重新爆发 在2O世纪8O年代末和9O年代初,包括链球菌毒素中毒性休克综合症(STSS)在内的侵袭 性GAS感染病例不断增加(图1).在许多国家均见报道,包括美国,加拿大,英国,瑞典,挪 威,芬兰,新西兰,澳大利亚和日本等.这些从新爆发疾病的多数病例与GAS的ET1和ET2两 个血清型菌株有关,它们分别达1型和3型M蛋白.此外,这些克隆株还被发现产生一种 外毒素(链球菌致热外毒素A,SpeA),它是一种超抗原.GAS疾病的再度爆发的分子机制尚 89 图1基于9个国家30675124人的监视调查,2001年侵袭性A群链球菌相 关疾病的发病率和死亡率. 不清楚,但是人群的免疫力(比如人群的免疫状态)的改变或许是一个重要因素.例如,一系 列的研究证实有的患者轻微的GAS感染即可产生高水平的抗链球菌致热外毒素B(SpeB)的 血清抗体,相反,有的患者虽然是严重的GAS感染也只产生低水平的抗SpeB的抗体,即使是 致死性的感染仍然也只是产生低水平的抗SpeB的特异性抗体.GAS菌株可以在基因水 平上不断的变异,这种变异可以影响其导致疾病的严重性.而且,导致严重的GAS疾病的重 新爆发的很可能的一个因素就是由于出现了不断增加GAS适应性的新的遗传变异.Hoe等 曾研究过一段抑制补体功能的高变基因(sic)片段,比较了从三个国家临床观察病 例分离的超 过1100多个菌株基因序列,发现它们在人的粘膜表面发生极快分化变异.有意思的是,这些 sic基因基本都局限于M1型GAS中,最近有证据表明sic抑制GAS与细胞表面的粘合从而避 免了GAS病原菌的被内化和杀伤,促进了GAS长时间的存活和传播. 在人群中用替换了血清型M蛋白的GAS感染研究 有些研究报告了用替换了主要的血清型M蛋白的GAS感染普通人群数月至数年不等,此 外,最近一项在半封闭人群中500名儿童和成人关于GAS咽炎的流行病研究显示丰富血清型 M蛋白有极快的变异.在6个月期间(1999年7月1日,1999年12月31日),111例咽部 GAS培养阳性病例中92%的分离菌株为M1血清型.而以后3个月(2000年1月1日,2000 年3月31日),126例咽部GAS阳性分离菌株中,M6为主要血清型(84%).目前并不清楚这 些观察病例情况就是代表了我们很少研究的普通GAS感染人群流行病学的一般状况,或者这 种被替换的血清型M蛋白的只是其丰富血清型M蛋白中很少的一部分. 发展中国家的GAS疾病 GAS是全球主要的发病和死亡原因之一.因此,很明显,发展中国家解决GAS疾病负担 首要考虑的就是疫苗.据估计现在全球约1200万人被风湿热/风湿性心脏病感染,200万病 90 人需要进行反复住院治疗,100万人在5-20年内需要心脏手术.发展中国家每年风湿热/风 湿性心脏病病例比发达国家高100-200倍,每年导致40万人死亡.在许多发展中国家风湿 性心脏病是导致儿童可预防性心脏疾病的首要原因.1986年世界卫生组织在世界五大地区 16个发展中国家进行了一项为期五年的关于风湿热/风湿性心脏病的广泛深人的研究.共筛 选了140万在校儿童,平均每1000人中有2.2个被诊断为风湿热/风湿性心脏病.非洲(每 1000人平均4.7例)和地中海东部地区(每1000人平均4.4例)尤为突出.类似的研究表明 在其他一些风湿热/风湿性心脏病流行地区发病率也是非同寻常的高.例如,在南非Johan— nesburg贫困地区报道儿童风湿~/.k-t,湿性心脏病高达每1000人平均6.9例,同样在澳大利亚 北部的Aboriginal社区竟发现高达每1000人平均24例的发病率. 