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胰升糖素样肽

2017-11-18 9页 doc 27KB 36阅读

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胰升糖素样肽胰升糖素样肽 华中科技大学 硕士学位论文胰升糖素样肽-1对高游离脂肪酸诱导的胰岛细胞凋亡 作用的研 究 姓名:周琼 申请学位级别:硕士 专业:内分泌内科 指导教师:欧阳 金芝 20070401 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文胰升糖素样肽-1 对高游离 脂肪酸诱导的胰岛 细胞凋 亡作用的研究 研究生:周琼 导 师:欧阳金芝 教授 中 文摘要目的 探讨胰升糖素样肽(GLP-1)对高浓度游离脂肪酸(FFA)诱导的胰岛 细胞凋亡的保护作用。方法 细胞采用小鼠胰岛β细胞株 NIT-1,根据培养液中所加 物质不同试验分为...
胰升糖素样肽
胰升糖素样肽 华中科技大学 硕士学位论文胰升糖素样肽-1对高游离脂肪酸诱导的胰岛细胞凋亡 作用的研 究 姓名:周琼 学位级别:硕士 专业:内分泌内科 指导教师:欧阳 金芝 20070401 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文胰升糖素样肽-1 对高游离 脂肪酸诱导的胰岛 细胞凋 亡作用的研究 研究生:周琼 导 师:欧阳金芝 教授 中 文摘要目的 探讨胰升糖素样肽(GLP-1)对高浓度游离脂肪酸(FFA)诱导的胰岛 细胞凋亡的保护作用。方法 细胞采用小鼠胰岛β细胞株 NIT-1,根据培养液中所加 物质不同试验分为 4 组:?对照组;?GLP-1 组;?FFA 组;?FFAGLP-1 组。 干预 24 小时以后,TUNEL 法和 Annexin-V/PI 双标流式测定法测定各组细胞凋亡 率,Western blot测定凋亡相关蛋白 Bcl-2 及 Caspase-3 的蛋白量。结果 ?1mM FFA 可以诱导出明显的细胞凋亡(与对照组比较 Plt0.05);?Annexin-v/PI 流式 测定及 TUNEL 法测定均表明 GLP-1 能抑制 FFA 诱导的细胞凋亡(FFA 组与 FFAGLP-1 组比较 Plt0.05);?Werstern blot 测定显示,FFA 能使Bcl-2 表达下降 ( FFA 组 与 对 照 组 比 较 Plt0.05) GLP-1 能 抑 制 这 种 改 变 , (FFAGLP-1 组与 FFA 组比较 Plt0.05;与对照组比较 Pgt0.05);Caspase-3 在 FFA 组与对照组间无明显差异,但在 GLP-1FFA 组中,尽管与 FFA 组比较 Pgt0.05,但有下降趋势。结论 GLP-1 能够抑制高浓度游离脂肪酸诱导的胰岛β细胞 凋亡,并且可能是通过改变凋亡蛋白的表达来实现这一功能的。关键词 胰升糖素样 肽-1;游离脂肪酸;细胞凋亡;β细胞 1 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Glucagon-like Peptide-1 Inhibits High FFA-induced Apoptosis of islet β-cells in Vitro Postgraduate: Zhou Qiong Tutor: Prof. Ouyang jinzhi Abstract Objective we investigate the effect of GLP-1 on β-cell apoptosis induced byhigh free fatty acids and the possible mechanism. Methods Insulinoma cell line β-cellsNIT-1 cells were divided into 4 groups: ?control group?GLP-1 group?FFA group?FFAGLP-1 group. After beingcultured for 24 hours Annexin-V-FITC/PI FACS and TUNEL were used to evaluatethe apoptosis of each group. Western blot was used to evaluate