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应用流式细胞技术富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞.

2017-11-09 4页 doc 15KB 13阅读

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应用流式细胞技术富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞.应用流式细胞技术富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞. 应用流式细胞技术富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞 沈怡 陈汉平 马庭元 从孕妇外周血中分离胎儿细胞并进行遗传性疾病的检测,具有十分重要的临床价值。为了避免大量的母血细胞对胎儿细胞检测的干扰,必须对母血中的胎儿细胞进行分离富集。本研究采用流式细胞技术对36例孕妇外周血中的有核红细胞(NRBCs)进行分离纯化,初步探讨NRBCs在母血中的含量及与孕周的关系。 一、资料与方法 1.标本来源: 选择1997年10月至1998年6月在我院行产前检查的健康妊娠妇女36例(妊娠组),...
应用流式细胞技术富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞.
应用流式细胞技术富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞. 应用流式细胞技术富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞 沈怡 陈汉平 马庭元 从孕妇外周血中分离胎儿细胞并进行遗传性疾病的检测,具有十分重要的临床价值。为了避免大量的母血细胞对胎儿细胞检测的干扰,必须对母血中的胎儿细胞进行分离富集。本研究采用流式细胞技术对36例孕妇外周血中的有核红细胞(NRBCs)进行分离纯化,初步探讨NRBCs在母血中的含量及与孕周的关系。 一、资料与 1.标本来源: 选择1997年10月至1998年6月在我院行产前检查的健康妊娠妇女36例(妊娠组),年龄21,28岁,孕周12,27周,均为第1次妊娠,无严重贫血(血红蛋白>90 g/L)等妊娠合并症或并发症。对照组分别选择健康未 (未孕组),年龄为21,25岁,我院1998年1月至6月出生的新生孕妇女10例 儿10例(脐血组)。每次采血5 ml。 2. 实验方法:(1) 标本制备:抽取肘前静脉血,按常规方法分离,获得单个核细胞层。普通光学显微镜下计数细胞总数。(2)直接免疫荧光染色:按51×10/μl比例加入异硫氰酸(FITC)标记的CD71单克隆抗体(华美生物公司产品,为鼠IgM),孵育30 min后重悬于0.5 ml磷酸缓冲液中。(3)分选CD71阳性细胞:FACSort型流式细胞仪为美国Becton-Dickson公司产品。样品测试前,先用标准荧光微球校准仪器。设定分选参数,将标记好的细胞用聚合甲醛固定后上机分选。(4)观察项目:收集分选细胞离心后,制成滴片直接置于荧光镜下。找到阳性细胞后,将玻片干燥再行Wright′s染色,置于普通光学显微镜下观察其形态学特征。显微镜为日本产Olympus荧光显微镜。 3.统计学处理:采用t检验。 二、结果 1. CD71阳性细胞分布:根据视窗中前向角散射(FSC)、侧向角散射(SSC)及细胞大小,细胞颗粒性可分为3个区域:低度FSC,SSC为红细胞,中度为淋巴23细胞,高度为粒细胞。NRBCs位于中度区域,荧光强度在10,10区域。 2. NRBCs的富集及染色情况:荧光镜下标记上CD71单克隆抗体的细胞膜表面呈现绿色荧光,此类细胞为阳性细胞。将流式细胞仪分选后的细胞滴片,置于荧光显微镜下观察发现,妊娠组的阳性细胞极少,再将其涂片行瑞氏染色,发现细胞体积较淋巴细胞大,胞浆呈淡蓝色,胞核大而浓染,胞核与胞浆比约为2?1。符合NRBCs的形态学特征。而脐血组阳性细胞丰富,膜表面荧光强,瑞氏染色符合NRBCs特征的细胞多。未孕组则未找到符合上述特点的细胞。 3.CD71阳性细胞表达情况:妊娠组妇女外周血中CD71阳性细胞的平均含量-2为(0.39?0.26)×10,未孕组妇女的CD71阳性细胞的平均含量为-2(0.07?0.04)×10,而脐血组的CD71阳性细胞平均含量高达-2(3.88?0.75)×10。妊娠组与其他两组比较,差异均有极显著性(P<0.01)。 4.CD71阳性细胞在外周血中的比例与孕周的关系:孕12周至17周,CD71-2-2-2阳性细胞的含量从0.11×10升至0.64×10,孕19周后逐渐降为0.22×10。 三、 讨论 1. 流式细胞仪分选NRBCs:有研究表明,20 ml母血中仅含0,20个胎儿细,1,胞,用于产前诊断的唯一途径是对胎儿细胞进行富集。近年来流式细胞仪分 ,2,选功能的不断完善。脐血的CD71阳性细胞含量最为丰富,这与脐血富含NRBCs23有关。而非孕妇女由于血中不含NRBCs,其在荧光强度10,10区域内的细胞数 几乎为0。妊娠妇女则介于二者之间。对阳性细胞较为集中的区域,进行分选获-5得的CD71阳性细胞含量较国外学者报道的10的比例更高,达到了富集微量细,3,胞的目的。Zheng等证实,流式细胞仪分选细胞的纯度和回收率均高于其他分 选方法。 2(孕妇外周血中NRBCs的比例与孕周的关系: 明确胎儿细胞在孕妇外周血 中出现的时间与孕龄的关系,是指导产前检查采血时机的关键。本研究发现,在 孕早期外周血中NRBCs的含量随着孕周的增加而逐渐增加,孕17,19周达高峰,,4,以后随孕周的增加逐渐下降,与马旭等的结果较为相似。 (本文编辑:潘伟) 本课题受卫生部基金资助(基金编号:96-2-112) 沈怡(同济医科大学附属协和医院妇产科) 陈汉平(430030 武汉,同济医科大学附属同济医院妇产科) 马庭元(430030 武汉,同济医科大学附属同济医院妇产科) 参考文献 1,Simpson Jl. Isolating fetal nucleated red blood cells from maternal blood: the baylor experience-1995. Prenat Diagn, 1995, 15:907-912. 2,左道富,主编. 流式细胞术与生物医学. 沈阳: 辽宁科学技术出版社, 1996. 19-22,80-81. 3,Zheng YL, Demaria M, Zhen D, et al. Flow sorting of fetal erythroblasts using intracytoplasmic anti-fetal haemoglobin: preliminary observations on maternal samples. Prenat Diagn,1995, 15: 897-905. 4,马旭,王毅,王琳,等. 经母血采集胎儿细胞行产前诊断的最佳时间探讨. 中华 妇产科杂志, 1997, 32:293-295.
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