链球菌咽炎在发展中国家那些拥挤而又卫生条件差的地区同样是十分普遍的.然而,在 疾病的分子机制,流行病学和医疗负担等方面仅有有限的研究数据. 历史上关于早期GAS疫苗研究的努力 总体而言,早期GAS疫苗研究主要集中在用以下用两种刺激免疫系统应答以产生抗 GAS感染的保护上.一种策略就是寻求刺激局部粘膜免疫另一种就是引起型特异性全身免 疫.1906年,Gabritschewsky发展了一种从一例猩红热病例中分离的链球菌菌株全细胞疫苗. 在欧洲这种疫苗的在成千上万中的儿童中使用,明显的减少了猩红热的发生,然而与GAS相 关的一些并发症并没有显着的下降.在1924年Dick等报道一种由链球菌红疹毒素(猩红热 毒素)组成的疫苗能对猩红热提供保护.Cobum和Pauli后来证实红疹毒素抗体只是抑制了 猩红热疹的形成,其并没有阻止链球菌的感染.但是这些努力激励了其他的一些研究,1946 年Watson,Robthbard和Swift证实在灵长类动物的鼻内接种GAS能产生抗M蛋白的型特异性 免疫. 型特异性G的免疫保护 RebeccaLancefield是阐明基本的GAS型特异性免疫的先驱,她对M蛋白的广泛鉴定确定 其为一种重要的毒力决定簇,并且证实它能引发免疫动物和GAS咽炎病人的血清中产生抗M 蛋白的保护性抗体.这些研究同样说明抗M蛋白的抗体是型特异性的.后来Hirst和I.~nce— field的工作证明小鼠中对M蛋白的主动免疫同样能提供型特异性免疫保护.这些研究激励 了人们用加热灭活的型特异性M蛋白GAS菌株用于人体免疫,然而只在几种疫苗中产生杀菌 抗体.例如,Rantz及其同事证实在人志愿者中皮下接种3型或17型加热灭活的菌苗仅在那 些接受了大剂量的M蛋白经过一个长时期的个体中产生型特异性抗体.同样的,接种了部分 纯化的M19蛋白的志愿者中仅有一部分人产生了型特异性抗体. Beachey和Dale及其同事们对设计多价M蛋白疫苗作出了极大的贡献.一种包含1,3, 5,6,19和24型GAS的M蛋白氨基端部分肽段的多价疫苗已经被设计出来.这种六价的疫 苗免疫小鼠和家兔后均能产生抗各自血清型的特异性的杀菌抗体.实验同时也表明疫苗并没 有在小鼠和家兔中引起自身免疫反应.目前,这种六价疫苗正在马里兰大学疫苗发展中心进 行I期临床实验,实验在三组志愿者中剂量逐渐加大.初步的实验结果显示前两组的大部分 个体产生了抗这种六价疫苗的血清抗体.此外,许多个体还产生了初级或次级调理性抗体,第 三组志愿者的实验结果也即将揭晓.重要的是这种疫苗的I期临床实验表明它是安全的,具 有良好的耐受性和免疫原性. 这种六价M蛋白疫苗的研究结果促使Dale及其同事们发展了一种26价疫苗.这种疫苗 由四种不同的重组融合蛋白组成,每种重组蛋白包含有6或7种GAs病例中频繁出现的典型 91 血清型或是历史上出现致风湿病的M蛋白片段.在家兔实验模型中,这种疫苗具有免疫原 性.而且血清中有广泛的抗多数26种不同血清型GAS的调理素.重要的是,这种26价兔血 清显示出的对某些M4血清型链球菌的杀菌活性提示,这种抗血清型的保护作用并不存在于 26价疫苗中.问接免疫荧光检测显示免疫血清并不与人的心,脑,肾或软骨组织样本产生交 叉反应.在ScottHalperin博士的指导下,检测这种26价疫苗安全性的I期临床实验已经完 成.这种26价疫苗是安全的,具有良好的耐受性和很高的免疫原性,疫苗的?