葡萄糖_6_磷酸和果糖_6_磷酸的酶法测定

葡萄糖_6_磷酸和果糖_6_磷酸的酶法测定 Ξ 葡萄糖262磷酸和果糖262磷酸的酶法测定 应汉杰何永祥顾海红万红贵欧阳平凯 () 南京化工大学生物科学与工科系, 南京, 210009 ()摘 要 在血液、发酵液或组织液中加入磷酸葡萄糖异构酶 , 15131119、62磷酸葡萄糖 P G IEC (() ) 脱氢酶 , 1111111419及还原型辅酶 利用快速、准确的酶法检测262磷酸 ?2, GD H EC ΒN A D P D 葡萄糖和262磷酸果糖浓度。对该法的专一性、精确性、准确性以及误差来源及消除方法作了讨 D 论。对其它物质的分析作了探讨。 关键词 62磷酸葡萄糖 62磷酸果糖 酶法检测 13532 Q 中图号 (() ) 葡萄糖262磷酸 262和果糖262磷酸 262是糖代谢和糖异生途径的中间产物, 广 G P F P 1 , 4 泛地存在于动植物和微生物体中。262是通过葡萄糖磷酸化合成, 并且是磷酸戊糖支 G P 5 路的起始物。262和 262在临床中可作为营养药物。分析 262和 262的方法有多G P F P G P F P 67 种, 但是用定磷法分析, 262和 262互相干扰, 不能准确测定; 用色谱法 检测又需要GP F P 8 大型设备, 因此使用快速易行的酶法检测在医学、发酵等领域测定 262和 262是有现 GP F P 实意义的。 分析原理: P G I () 262262 aF P G P 262- GP D H +) (() 2622葡萄糖2+ + 内酯262g luco no lae to neP 62磷酸2D ? N A D PH H + b GP N A D P 622P g luco no lec to na se ()) ( 2622葡萄糖2+ 内酯cg lu co no lae to n eP 62磷酸2D ? H 2O 或无酯 )(2622磷酸2葡萄糖酸 6g lu co n a teP () 262通过 131119转化成 2625F P P G IEC G P () 262通过 26221111149氧化成 62磷酸22葡萄糖酸22内酯, 然后同时被 1GP GP D H EC D ? 水解成 62磷酸2葡糖酸。 () () () 反应 的平衡常数 ? 2, 262转化成 262后通过反应式 能定量地得出其aKF P G P b c 9- 7 () () 含量, 反应 的平衡常数 = 6. 0×1028?, 262的定量能通过过量的来测 b K G P N A D P () () () 量 的浓度是 262的 5 倍, 反应 通过不可逆反应 而能充分反应, 实验证明 N A D P G P b c 在分析中添加 62磷酸2葡萄糖酸酶对分析没有影响。 Ξ 国家“八五”攻关项目 收稿日期: 199626227 1 材料与方法 111 主要设备 () 紫外分光度计公司。650 DU B eckm an 112 主要试剂及其配制 + 11211 主要试剂及其来源: Β2N A D P , Β2N A D PH、G 262P、F 262P G 262P 2D H 及 P G I 均为 公司提供。 Bo eh r in ge r m an n h e im 11212 试剂的配制 () () 1 三乙醇胺 缓冲液 0. 2 , 7. 6ƒT EA m o lL pH 将 14199 三乙醇胺和 5 盐酸 10 置于 200 双蒸水中, 加入 2 ƒƒg m o lL mL mL m o lL 18 , 用水定容至 500 。N aO H mL mL 2 ()氯化镁 015 ƒ m o lL 将 10 ?6溶于 50 水中, 并定容至 100 。g M gC l2 H 2O mL mL 3 ()2ƒ30 ΒN A D P mm o lL 将 25 2溶解于 1 水中。 m g N A D P N a2 mL 262G P 4 准确称取 50 262溶于 100 水中。m g G P mL 2625 F P 准确称取 50 262溶于 100 水中。m g F P mL ()2622ƒƒ5 , 700 G P D H m g p ro te in mL u mL 6 10 原酶+ 90 三乙醇胺缓冲液, 摇匀。ΛL ΛL ()ƒƒ10 , 700 7 P G Im g p ro te in mL u mL 10 原酶+ 90 三乙醇胺缓冲液, 摇匀。ΛL ΛL 8 2的配制ΒN A D PH 准确称取 20 溶于 1 水中。2m g mL ΒN A D PH 所有配制的溶液都必须在 0, 4?冰箱中保存。2溶液可保存 1 周; 酶溶液 6、7 可ΒN A D P 保存几周; 其它溶液稳定性好, 可长期保存。 113 实验方法 11311 实验方法 取 2 只石英比色皿, 一为空白参比, 另一为标准或样品。 首先于各比色皿中加入 T EA 缓冲液 310 。在另一比色皿中加入 100 标样或样品, 以及 20 。在空白比 2mL ΛL ΛL ΒN A D P色皿中加入 120 重蒸水, 然后在 2 只比色皿分别加入 20 的。摇匀, 照分光光度 ΛL ΛL M gC l2法在 340 波长处测定吸光值。在两比色皿中分别加入 10 2622摇匀, 放置 10 , nm A 1ΛL G P D H , 于 340 处测定吸光值。然后加入 10 摇匀, 放置 10 于 340 处测, m in nm A 2ΛL P G Im in m in 定吸光值A 3。 