the protein level ofBcl-2 and Caspase-3 involved in apoptosis. Results ?Incubating NIT-1 with 1mM FFA for 24 hour showed obviousapoptosis as compared with control group Plt0.05. ?Both Annexin-V-FITC/PIFACS and TUNELTdT-mediated dUTP nick-end labeling analysis indicate thatGLP-1 can inhibit the apoptosis induced by FFA Plt0.05. ?Western blot analysisshowed reduction of Bcl-2 in NIT-1 cells exposed to high FFA as compared withcontrol group while with the presence of GLP-1we see an increased Bcl-2 Plt0.05and decreased Caspase-3 though Pgt0.05 as compared with FFA group. Conclusion Our findings provide evidence that GLP-1 inhibits NIT-1 cellapoptosis induced by high FFA and it probably make effect by regulating the level ofBcl-2 and Caspase-3. Key words: GLP-1 FFA Apoptosis Beta-cell 2 独创性声明 本人郑重声明,本学位论文是本人在 导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知,除文中已经标明 引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做出贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识 到本人将承担本声明引起的一切法律后果。 学位论文作者签名: 日期: 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的 ,即:学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允 许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密? ,在_____年解密后适用本授权书。本论文属于 不保密?。 (请在以上方框内打“?” )学位论文作者签名: 指导教师签名:日期: 年 月 日 日期: 年 月 日 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 前 言 糖尿病是一种多发性慢性疾病,随着生活水平的升高,糖尿病的发生率逐年上升,其中以 2 型糖尿病更为多发。胰岛素抵抗和胰岛细胞功能受损是 2 型糖尿病的发病因素,二者何者占主导地位尚存在争议,但β细胞凋亡在胰岛细胞功能受损的过程中所起到的作用越来越引起重视1。高血糖,高游离脂肪酸,胰淀素等均是致胰岛细胞凋亡的重要危险因素。Butler AE2对 124 例尸检病例,并将其分为 2 型糖尿病组,IFG 组,正常组,发现诊断为 IFG 和 T2DM 的肥胖人群的细胞数与正常组比分别减少了 40,和 60,,但各组病例中β细胞新生和复制的频率并没有差别。在 2 型糖尿病病例组中,体形瘦的病例凋亡频率是非糖尿病组的 10 倍,体形胖的凋亡频率是非糖尿病组的 3 倍,凋亡数量差异明显(Plt0.05)认为凋亡的增加而不是新生和再生的减少是β细胞减少的主要原因,并且发现凋亡增多在 2 型糖尿病的早期已经发生。 引起胰岛β细胞凋亡的常见因素有:1、高血糖 其机制可能为:?Bcl 蛋白家族 促凋亡基因 Bad,bid,bik 等的过度表达,抗凋亡基因 Bcl-xl 水平下降。?白介素(IL)-1β/核因子-κB(NF-κB)路径。?己糖胺介导的凋亡。2、高浓度游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)其机制为:?