期临床实验正 在进行,实验中额外增加登记了70名成年志愿者.在评估最初实验结果和适当调整实验后, ?期临床实验将会扩大到学前儿童. 最近,用一种类似多决定族的策略,从澳大利亚Aborigianl地区人群中的普遍的M蛋白血 清型GAS氨基端区域构建了一种六价疫苗,在小鼠中,它能产生T细胞依赖性的特异性免疫 反应. 非型特异性免疫保护和粘膜免疫 引起自然粘膜免疫的机制仍然不清楚,有证据表明宿主粘膜表面的IgA可抑制GAS在鼻 咽部的增殖.Fox及其同事证实在人的鼻内接种纯化的M蛋白较之皮下接种能提供更有效的 针对相应病菌的免疫保护.针对多种GAS菌株的粘膜免疫已被成人中链球菌咽炎发病率的 普遍下降所证实,推测其机理是机体的自然获得性免疫所致. Fischetti和他的同事们已经探索开发一种基于M蛋白的非型特异性的,可能提供抗GAS 保护的粘膜疫苗的可能性.这种M蛋白的结构中含有两个具有可变的抗原性的N端重复区 域(designatedAandB),针对这些区域的抗体能针对型特异性M蛋白提供免疫保护.在多变 的A和B的相邻区域是一个种属保守的氨基酸重复单位 (designatedC-repeats).Fischetti等 证实患者血清中的针对C重复单位的抗体有几种不同M蛋白血清型,但是血清中针对同种血 清型N端表位的抗体并不是必须的.此外,用人或兔抗M蛋白的分泌型IgA被动免疫的小鼠 可形成对鼻内GAS侵袭感染的保护.随后的实验证实,用M6蛋白保守区域(呈递霍乱毒素B 亚单位结合物)主动免疫的小鼠可形成针对同种或异型定植菌的免疫保护. Good及其同事构建了一段含有344—355个M蛋白c区域的氨基酸的肽段,它含有一个 B细胞构象表位.这个J8肽段直接合成在氨基酸组的聚赖氨酸核心上,其结果产生了一个有 脂质半锚凹和自身佐剂性的脂质核心肽构件(LCP-J8).用缺乏额外佐剂的LCP—J8经胃肠外 免疫小鼠,产生了高滴度的特异性J8抗体.J8抗血清对4种不同的GAS菌株有调理保护作 用,对人心脏组织没有交叉反应.这些结果表明开发一种不含有潜在毒性佐剂的有效的GAS 疫苗是有可能的. 几种免疫方法结果引起保护小鼠经鼻内攻击后的GAS定植,包括:接种表达M6蛋白的减 毒鼠伤寒沙门菌,表达N端M5蛋白表位的活dublin沙门菌和表达M6重组蛋白的痘病毒. 另外,G+的人口腔共生gordonii链球菌已被用作活载体免疫小鼠,表达NH2端M6蛋白与白 面黄蜂毒液Ag5.2变应原或人乳头瘤病毒l6型E7融合蛋白的gordonii链球菌,激发了小鼠 粘膜IgA和特异性IgG应答. 其他GAS候选疫苗 对一个有效的GAS疫苗目标抗原的寻求并没有局限在M蛋白(表1和2).GAS糖类 (GRA),C5a肽酶(SCPA),链球菌致热外毒素A(SpeA),链球菌致热外毒素B(SpeB),链球菌 致热外毒素C(SpeC),链球菌保护性抗原(Spa),纤连蛋白(Sfbl和FBPS4),以及R28蛋白都 已作为候选疫苗在各种模型系统加以研究. 92 表1A群链球菌候选疫苗I 注:a:大概的分子重量.b:酶原经过蛋白水解酶水解后形成成熟,有活性的酶. 表2A群链球菌候选疫苗? 注:s.c:皮下;i.P:腹膜内;ND:无数据;SS:有统计意义的显着效果;NS 无统计学意义. GAS糖类大多数GAS相关性疾病发生在儿童时期,大于18岁的成人几乎不得此病. 大多数M蛋白血清型的抗体极少能在人血清中发现,表明GAS其他成分的抗体在自然免疫中 起作用.GAS糖类抗体存在于人血清中,且抗体滴度高峰期在17岁左右.