根据 G262P = 2 - 1 和 F 262P = 3 - 2 分别与 262和 262含量作出工作曲线。 ?A A A ?A A A GP F P 11312 样品测定 将被测品配成浓度约 011, 0. 5 的 ƒm gmL 溶液, 按上述方法测定吸光值, 由同样条件下制 作的工作曲线查得被测样 262和 262的实 G P F P 际含量, 并按下式计算: C - C G262P F 262P() 成品粉剂含量% =×100% 样品配制浓度 ( ) 溶液 包括血液、组织及发酵液等含量 () m gmL = C G262P 或 C F 262P ×稀释倍数。ƒ 2 结果和讨论 211 紫外最佳吸收峰的选择2ΒN A D PH 将 012 的 2溶液在 200ƒmm o lL ΒN DD PH 图 1 Β2N A D PH 在 200, 500 nm 的吸收光谱 . 1 F igT h e sp ec t rop ho tom e t r ic ab so rp t io n , 500 区间作扫描曲线以重蒸馏水为参比, nm cu rve o f Β2N A D PH in 200, 500 nm 实验结果如图 1。 由图可以看出 Β2N A D PH 在 265 和 340 处。各有一吸收峰。由于核酸类等其他物质在 265 处也有吸收, 为了 nm nm nm 尽可能地避免干扰, 故将 340 作为 262和 262的特征波长。nm G P F P 212 酶量与反应时间的关系 () () 图 2 A 在相同 Β2N A D P 和样品浓度下不同浓度2 B 在相同 Β2N A D P 及样品浓度下不同浓度图 的 G262P 2D H 对反应时间的影响的 P G I 和 G262P 2D H 对反应时间的影响 ?2622135 ?262217 ?26221351: 7 ?2622170 : 0: 0: 0: 0GP D H UGP D H UGP D H U P GUGP D H U 1751: 1U P G?2622105 : 1?26221701: 7 : 1GP D H UGP D H U P GU () . 2 2622() F igA Inf luence o f d iffe ren t co ncen t ra t io n o f GP . 2 F igB Inf luence o f d iffe ren t co ncen t ra t io n o f P G I 2622D H o n reac t io n t im e unde r th e sam e co ncen2 and GP D H o n reac t io n t im e unde r th e 2t ra t io n o f Β2N A D P and sam p lesam e co ncen t ra t io n o f ΒN A D P and sam p le () () 图 2 和显示了在相同 2浓度和样品浓度下不同酶量的 2622和 A B ΒN A D P GP D H P G I () () 对反应时间的关系。图 2 和图 2 都表明在一定的 2浓度 30 和样品浓ƒA B ΒN A D P mm o lL 度 262和 262的浓度分别为 490 100 和 486 下, 随着酶量增加, 反应速率 ƒƒG P F P m g mL m gL 加快, 反应时间的长短决定于酶的浓度。 213 262和 262的标准曲线 G P F P 用公司出品的 2622和 2622作为标准品测定 262Bo eh r in ge r m an n h e im GP N a2 F P N a2 G P和 262的标准曲线。262和 262所配浓度分别为 490 和 486 。262和 ƒƒF P G P F P m g L m gL G P () 262分别按表 1 加入测定, 图 3 即为 与曲线。 图 3 表明在所 ƒF P ?A m G262PN a或F 262P 2N am gmL 22 选择的 262或 262浓度范围内, 标准曲线呈很好的线性关系且精确度高。GPN a2 F PN a2 表 1 标准曲线的制备 T ab le 1 P rep a ra t io n o f standa rd cu rve 编号1 2 3 4 5 6 0 20 40 60 80 100 262ƒGP ΛL 100 80 60 40 20 0 262ƒF P ΛL A 1 - 0. 004 - 0. 001 0. 004 0. 004 - 0. 001 0. 006 0. 001 0. 062 0. 121 0. 179 0. 230 0. 292 A 2 0. 266 0. 273 0. 285 0. 286 0. 288 0. 295 A 3 0. 005 0. 063 0. 117 0. 175 0. 231 0. 286 ?A 1 0. 265 0. 211 0. 164 0. 107 0. 058 0. 003 ?A 2 将 和 与 和 之间进行线回C G262P C F 262P ?A 1 ?A 2 归得 - 0. 9862+ 174. 36?A 2 C G262P = r= 0. 9999 V 样 - 0. 7818+ 186. 99?A 2 C F 262P = r= 0. 9998 V 样 线性回归表明散点非常靠近回归曲线, 示于 图 3。 