神经酰胺介导的路径。?通过激活 Caspase-3,引起细胞凋亡。?下调 bcl-2 表达。FFA 诱导凋亡作用与自身饱和度有关。3、胰淀素 中等大小毒性淀粉样蛋白质粒子破坏膜的稳定性,导致β细胞凋亡。 近年来,脂毒性在 2 型糖尿病发生发展过程中的作用日益引起人们的重视,2 型糖尿病患者糖代谢紊乱与脂代谢紊乱并存,脂代谢紊乱贯穿于 2 型糖尿病发生发展的始末,流行病学研究表明,2 型糖尿病患者约 8090属于肥胖或超重3。肥胖者脂肪组织分解产生的游离脂肪酸free fatty acids FFA显著增加,参与胰岛素抵抗的同时,诱导了胰岛细胞凋亡使胰岛β细胞数量减少。前瞻性流行病学研究表明血浆游离脂肪酸升高是高加索人和印第安人进展为 2 型糖尿病的独立预测因子。Piro S 等4研究表明,24 小时暴露于高游离脂肪酸的胰岛β细胞凋亡明显增加。 3 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 英国前瞻性研究(UKDPS)报道显示5,胰岛细胞损伤呈进行性进展,理想的血糖控制并不能阻止β细胞功能的衰竭,而维持一定数量的胰岛β细胞是机体分泌胰岛素的必要条件。因此,保护胰岛β细胞数量防止其功能进一步受损和控制血糖一样,是现代糖尿病治疗的重要方面。 2 型糖尿病的自然病程中 不管采用何种目前的治疗,β细胞功能都呈进行性受损。饮食控制、胰岛素、磺脲类药物和二甲双胍等仅以控制血糖为主要目标,不能有效保持细胞β细胞数量,胰岛移植是目前能改善胰岛细胞数量的治疗方法,但是存在着供体不足、免疫排斥、成活率低等尚未解决的问题,因此未能普及。因此,寻找一种可以减少细胞凋亡、改善胰岛细胞数量和功能的治疗途径成为糖尿病治疗中亟待解决的问题。 胰升糖素样肽-1(Glucagon-like Peptide-1,GLP-1)是人小肠L细胞分泌的一种小分子多肽,由30多个氨基酸组成,在人体中自然存在。具有抑制食欲和胃排空,促进胰岛素原的合成,促进胰岛素基因表达,促进胰岛素分泌,提高外周组织对胰岛素敏感性,促胰岛β细胞新生和增生等多种生物学效应,近年来成为糖尿病治疗的新热点。 本研究从凋亡的角度,探讨对于高浓度游离脂肪酸诱导的胰岛β细胞凋亡,GLP-1是否具有抑制 作用以及其起作用的可能机制。 4 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 材料和方法(一)材 料 1.主要实验试剂 油酸 美国 Sigma 公司 软脂酸 美国 Sigma 公司 牛血清白蛋白BSA 美国 Sigma 公司 Diprotin A 美国 Alexis 公司 胰升糖素样肽,1(GLP-1) 美国 Sigma 公司 DMEM/F12 培养基 美国 Gibico 公司 胎牛血清(FBS) 美国 Gibico 公司 胰蛋白酶 美国 Gibico 公司 二甲基亚砜(DMSO) 美国 Sigma 公司 乙二胺四乙酸(EDTA) 美国 Sigma 公司 anti-Bcl-2 美国 Santa Cruze 公司 anti,Caspase-3 美国 Santa Cruze 公司 辣根过氧化物酶羊抗兔 IgG 北京中杉金桥生物技术有限公司 DAB 显色液 北京中杉金桥生物技术有限公司 NC 膜 武汉博士德生物公司 TUNEL 试剂盒 罗氏公司 Annexin,V/PI 双染试剂盒 罗氏公司 丙烯酰胺 美国 Amresco 公司 N N,-亚甲双丙烯酰胺 美国 Amresco 公司 Tris Base、TEMED 美国 Amresco 公司 过硫酸胺 美国 Amresco 公司, SDS 美国 Sigma 公司 蛋白质 MARKER 美国 NEW ENGLAND BIOLABS 5 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文2.主要试剂的配制1 游离脂肪酸free fatty acids,FFA的配制 游离脂肪酸中油酸oleic acid与软脂酸palmitic acid的比例为 2:1,震摇溶解所需剂量的油酸与软脂酸于无水乙醇中,使脂肪酸浓度为 200mmol/L,氮气吹干(防止游离脂肪酸氧化),加入 0.15mol/L KOH 使其溶解,逐滴加入到 PBS 配制的 10 BSA 溶液中,在氮气存在下 37?震摇助溶,使其完全溶解。0.22um CA过滤器过滤,-20?储存备用。 