据这些观测结果, Zabriskie及其同事提出GRA抗体保护成人期避免GAS感染的观点.他们的研究显示GRA抗 体是具调理性的,可促进对大多数GASM血清型的吞噬作用,以及能被动保护小鼠经腹腔途 径的异型菌攻击. 93 c5a肽酶SCPA是一种能裂解及灭活来源于人补体的C5a补体成分的内肽酶.认为 SCPA在宿主炎性应答中能抑制正常人补体的趋化活性,导致迟发性吞噬细胞恢复正常并辅 助GAS定植.感染scpA基因失活的GAS的小鼠,较感染野生型GAS的对照小鼠能更有效地 清除鼻咽部的GAS.来源于M49株的经纯化,酶活性失活的SCPA产生的抗体能在体外中和 M1,M6,M12,和M49血清型GAS的C5a肽酶活性.这些结果使得Ji等去探究SCPA可能的 保护作用.经鼻免疫来源于M49的失活SCPA的小鼠,产生了高水平的特异性分泌 型IrA及 血清IgG抗体,降低了M1,M2,M6,M11和M49血清型GAS菌株的定植水平.特定的序列数 据显示scpA等位基因的同源性大于98%,表明SCPA抗体可以提供对多种GAS血清型的保 护. 链球菌致热外毒素ASpeA已被认为是链球菌毒素休克综合症最常见的相关致热外毒 素.纯化的SpeA免疫的家兔不产生链球菌毒素休克综合症(STSS)并能抵御M1和M3血清 型菌的致死性攻击.由于SpeA蛋白天然的致热性及毒性,Schlievert及其同事将重点放在开 发能激发保护性抗体的SpeA无毒衍生物.他们构建并测试了单个,2个,3个及6个氨基酸突 变的衍生物,每个突变物均没有超抗原性质,诱导家兔产生了SpeA特异性抗体,并在家兔模 型中提供了对天然SpeA致死性攻击的保护. 链球菌致热外毒素C和SpeA的研究相似,Schlievert及其同事用三维结构来预测SpeC 上的与宿主分子相互作用或与结构正确形成相关的重要氨基酸残基.位点特异性突变被用来 产生无毒性的蛋白.两位点及三位点SpeC突变物在家兔模型中激发了避免STSS发生的保护 性抗体. 链球菌致热外毒素BSpeB是Elliot在研究单针对M蛋白的抗血清对某些GAS菌株的 无能性时首次发现并定性描述的.SpeB已得到广泛的研究,读者可从参考文献15和78获取 更多信息.简言之,SpeB是一种能在体外裂解人纤连素,玻璃体结合蛋白,人白细胞 介素1 前体,激肽原,尿激酶受体以及人基质金属蛋白酶的胞外半胱氨酸蛋白酶.SpeB在所有GAS 株上都有表达,对来源于全球200株GAS的SpeB测序分析表明SpeB蛋白是高度保守的.显 示SpeB具有免疫预防作用的最初迹象是基于GAS轻微感染的病人较患致死性链球菌疾病的 患者有更高的急性期抗体水平的观察.Kapur等证实用兔抗SpeB抗体被动免疫的小鼠及用 纯化SpeB主动免疫的小鼠经腹腔GAS攻击后均有显着增加的存活率.Lukomski等研究显示 SpeB的失活结果使得GAS定植的减少,小鼠的皮肤病损缩小及死亡率降低.Kuo等的研究提 供了对这些发现的进一步支持,他们发现用SpeB突变株接种BALB/c小鼠能较蛋白酶阳性株 接种引起更少的死亡率及组织损伤,随后的SpeB免疫提供了对GAS攻击的保护. 最近,Ashbaugh等报道speB的失活并没有导致GAS在小鼠中毒力的下降,这些结果与用 speB蛋白免疫的小鼠具有抗GAS侵袭性疾病的实验观察并不一致,提示可能是由研究者构建 体外传代或基因操作菌株产生的一种实验性的假象. 