3 方法的有效性 311 专一性 对 262和 262的标准曲线 图 3?A GP F P 2622对 262有很强的专一性, 它与葡 GP D H GP ? ?262262 GP F P( ) 萄糖、62磷酸葡萄糖酸和 262不加 不能反 F P P G I2622623 F ig T he standa rd cu rve o f ?A o n GP and F P 应, 因此在 2622分析中不会有干扰, 结果见G P D H 表 2, 其中 、262和 262的浓度分别为 501 、490 和 486 。 ƒƒƒGGP F P m g L m gL m g L 表 2 葡萄糖 62磷酸葡萄糖酸对 262和 262测定的影响 F P GP 226222 6T ab le T h e effec t o f g luco se p ho sp ho g luco n ic ac id and f ruc to sep ho sp h a te o n th e de te rm ina t io n o f G 3C G262P C G262P 相对误差A A 1 A 2 ?A 3 ƒ m gL m gL ƒ 50262水0. 001 0. 147 0. 146 489. 4 0. 13% + 50 ΛL G P ΛL 50 262+ 50 ΛL GP LΛ - 0. 002 0. 146 0. 148 496. 4 1. 31% 葡萄糖490 50 262+ 50 ΛL GP ΛL 0. 002 0. 149 0. 145 485. 9 0. 84% 62磷酸葡萄糖酸 0 262+ 50 6- 0. 004 0. 140 0. 144 48240 1. 55% ΛL G P ΛL F P 3 真实值 由表 2 可知, 葡萄糖等物质对检测干扰很小, 表明用酶法检测 262和 262具有很强 GP F P 的专一性。 312 方法的精密度与准确性 对 5 批 262和 262的发酵液进行检验, 并同 法所得的数据进行比较结果见 G P F P H PL C 表 3。 表 3发酵液中 262和 262的浓度测定 GP F P 262262T ab le 3 D e te rm ina t io n o f GP and F P in fe rm a t io n liqu id 批 号950103 950104 950107 950112 950114 - 1 酶? 4. 05 6. 27 6. 33 7. 82 7. 26 ƒC G262P gL - 1法 ƒ?C F262P gL 0. 0839 0. 126 0. 130 0. 146 0. 142 - 1ƒ? 4. 07 6. 25 6. 33 7. 78 7. 29 H PL C C G262P gL - 1法 ƒ? C F262P gL 0. 0835 0. 124 0. 133 0. 144 0. 141 由上表可知, 酶法测定 262和 262的结构与 法测定相一致。 G P F P H PL C 由以上实验数据和统计数据可知, 酶法检验 262和 262具有较高的精密度和准确G P F P 性。 313 酶纯度与酶活对测定的影响及其消除 如果最终吸光值小于测定过程中的最大吸收光值, 说明所用酶中含大于 1% 的谷胱甘 () ()肽还原酶 或黄素酶 。这两种酶都能催化氧g lu ta th io n e redu c ta sef lav in e en zym eN A D PH 化, 前一种情况为谷胱甘肽氧化, 后一种情况为氧气氧化, 而黄素酶法引起的氧化可以通过 10, 11 在分析中通氮逐氧来消除。 如果吸光值在 10 内不能达到最大值, 说明 2622和 的酶活太低, 必须使 m in G P D H P G I 用所新配制的酶或加大酶量来消除。 4 结论 利用酶法分析 262和 262具有快速、准确、精确、专一性强等特点, 可以用于发酵、 G P F P 医学等领域中 262和 262的分析。另外, 在分析过程中, 其它的代谢物可以通过添加相 G P F P () 应的酶和辅酶来分析 数据没发表: 分析时可以添加 和葡萄糖; 分析葡萄糖和果A T P H K 糖时可以添加 和。 后者也可通过加入 2葡萄糖苷酶来分析麦芽糖, 或添加 2半乳H K A T PΑΒ 糖苷酶来分析乳糖。212也可通过添加磷酸葡萄异构酶来分析。 G P 参 考 文 献 1 Sa if Sa ife r R ehm an , T an i Yo sh ik i, O ga ta Ko ich i. P rep a ra t io n o f g luco se p ho sp h a te th ro ugh th e t ran sp ho sp ho ry la t io n ( ) (). , 1975, 53 6: 38025 w ith imm o b ilized ce llsH ak ko ko gak u za ssh iE ng , , . 262昭和 77, 72, 881. ; C h iba ta Ich iro k a to Jo itU ch ida T om o fum i e t a lG luco sep ho sp h a teJ ap an Ko k a 2 , . . ,N ie ssne r H B eu t le r ECo n tam ina t io n o f comm e rc ia lly ava ilab le in te rm ed ia te s o f th e g lyco ly t ic p a thw ayE xp e r ien t ia 3 ( ) ( )1973, 29 3, 268270 E ng (). , 1984, 22271. 