2 49.5T,3C 丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺 48g , N N -亚甲双丙烯酰胺 1.5g 双蒸水定容至 100ml 4? 避光保存(棕色瓶) 3 分离胶缓冲液 Trisbase 91g SDS 2g 双蒸水定容至 500ml pH 值 8.8 4 浓缩胶缓冲液 Trisbase 15g SDS 1g 双蒸水定容至 200ml pH 值 6.8 510的过硫酸胺(AP) 1g 过硫酸胺加入去离子水定容至 10ml,即为 10AP。放 4?保存,需每周新鲜配制。 6 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 6 5×上样缓冲液 SDS 2g 甘油 10g Tris,Hcl 0.756g β-巯基乙醇 1ml 溴汾蓝 0.01g 加双蒸水定容至 20ml 4?保存7 10×电泳缓冲液 Tris 碱 30(3g SDS 10(0g 甘氨酸 144(0g 加双蒸水定容至 1000ml pH 8.38 全蛋白提取液 Tris 0.6055g NaCl 0.8775g SDS 0.1g Nonidet P-40 NP-40 1ml 去氧胆酸钠 0.5g PH 调至 8.0 4?保存9 转膜缓冲液 Tris 碱 5.8g 甘氨酸 2.9g SDS 0.37g 甲醇 200ml 加双蒸水定容至 1000ml 7 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 10 10×PBS 配方 NaCl 17g KCl 0.4g Na 2 HPO4 -12H 2O 5.7g KH2PO4 0.54g 加双蒸水定容至 100ml 11洗涤液 含有 0.1吐温Tween-20 的 1×PBS,即 PBST 12封闭液 含有 5脱脂奶粉的 1×PBST 3.主要设备仪器 超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司 CO2 培养箱 德国贺力士公司 TGL-16B 台式离心机 上海科学仪器厂 ECT-BV-80 低温冰箱 美国 Cryostar 公司 PR203-B 电子天平 梅特勒-托力多仪器有限公司 倒置显微镜 日本 Olympus 公司 DDY-D 型垂直电泳仪 北京六一仪器场 DDY-D 型转移电泳仪 北京六一仪器场 流式细胞仪 美国贝克库尔特有限公司(二)细胞培养及分组 NIT-1 细胞购自华中科技大学同济医学院免疫教研室。 细胞培养于 DMEMF12 培养基,含 10胎牛血清,置于 37?、5 CO2 培养箱,每 3 天传代一次。将同一培养瓶中的细胞传入四孔,保证每孔中的细胞代数及细胞量一致,待细胞融合率达到 50,60时分为四组:? 对照组:加入0.5mM Diprotin-A; GLP-1 组: ? 在对照组基础上加入 10nM GLP-1 ? FFA 组: 8 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文在对照组基础上加入 FFA 贮液,使其浓度为 1mM ?FFAGLP-1 组:在 FFA 组基础上加入 10nM GLP-1。其中 Diprotin -A 为二肽酶抑制剂,防止 GLP-1 降解;GLP-1 每隔 12 小时加一次,干预 24 小时后开始检测。(三)方法 1(用 TUNEL 法检测细胞凋亡率 1制备细胞爬片 将 18mm×18mm 盖玻片置于酸缸中浸泡 2h,自来水冲洗 15 遍,以双蒸水冲洗 3 遍,晾干后以无水乙醇浸泡 30min,高压灭菌,烘干后备用。将灭菌后的盖玻片放入六孔板内,加多聚赖氨酸包被,晾干后种入细胞,细胞贴壁生长良好。 2干预完成后,弃去培养基,4? PBS 洗涤两遍,4,多聚甲醛固定 25 分钟。 3用 PBS 稀释蛋白酶 K 储备液至 20ug/ml50ul/片加至细胞爬片上,室温放置 20min,然后放入 0.2,Triton X,100 PBS 液中,室温 5min。 4 PBS 洗 3 次,3min/次。 5双蒸水洗 3 次,3min/次。 6样品上加标记缓冲液,50ul/片,室温放置 15min。 7将末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT) Biotin,? dUTP 离心, 及 分别取 2ul加入 16ul 标记缓冲液,混匀。 