纤维连接蛋白GAS含有丰富的纤连蛋白,包括SfbI,SfbII,F2蛋白,PFBP和FBP54. 通常,这些蛋白结构上由一个可变的N端和一个负责纤连蛋白粘合的由37—48个氨基酸重 复单位组成的保守C端组成.最近,两种纤连蛋白SfbI和FBP54在鼠类的GAS感染实验模 型中产生了保护性免疫.小鼠鼻内免疫SfbI可分别激发80%和90%针对同种或异种抗原的 免疫保护.随后的实验证实,用SfbI纤连蛋白粘合区生成的多肽免疫小鼠可激发针 对异种 GAS的免疫保护. 小鼠皮下,口腔或鼻腔免疫FBP54能产生特异性的抗FBP54的抗体.粘膜的IgA水平同 94 样也有增加.大部分免疫后的小鼠在经M1,M3和M12GAS菌株腹膜内的攻击后仍然存活. 从9例临床病人中分离的代表7种M蛋白血清型(包括M1和M3)的菌株的FBP54氨基酸序 列分析得知,其98%的序列是保守的.要确定其他纤连蛋白在自然GAS菌群中的多样分布情 况,就需要进行更多的关于FBP54分布的大量的研究. 链球菌保护性抗原(Spa)继Dale等人后证实,18型M蛋白阴性突变GAS被抗血清调 理吞噬后Spa增加了抗突变体提取的粗制胃蛋白酶活性.用抗Spa和抗M18的抗血清被动免 疫可获得抗M18亲本菌株的免疫保护.Spa抗血清对M3和M28型菌株具有调理作用,而对 M1,M2,M5,M6,M13,M14,M19和M24等血清型则无效.急性风湿热病人也有可检测到的抗 Spa的抗体. R28蛋白R28蛋白最初由Lancefield报道,后来在英国证实它与产后脓血症(亦称产褥 热)有关.用R28或B群链球菌中类似物的抗体被动或主动免疫小鼠可提供两种针对R28, M28型菌株攻击的免疫保护.有证据表明R28只限存在于M28型菌株和一些M2和M48菌 株中,提示其免疫预防用途是有限的. 链球菌血红素胶联蛋白(Shp)分析M1型GAS基因组发现Shp是以前尚不清楚的细胞 外蛋白成员之一.Shp与血红素成1:1的比例出现,随后的流式细胞仪分析证实Shp位于GAS 细胞表面.ELISA分析28例GAS侵袭疾病病例有24例病例恢复期血清中抗Shp抗体水平较 急症期有明显的升高.分析从咽炎病例中得到的血清样本也得到了一个类似的结果.用加有 佐剂的重组Shp免疫小鼠能提高抗Shp的血清抗体滴度,直接杀菌检测显示小鼠抗Shp抗体 能明显抑制M1菌株体外生长.铁对GAS的生长是必须的,并且可以调节毒力因子的表达,因 此抑制Shp的活性在治疗上是有益的. 感染人群中GAS介导的自身免疫 原发的GAS感染可发生在那些在自然界能发生自身免疫的非化脓性链球菌病后遗症以 后.这些疾病更多的是指急性风湿热和风湿性心脏病,但它们也包括急性肾小球性肾炎,滴状 牛皮癣和神经心理性紊乱等.目前GAS感染与滴状牛皮癣和神经心理性紊乱之间的关系还 不清楚.关于GAS咽炎与急性风湿热的联系Cobum和Collis有两篇文献报道.研究人员观 察急性风湿热后的咽炎病例发现,在病人咽炎病症期的咽部可培养出溶血性链球菌(GAS),但 在病人的风湿病症期间却不能培养出.Collis基于对那些有过急性风湿热复发史并且反复发 生扁桃体炎病人的观察,发现在那些"曾经有过链球菌感染的人中产生交叉免疫反应的可能 性极大".Cavelti后来发现对心脏自身免疫抗体与急性风湿热有关. 人们仍然十分关注GAS疫苗原为产生免疫保护的作用能否刺激机体产生自身免疫后遗 症.