放线菌酮诱导大鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡

放线菌酮诱导大鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡 放线菌酮诱导大鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞 凋亡 ;蕾 第6卷第4期 2000拒 解剖科学进展 PR0GRESSOFANATOM1CAISCIENCES Vo1.6No.4 放线菌酮诱导大鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡 肛7 堡兰尘朴英杰黄行许 (汕头大学医学院中心实验室.组肛教教研童.汕头515031,第一军医大学中心实验童.t广州510515) 摘要丰实验利用技拽苗硐建造细胞凋亡动物模型,用原位末端标记和电镜方法观幂大鼠腑糸腰琳 巴结l觫巴细胞凋亡的形恋学变化.结果显示放线苗硐处理4h后,肠系膜赫巴结部分淋巴细胞处于凋亡状态, 主要表现为细胞桩凝聚,荣色质边集,可见线粒体,内质网增殖,自噬体和凋亡小体形成.结果表明技线苗酮 主要诱发肠系膜淋巴结生发中心的B淋巴细胞凋亡,巍粒体,内质网 的增殖是细胞凋亡的一种主动行为. 斓词璺塑粕姚向舭末懈J蟆秣 老誊雾八:结果溆色鹏硐己定,通过启动细胞自身的调节机制而发生 的一种细一”… 胞死亡形式],与细胞分化,胚胎发育,组织更新,系 统成熟等生理过程以及肿瘤发生,老年痴呆,免疫缺 陷,病毒感染等病理过程密切相关.细胞凋亡在药物 筛选,肿瘤治疗,预后判断,疾病发生发展机制研究 等方面有着广泛的应用前景.本实验用放线菌酮作 用于大鼠,用原位末端标记和电镜方法观察了肠系 膜淋巴结细胞凋亡的形态学变化,进一步探讨凋亡 淋巴细胞线粒体,内质网的增殖现象,自噬体在凋亡 淋巴细胞中的作用,以及放线菌酮与淋巴细胞凋亡 的关系. 1材料和方法 淋巴细胞凋亡模型:体重180,200g的雌性 SD大鼠,按3mg/kg体重腹腔注射放线菌酮 (Serva),对照组用PBS代替放线菌酮,4h后处死 动物,取出肠系膜淋巴结 原位末端标记肠系膜淋巴结组织4X2固定于 4多聚甲醛中,石蜡包埋,切成5m组织切片,按 谭小华的方法进行原位末端标记.光镜下用16D 目镜测微器馓凋亡细胞计数,共计数500个细胞,求 出每组凋亡细胞的百分率. 电镜标本制备将肠系膜淋巴结切成约1mm 大小组织块,放入2.5戊二醛中固定6h,PBS充 分漂洗后,经1锇酸后固定,丙酮逐级脱水,Spurr S树脂浸透,包埋,LKB型切片机做超薄切片,醋酸 铀和柠檬酸铅双染色,JEM1200一EX型透射电镜观 察,摄片. 2.1原位末端标记凋亡细胞 经原位末端标记处理的标本实验组淋巴结组织 中有许多明显的凋亡细胞(图1).而对照组未见明 显的凋亡细胞.凋亡细胞核经DAB显色后为深棕 色,细胞多呈固缩状态,主要分布在淋巴小结生发中 心的明医.未凋亡的细胞核不被DAB着色而呈正 常苏木精的蓝色细胞计数结果显示实验组凋亡率 为4O.2,对照组为2.6,两者间的差异经t检验 有统计学意义. 2.2电镜观察 凋亡的淋巴细胞形态不,染色变深.出现典 型的核凝聚(图2),多为整个细胞核凝聚,形成圆形 或椭圆形电子密度高的均质块(图2);也有的是部 分核凝聚,致密染色质块呈半月状或环状聚集于核 膜下(图3,4),其余部分的胞核电子密度低,染色 浅,可见核仁.凋亡淋巴细胞核在凋亡小体形成时, 核膜在核孔处断裂,胞核崩解,染色质块裂解为大小 不等的核碎块,被内质网或核膜包裹成自噬体(图 5).凋亡淋巴细胞的胞质亦浓缩,染色变深,可见到 线粒体,内质网,糖元颗粒,溶酶体等细胞器(图6). 有的细胞器发生形态改变,如线粒体增多(图7),这 些线粒体常聚集于胞质一侧,细胞核多被挤到另一 侧,线粒体结构异常,表现为肿胀,蝽紊乱,结构不 清,密度低,或空泡状,甚至崩解(图8).