149 B e rk e W Sp ezB e r k evnfo r sch u rg san lage J ue lich J ue lsp e lpp Ge r 4 , , . , 6, 065, 17 1968C a r ro n M au r ice C E C a r ro n C laude L CF ruc to se p ho sp h a te top ic sF r M J u l 5 , , . C am p ane lla L Co rda to re M M azze i F e t a lD e te rm ina t io n o f ino rgan ic p ho sp h a te in d rug fo rm u la t io n s and b io lo g ica l 6 ( ) (). , 1990, 8 8, 12: 711, 16 f lu id s u sing a p lan t t issue e lec t ro deJ P h a rm B iom ed A na lE ng ( ) , , . . 1985, 280 6: 1398, 4000T am ee r A R Zh u rav leva T SV ann ik e r A V e t a lA rnau to r SA D o k l A k adN auk SSSR 7 ( )(). 3 . : , 1984, 6191, 8 M ich a l Ge rh a rd M e tho d s enzymA na l rdW e inh e im V e r lay ch em ie Gm b r lE ng 8 , . 2262,. , 2160: 67G la se r L B row n D HP u r if ica t io n and p rop e r t ie s o f dg luco sep ho sp h a te deh yd ro gena seJ B io l C h em 9 79 10 , , . 2, H o ho r st H J K reuz FH B uch e r T hU be r M e tabo litgeh a lt und M e tabo litKo nzen t ra t io n in de r L ebe r de r R a t te , 1995, 332: 18, 46B io ch em Z 11 , , . , 2′. , 1958,Bo e rn ing H S tade K F runde r H e t a lM e tabo lism o f dam aged t issue s IV H opp eSey le rs ZP h y sio l C h em 310: 232, 248 - 6- A NALY S IS O F GL UCO SEPHO SPHA TE A ND - 6- FRUCTO SEPHO SPHA TE BY ENZYM A T IC M ETHOD Y in H a nj ie H e Y on g x ia n g G u H a ih on g W a n H on g g u i O uy a n g P in g k a i D ep a r tm en t o f B io tech no lo gy and B io eng inee r ing, N an jing U n ive r sity o f C h em ica l T ech no lo gy, N an jing, C h ina, 210009 A bstra c t A rap id an d sp ec if ic en zym ic2sp ec t rop ho tom e t r ic m e tho d is de sc r ib ed fo r th e de2 22622262te rm in a t io n o f D g lu co sep ho sp h a te an d D f ru c to sep ho sp h a te in dep ro te in ized b loo d ( )5. 3. 1. 9 , . fe rm en ta t io n liqu id an d t issu e s b y u sin g p ho sp ho g lu co se isom e ra se P G IEC () 262, . 1. 1. 1. 49, . g lu co sep ho sp h a te deh yd ro gen a se GD H ECan d N A D P re sp ec t ive lyT h e . , op t im um de te rm in a t io n co n d it io n is def in edT h e m e tho d is sp ec if icrap id an d in exp en2 . , , , siveT h e sp ec if ic ityp rec isio n accu racyan d th e so u rce s o f e r ro r an d th e ir e lim in a t io n o f .th is an a ly sis m e tho d a re d iscu ssed 6226 Key word s g lu co se p ho sp h a te f ru c to se p ho sp h a te en zym a t ic de te rm in a t io n