例如,在波士顿Samaritan慈善中心进行的一项疫苗临床研究中,2名21岁健康的风湿病 人(兄弟)在用部分纯化的3型M蛋白免疫后发展成为风湿热.然而,目前仍不清楚是否是疫 苗中的M蛋白引起在这些个体发生急性风湿热.2O世纪6O年代至7O年代期间的研究确定 了许多交叉反应抗原包括M蛋白,M相关蛋白,A群多糖和被膜透明质酸等.随后用GAS单 抗的研究证实在心脏中的交叉反应抗原是阻凝蛋白,并且将这些交叉反应抗原定位于GAS细 胞壁和细胞膜上.许多实验证实M蛋白和N一乙酰氨基葡萄糖(GRA组分之一)为交叉反应 抗原,并且提示其还有其他交叉反应抗原存在.另外的实验显示一螺旋M蛋白与一螺旋卷 曲螺旋蛋白包括心脏和骨骼的原肌球蛋白,波形蛋白,laminin和角蛋白.从急性风湿热病人 血清中分离纯化的抗阻凝蛋白抗体的亲和力实验表明,用抗M蛋白和N一乙酰氨基葡萄糖的 单抗鉴定抗阻凝蛋白抗体是急性风湿热病人血清中的交叉反应抗原.其他一些关于GAS介 95 导的自身免疫的信息,读者可见参考文献1的最近的学术回顾. M蛋白交叉反应机制被认为是T细胞介导胞内心肌蛋白不能与抗体结合.存在于风湿 性心脏病病人的CD4T细胞已经被证实其在M蛋白(研究中用的是M5蛋白)的分子模拟实 验中起作用.最近报道,6只用重组6型链球菌蛋白免疫的Lewis大鼠有3只发展为瓣膜炎和 心肌炎.风湿病例的瓣膜切片(valvesections)显示CD4淋巴细胞在小鼠心脏瓣膜炎中有渗 透现象.然而,并没有直接的证据证明人抗体的交叉反应是由GAS感染的直接结果或是由于 机体组织被损伤的继发反应引起的. 新的GAS胞外蛋白抗原 GAS众多的染色体,等位基因,和血清型的差异与多样性妨碍了疫苗的发展,对病原体与 宿主的相互作用的理解,对不同菌株行为的差异的认识形成了很大的阻碍.我们花了40多年 的时间才知道诱使GAS感染病人产生抗体的是许多胞外蛋白,但是其中许多抗原到现在还没 有得到确定.利用基因组序列,通过比较基因组或其他的后基因组方法可以快速的确定众多 毒力因子和找到治疗靶点.最近有许多新的GAS胞外蛋白和细胞壁锚定蛋白被报道,而且越 来越多的证据表明,进一步研究这些蛋白用于作为提供免疫保护的疫苗的适宜性是必要的. 最近的一项研究分析了4株GAS菌株(M1,M3,M5和M18)的基因组,发现了5个编码新 的胞外蛋白的基因(sFy0747,spy0843,spyO872,spy1361和spy)(表3).5个蛋白均有传统革兰 阳性菌的氨基端的分泌信号序列,其中有4个蛋白(spy0747,spy0843,spy0872和spy1972)羧基 端有LPXTG基序,其共价连接革兰阳性菌的毒力因子于细菌细胞表面上.通过12个M蛋白 血清型的37株菌株的基因序列和总体基因分析发现,其等位基因变化十分有限, 提示这些蛋 白在这些菌株中是十分保守的.用Western免疫印记分析了80例处于恢复期的GAS侵袭性 感染,非侵袭性软组织感染,咽炎,猩红热等病人的血清证实,在多种型别的GAS感染的病原 体与宿主的相互作用期间所有这5种蛋白均被检测到(表4). 表35个编码新的外膜蛋白的GAS基因的染色体定位及其可能的功能 注:a:spyNo.:每个ORF在基因库中相应的数字身份;b:染色体位置是每个基因在ATCC 700294GASM1菌株基因序列上的位置;c:其蛋白可能的功能由BLAST分析预测;d:革兰 阳性菌细胞壁锚定蛋白的氨基酸主链,氨基酸缩写(L:亮氨酸;P:脯氨酸;K:赖氨酸;R:精 氨酸;I:异亮氨酸;T:苏氨酸;G:甘氨酸). 