也可见内质 网增多,多围绕于核周,胞膜下或密布于胞质内(图 6,9).部分凋亡淋巴细胞的胞质内亦可见由膜性结 构分割,包裹的小体,小体内除含上述的致密染色质 块以外,还可见空化的线粒体,脂滴,溶酶体等(图5) 348?解剖科学进展2000年第6卷第4期 图1 图3 图3 图4 图5 图6 图7 图8 图9 原位末端标记的调亡淋巴细胞X400 凋亡淋巴细胞,胞棱致密,圆形或椭圆形×9000 凋亡淋巴细胞核部分凝聚.致密染色质块呈半月形聚集于棱膜下,其余部分的胞核电子密度低,染色浅,可见棱仁×45000 凋亡细胞核致密染色质块呈环状聚集于棱胯下×70000 凋亡淋巴细胞内形成的自噬性凋亡小体×30000 凋亡淋巴细胞脆质内的细胞器,如粗面内质网(?).线粒体(十】 凋亡淋巴细胞内增多的线粒悼,粗面内质网围绕于棱周×】7000 调亡淋巴细胞内结拊异常的线粒悼,棱周,胞膜下有较多的柱面内质网(?)X13000 拥亡淋巴细胞内增多的内质网,成团分布的线粒体(十)11000 2000年第6卷第4期霍霞等破线苗酮诱导大鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞凋亡 这些膜包小体也就是自噬性凋亡小体. 3讨论 有报道认为用蛋白质合成抑制剂(放线菌酮)和 mRNA合成抑制剂(放线菌素D)可抑制细胞凋亡 的发生0】,其机制是放线菌酮抑制了死亡蛋白的合 成但近年来的研究表明,放线菌酮并不能抑制各类 细胞发生凋亡Ledda—Columbano等报道用RNA 或蛋白质合成抑制剂可诱发大鼠肝细胞凋亡,Ijiri口 报道可诱发小鼠肠腺细胞凋亡,我们的研究结果显 示放线菌酮可诱发大鼠淋巴结淋巴细胞谰亡.放线 菌酮诱发细胞凋亡的机制可能是放线菌酮阻制了死 亡蛋白抑制物的合成,使得其对已经表达的死亡蛋 白的抑制解除,从而诱发细胞的自主死亡,也可能是 抑制细胞功能蛋自的表达而诱导细胞凋亡.显然,放 线菌酮具有抑制和诱导细胞凋亡的双向作用,细胞 是否凋亡可能取决于细胞自身所处的发育阶段. 不同发育时期的细胞或不同种类的细胞对诱导 细胞凋亡的因素有不同的反应.淋巴细胞对各种诱 导细胞凋亡的因素如射线照射,病毒感染,化学药物 等最为敏感],不足以引起其它细胞凋亡的小量射 线,药物却可以引起淋巴细胞凋亡,这主要归于淋巴 细胞能够较快地激活其自我消亡机制,以此来降低 基因突变的风险,这是淋巴细胞的一种自我保护机 制奉实验观察到凋亡的细胞主要分布在淋巴小结 生发中心的明区,生发中心的淋巴细胞95是中等 大的B淋巴细胞,提示放线菌酮主要诱导淋巴结中 的B淋巴细胞凋亡 凋亡淋巴细胞除表现典型的核浓缩,染色质边 集,形成凋亡小体外,我们还观察到凋亡淋巴细胞的 细胞器发生改变,如线粒体增殖,正常淋巴细胞内线 粒体较步,故我们认为这可能是正在凋亡的淋巴细 胞的一种代偿性反应口]考虑到增殖的线粒体多聚 集成团,推测增殖的线粒体可能是由原线粒体分裂 或芽生而来增殖的线粒体多出现肿胀,嵴紊乱,结 构不清,空化等畸形改变,可是增殖线粒体中的辅 酶Q催化生成大量活性氧,大量堆积的活性氧叉促 进了细胞的凋亡. 增殖的内质阿可能和细胞膜,核膜等一起参与 分割和包裹各种细胞成分形成自噬体.增殖的内质 网还参与溶酶体的形成,以利于自噬体的自噬过程, 我们将这种现象称为细胞的自噬性凋亡].凋亡淋 巴细胞的膜性结构进一部分割包裹各种细胞成分并 脱落形成凋亡小体,我们认为自噬体是凋亡小体的 前体,是细胞凋亡早期的形态特征之一,自噬体的形 成是凋亡细胞自我消亡过程中的一个重要过程. 参考文献 1WirleitnerB.Eaier—Bi,’tertichG.BuckG7.8一hydrone0pterl几. inducedapopmsisinJurka:T]ymphocytes:acomparisonwith anti—Fas—andhydrogenperoxidemediatedcel【death.Biochem Ph~rmaco1.1998,56(9):1181 2谭小华.