8弃去标记缓冲液,加入上述混合液,20ul/片,37?湿盒中标记 60min。 9将 20×SCC 液稀释 10 倍,然后将标记后的样品片浸泡于 2×SCC,室温放置 15min。 10PBS 洗 3 遍,3min/次 11样品片放入新鲜配置的 3ml/L 过氧化氢,甲醇溶液中,室温放置 15min,PBS 洗 3 次,3min/次。 12样品片加封闭液,50ul/片,室温放置 30nin,甩掉封闭液。 13以封闭液按 1:50 配置使亲和素,辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)为工作液,50ul/片加在样品片上,37?湿盒中标记 60min。 14PBS 洗 3 遍,3min/次。 9 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 15DAB 显色液显色。 16苏木精轻度复染。 17梯度酒精脱水,二甲苯透明,树胶封片,镜检。 18结果判定:细胞核中有棕黄色着色颗粒者,为阳性细胞。 19每份样品于高倍镜下随机选取 5 个视野并摄像,每视野计数 100 个细胞,计算凋亡细胞所占百分率即为凋亡细胞标记指数。 2(用 Annexin V/PI 双标流式测定法检测细胞凋亡率 1干预完成后,弃去培养液, 用 4? PBS 洗 2 遍, 0.125,胰酶,0.01,EDTA消化 2min,弃去消化液,4? PBS 洗 2 遍。 2加入 4? PBS轻轻吹打使细胞脱壁,并制成细胞悬液,调整细胞密度为5×105,1×106 个/ml。 3取 1ml 细胞,800rpm 4?离心 2min,弃上清液。 4加入 4? PBS,轻轻振荡使细胞悬浮。 5重复步骤(3)(4)两次。 6将细胞重悬浮于 200ul 结合缓冲液。 7加入 10ul Annexin V-FITC 和 5ulPI,轻轻混匀,避光室路从?15min。 8加入 300ul 结合缓冲液,立即上机(流式细胞仪)检测。 9流式细胞仪分析,获得四个象限组成的细胞散点图,每个象限的细胞数目就是在检测细胞总数的组分。左下象限代表正常细胞(An,PI,),右下象限代表早期凋亡细胞(An,PI,),右上象限代表晚期凋亡细胞(An,PI,),左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞(An,PI,)。 3. 用 Western blotting 方法分析凋亡相关蛋白的表达量。 Western blot 操作步骤: (1)细胞蛋白的提取及测定。 干预完成后,弃去培养基,用预冷的 PBS 洗两遍 每孔加入下述裂解液 100ul,冰浴 20 分钟。 10 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 全蛋白提取液 500ul PMSF 5ul Aprotin 5ul 冰浴 30 分钟 取酒精处理过的细胞刮匙,小心将细胞沿一个方向刮下(冰上操作),收集于冷 EP 管内 将收集的细胞于 4?下离心 12000 转×5min,取上清液,,80?冰箱保存备用。 Bradford考马斯亮兰法测蛋白浓度。 (2)制 Gly-SDS-聚丙烯酰胺凝胶 用洗涤剂、蒸馏水将两块玻璃板洗净、烘干。 将玻璃板安装在制胶的装置上。 在一个干净的小烧杯杯中配制 30, Acr/Bis 分离胶,依次混合下列成 分: 30, Acr/Bis 6 ml 分离胶缓冲液(PH 8.8) 4 ml 10 SDS 150 ul 双蒸水 4.8 ml 10AP 75 l , , N N N N -四甲基乙二胺(TEMED) 8 l 总体积 15 ml 一旦加入 TEMED,立即快速混匀并灌入玻璃板间,每对玻璃板之间可以灌5ml 分离胶,其高度约为玻璃板高度的下 2/3,接着赶去里面的气泡,然后迅速在分离胶面上小心加入去离子水进行水封。待分离胶聚合完全后(室温,30min),倾去去离子水,先用 0.1SDS 洗一遍,然后用去离子水洗两遍,最后用纸巾吸净残留液体。 11 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 在一个干净的小烧杯里配制 4浓缩胶,依次混合下列各成分: 30,(arc/bis) 1ml 浓缩胶缓冲液(PH 6.8) .
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