在革兰阳性菌中超过50个有LPXTG基序的胞外蛋白被报道,其中许多就是毒力因子. 最近证实,LPXTG使得蛋白~pyO843和spy1972展示在GAS细胞表面从而更容易接近抗体. 重要的是,所有有LPXTG锚定基序或密切相关的氨基酸序列的GAS细胞表面蛋白均被大量 的研究过(如M蛋白,C5a肽酶,血清浊斑因子,纤维连接蛋白和链球菌保护性抗原),它们均 为毒力因子并且能在小鼠模型中产生保护性免疫.因此,LPXTG基序是决定这些新鉴定的胞 外蛋白能否引起保护性免疫反应的重要决定因素. 96 表4重组GAS蛋白与各种GAS感染病人的血清免疫反应性的百分数 注:a:spyNo.:每个ORF在基因库中相应的数字身份;b:从9例近期GAS 咽炎病例中分离的康复期血清;c:从40例有急性风湿热病史的病例中分 离的康复期血清;d:从27例侵袭性GAS疾病病例中分离的康复期血清. 病原体与宿主相互作用的后基因组研究策略 不断增长的基因组全序列的研究打开了一扇研究病原体与宿主复杂的相互作用的大门. 3200Mb的人基因组序列和1.8Mb一1.9Mb的M1,M3和M18血清型GAS序列给我们寻找 新的疫苗候选抗原和理解链球菌疾病及其链球菌感染后遗症的致病机制提供了极大的帮助. 第一个GAS基因组的表达图谱最近由Smoot等发布,在这项研究中,通过DNA微阵列分析,基 因组在三种不同生理状态的温度(29?,37?和4O?)下表达有很大差异.这些结果说明GAS 在这些基本温度条件下有改变基因转录的能力,此外,还发现有28个基因编码的胞外蛋白随 温度的变化有不同的表达.这些结果提示,GAS感染可以影响一些可能具有保护性作用的抗 原的表达. 结合DNA微阵列分析和定量RT-PCR分析,Graham等用基因组方法研究了GAS调节系 统covRS(CO1),毒力控制)的两个组成部分.在比较了野生型M1菌株和其非极化的等位基因 衍生菌株(covR失活)后,发现在体外covR能影响15%(n=271)所有染色体基因的转录,包括 许多编码胞外蛋白和那些与生理调节和应激反应有关的基因.改变covR调节基因的表达同 样能在小鼠模型体内观察到软组织感染的发生.值得注意的是,covR是一个多基因的网络调 节系统,它影响编码其他调节转录因子的基因的表达.在早期研究Rgg在GAS基 因表达的调 节作用中也了发现类似的结果.M49血清型菌株及其等位基因衍生菌株(Rgg失活)的基因组 转录图谱的微阵列分析发现,Rgg影响超过1O个编码据推定或是被证实的毒力因子的基因的 转录.此外,Rgg还影响covRS,toga(其他已知的GAS毒力调节子基因)和其他几种尚不明确 的调节因子的表达.GAS中复杂的调整回路的阐明将勿庸置疑的为研究GAS的发病机理提 供新的视角,同时也可通过其他的研究方法来鉴别出新的前瞻性的治疗靶点. 为了回答这5个基因的表达调节和差异表达的问,有人在基因转录水平上用实时逆转 录酶PCR(TaqMan)作了检测分析.用TaqMan分析这5个基因的等位基因突变体菌株发现, GAS毒力基因的调节因子covR(几种GAS毒力因子的负调节因子,包括半胱氨酸蛋白酶及其 前体)和toga(M蛋白的正调节因子,有C5a肽酶,链球菌补体抑制剂,链球菌胶原状蛋白1) 均受这几种基因表达情况的控制.在缺乏covR抑制子情况下spy0747和spy0843的转录上 调,同时在缺乏toga编码的正调节因子的情况下yl972的表达下调. 