琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳 以琼脂糖凝胶作为支持介质的电泳称为琼脂糖凝胶电泳。 二、琼脂糖凝胶电泳的准备和操作方法 1 、制备琼脂糖凝胶时注意避免产生气泡 凝胶电泳分为垂直型和水平型，一般垂直型分离效果好于水平型。但水平型 可制备低浓度琼脂糖，制胶和加样比较方便，且电泳槽制作简单、价格低廉。 用缓冲液配制所需浓度的琼脂糖凝胶，水浴或微波炉中加热使琼脂糖完全融 化，将溶液冷至 55 ? ，用少量琼脂糖凝胶将玻璃板或有机玻璃板封边，放置 样品梳（梳齿下端离玻璃板 0.5 -1.0mm ）。接着将融化的琼脂糖凝胶溶液不间 断地倒在玻璃板上或有机玻璃板模子中（厚度依样品浓度而定，须注意避免气泡 混入） , 室温下自然凝固。待完全凝固后小心取出加样器，在电泳槽中加入适 量电泳缓冲液，使胶板浸没在电泳缓冲液下约 1mm 处。 2 、样品制备与加样 所加样品应有适当浓度与较小体积，用微量注射器缓慢加入样品，点样时电 源必须处于关闭状态。为了指示电泳的距离，避免样品在电泳槽缓冲液中飘浮， 常在制备好的样品中加入含有蔗糖或甘油以及指示剂（溴酚蓝、二甲苯青等）的 上样缓冲液。另外，样品中含盐量不能太高，否则电泳中会出现区带消失、前沿 不齐等现象。样品中 DNA 含量以每条区带的 DNA 不少于 0.1 μ g 为宜， DNA 浓度过高会使电泳区带变宽，泳动距离异常。 样品的用量由加样孔的体积决定，通常为 10-50 μ g 。 3 、电泳 电泳温度视需要而定。对于大分子的分离，宜低温，电压应低（一般不超过 5V/cm ）。普通电泳可在室温进行，电泳的电压为 5-15V/cm 。 4 、染色－以 DNA 电泳为例 常用荧光染料溴化乙锭（ EB ）进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的 DNA 条带。 EB 能插入 DNA 分子中碱基对之间，使 EB 与 DNA 结合（超螺旋 DNA 与 EB 结合能力小于双链闭环，而双链闭环的 DNA 与 EB 结合能力小于线状双链 DNA ）。将以染色的凝胶浸泡在 1mmol/lMgSO 4 溶液中 1 小时，可以降低未结合的 EB 所引起的背景荧光，以提高检测的灵敏度。 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构 型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 （1）DNA分子的大小 在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数 成反比，因此通过已知大小的物移动的距离与未知片段的移动距离时行比 较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼 脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 （2）琼脂脂糖的浓度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 表 琼脂糖浓度与DNA分离范围 琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1 2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直线DNA>开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm=0），而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm>0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强 度等的影响。