张亚所,姜泊.荨.常规组织埘片稠亡细胞原位末端标记 方{击细胞生物学杂志.1997,19(1):48 3SchwartzLlvI-Therole.fceildeathgenesduringdevelopment. BioEssays,1姻1,13389 4LeddaColurnbanoGM.ConiP,FanGalRapidinductionof apoplosisarJiverbycycobex~0de,AmJPatho1.1992140: 545 5ljiriKrpottenS.Furtherstudiesontheresponseofintestinat cryptcettsofdifferenthierarchica『stattl$tohc…differemcy一 -l.t矗I,ldru目.BrJCancer,1987,55l113 5o唾nlJJ.DukeRCApoptoslsandprogrammedcelldeathin immunity.AnnuRevlmmunol,1992.10:267 7朴英杰,董武.霍霞.等.Y射线照射大鼠睥畦淋巴细胞拥亡厦其 和巨噬细胞的关系电子显触学揖】9.15(2)335 8PiaoYJ,LiuLP,HuoXa】Radiation—inducedKUtophagic apoptosisofrRtplenic]ymphocytes.ActaHistoehemCyzochemr 1997,30(56):6Z9 Cycloheximide—inducedApoptosisofLymphocyteinMesentericLymphNodes HuoXia.”Xijin,PiaoYingjie,HuangXinxu (CentralLab.Dept.0FHist—Embryology,ShantouUniversityMedicalColl ege,Shamou.515031) AbstractUsingtheSDratsasallexperimentalmodelofapoptosisinlymphocytesofthemesenterielymphnodeswith eycloheximide.thestructureoflymphocyteweteobservedwithinsituendlabelingandelectrontalcroscopetechnique.The resultsshowedthatl~anyolthelymphocytesdisplayedthemorphologyofapoptosisafter4hourstreatmentwithcyclohex— imidewithshrinkageofnuclearpyknosJs.OFcbromatincondensationandmar#nationmitocbondriaandendoplasticreticula proliferationtautophagosomesandapoptot[ebodiesformation.Ourpresentstudydemonstratedthatcycloheximidemainlyin— ducedapoptosisofBlymphocyteingerminalcenterofmesentericlymphnodes.Thephenomenonofmitochondriaandend0_ plasticreticulaproliferationwasanactiveproce~.sofapoptosls. KeyWordscycloheximide;lymphocyte;apoptosis{insituendlabeling}electro~.microscope