因为在自然的GAS种群中有大量的等位基因及染色体的变化存在,有人用TaqMan分析 了代表M1,M3和M18血清型的各菌株中这些基因中的每个基因在各菌株中转录水平的变化 情况,实验同时也分析了从整个生长曲线上的六个时间点 (A600=0.05,0.1,0.2,0.4,0.6, 97 0.8)上提取的总RNA的情况.结果表明在上面的代表各个血清型的三个菌株中5个基因问 的最大转录水平和最高量表达时间等是有差异的.这些观察表明,虽然一个蛋白在基因水平 上是保守的,其在感染期间与宿主也有相互作用,但基因表达在水平和时间上的变化及随后蛋 白在菌株中的合成等均可能改变蛋白在宿主与病原体相互作用的过程中所起的作用. 从GAS基因组的对比中得出的最重要的发现就是前噬菌体促使株间的基因变异及其对 GAS致病机理的影响程度(图2). 图2GAS前噬菌体变异数量,整合位点和毒力成分.GAS核心基因约为1. 7Mbp,其噬菌体整合位点用三种不同颜色代表相应的菌株标注如图.每个 菌株的前噬菌体从复制起点顺时针依次排列.每个星号代表一个噬菌体编 码的已证实的或推测的细胞外毒力因子.种与种间噬菌体含量及其编码蛋 白量的变化能极大的改变个菌株的毒力及抵抗宿主先天性免疫的能力,其 GAS细胞表面亦发生变化.或许能利用这些变异发展出一些全新的治疗或 疫苗策略). 从三个已知序列的GAS基因组中发现,它们不同之处在于前噬菌体的数量,噬菌体组成 成分的,以及染色体的整合位点等差别.重要的是,l5个前噬菌体中有13个(其中包括3个 已知GAS基因组序列)编码至少一种已知的或待定的毒力因子,其中大多数的基因组序列在 此之前是未知的.这些毒力因子能够被分为两个功能组,第一组由PTSagsSpeA,SpeC,Spell, SpeI,SpeK,SpeL,SpeM,及SSA构成,第二组由一些退化的酶构成,包括几个DNAses和一个磷 酸脂酶A2.抗这些蛋白质的许多抗体是出现在恢复期病人的血清中,提示这些前 噬菌体编码 的分子是在人类感染过程中产生的.编码这些蛋白的基因被定位于噬菌体染色体整合位点附 近,其中某些基因有一个G+c序列,这一序列并非为GAS基因组或其前噬菌体所特有的. 这提示存在一些推定的或已经证实的毒力因子基因是通过另外的生物体基因的横向转移得到 98 的.总之,在GAS毒力决定因素中其噬菌体是一个重要的变异因素,他们所编码的新蛋白具 有引起免疫反应的作用,可能对宿主保护起重要作用. 总结 在这一章中我们回顾了GAS疫苗研究的现状.后基因组时代的技术已经使得一些新的 GAS疫苗的发现变得更加简便,同时也为这一原本仅限于由M蛋白及其他的几个分子引发的 免疫学上的保护性刺激的研究的领域提出了新的展望.可是,GAS感染的发病机理是复杂 的,而且由单一抗原产生的疫苗可能不会对所有的GAS感染形态和感染后遗症有保护作用. 尽管严重的GAS疾病的爆发事件是相对稀少的,但急性风湿热和风湿性心脏病的发病情况说 明了发展中国家承担这一疾病负担的实质情况,每年有超过百万人口处于此疾病的危险当中. 此外,在发达国家GAS咽炎是儿童发病及其经济损失的主要原因之一.因此,必须持续性的 保持对疫苗发展新策略的关注.将来的GAS研究必须清楚其在自然宿主内的活动情况,关于 GAS发病机理的分子基础和机体抗此疾病的免疫保护等方面最好的洞悉结果必将来自于 GAS在相关的动物模型(人类以外的灵长类)或受感染的人体内情况的研究. [孙祖勇译董树林校] (参考文献167篇略) 99