α1-酸性糖蛋白柱拆分西布曲明对映体

α1-酸性糖蛋白柱拆分西布曲明对映体 α1-酸性糖蛋白柱拆分西布曲明对映体 第23卷第8期 2006年8月 沈阳药科大学 JournalofShenyangPharmaceuticalUniversity V01.23No.8 Aug.2006P.52i 文章编号:1006—2858(2006)08—0521—03 1一酸性糖蛋白柱拆分西布曲明对映体 潘永玉,于莉,杨秀丽,杨凌,郭兴杰 (沈阳药科大学药学院,辽宁沈阳110016) 摘要:目的以ar1-酸性糖蛋白为固定相,建立了西布曲明的HPLC对映体拆分方法.方法考察了 有机改性剂种类,比例,缓冲盐浓度,pH值,柱温以及流速等因素对西布曲明对映体拆分的影响, 并对拆分机理进行了探讨.结果优化实验条件后,分离西布曲明的最佳色谱条件:流动相为异丙 醇一20mmol?LNH4Ac(pH5.0)(体积比为6:94),柱温为20?,流速为0.6mL?min,,在223miTt下 .结论西布曲明对映体在a,一酸性糖蛋白柱上能被完全分离. 关键词:西布曲明;a1-酸性糖蛋白柱;手性固定相;高效液相色谱法 中图分类号:R917文献标识码:A 盐酸西布曲明(sibutraminehydrochloride,结 构式见图1)是一种通过一级胺和活性代谢物二 级胺抑制中枢神经元突触前膜摄取5—HT和去甲 肾上腺素的减肥药物.分子结构中有一个不对称 碳原子,临床上以消旋体的形式给药.文献报道 以消旋体形式给药可能会引起大的不良反应uJ, 或者两对映体的药效可能不一样[2,31.因此,研 究西布曲明对映体拆分方法有助于更好的使其发 挥药效,同时减低药物的毒副反应.本实验建立 了在AGP固定相上拆分西布曲明对映体的 HPLC方法,同时从流动相的组成,pH值,流速等 方面考察了影响对映体分离的因素,并对其保留 机制进行了初步的探讨. H3C\/CH3 c. 哥? Fig.1Thestructureofsibutraminehydrochloride 1仪器与试药 LC-10AD液相色谱仪(SPD一10A紫外检测, Ckchrom色谱工作站,日本岛津公司),PHS一3DC 精密数显酸度计(上海科学公司).盐酸西布曲明 对照品(消旋体,辽宁日升科技开发有限公司),醋 酸铵,冰醋酸(纯.山东禹王化学试剂厂).甲 醇,乙腈,异丙醇(色谱纯.山东禹王化学试剂厂), 二次蒸馏水(自制). 盐酸西布曲明对照品溶液的配制:精密称取 盐酸西布曲明对照品(消旋体)约8mg,以二次蒸 馏水溶解,再用二次蒸馏水稀释制成质量浓度为 0.08g?LI1的溶液,经0.45btm滤膜过滤.滤液作 为样品溶液. 2方法与结果 2.1色谱条件 Chiral-AGP柱(4.0mm×100mm,5btm,瑞 典ChromTech公司),手性AGP保护柱(4.0mm× 10mm,5m,瑞典ChromTech公司),流动相:异 丙醇_20mmol?L的醋酸铵缓冲液(pH5.0)(体 积比为6:94),流速:0.6mL?min_.,检测波长: 223nm,柱温:20?,进样量:10L.在此条件下 拆分西布曲明对映体的色谱图见图2. 2.2有机改性剂种类和浓度对对映体分离的影 响 分别以不同比例的甲醇一20mmol?L的醋 酸铵缓冲液(pH5.0),乙腈一20mmol?L-1的醋酸 铵缓冲液(pH5.0),异丙醇一20mmol?L-1的醋酸 铵缓冲液(pH5.0)作为流动相,考察了有机改性 剂种类对西布曲明对映体拆分的影响.结果 明,甲醇,乙腈为有机改性剂时.对映体甚至不能 部分分离.异丙醇为有机改性剂时能使对映体达 到完全分离.流动相中异丙醇比例对容量因子 收稿日期:2005-09—16 作者简介:潘永N(1978一),女(蒙古族),内蒙古赤峰人,硕士研究生;郭 兴杰(1956一),女(汉族),辽宁葫芦岛人,教 授,博士生导师,主要从事体内药物分析研 究,Te1.024—23986285.E-mailgxjhyz@yahoo.com.cn. 522沈阳药科大学第23卷 Fig.2Chromatogramofsibutramineenantiomers (是),分离因子(a)和分离度(R)的影响见表1. Table1Effectofisopropylalcoholconcentrationinmobile phaseOiltheseparationofsibutramineenantiomers 由表1中数据可见,随着流动相中异丙醇浓 度的降低,对映体在柱上的保留时间增加,分离度 R和分离因子a也增加.当流动相中异丙醇的 体积分数为6%时,两对映体基本上达到了完全 分离. 2.3流动相pH值对对映体分离的影响 用冰醋酸或浓氨水调节流动相的pH值,使 醋酸铵缓冲液的pH值分别为4.0,5.0,5.5,6.0. 考察pH值变化对对映体分离的影响.随着流动 相pH的增加,西布曲明对映体的保留时间增大; 当pH值由4.0增加到5.0时,分离因子由1.2 增至1.5,此后pH值再增加时分离因子变化较 小;pH值为5.0时,两对映体达到完全分离,pH 大于5.0时,分离度继续增大,但同时色谱峰变 宽.流动相pH值对容量因子(是),分离因子(a) 和分离度(R)的影响见表2. Table2EffectofpHofmobilephaseontheseparationof sibutfamineenantiomers pH值对分离的影响可以用静电作用解释. 静电作用是影响保留的因素之一【引,在pH值大 于2.7时,AGP带负电荷;西布曲明为弱碱性药 物,在pH5.0时带正电荷,其保留机制是正负电 荷的相互作用而产生的.随着pH值的增加, AGP所带负电荷增多,与西布曲明正离子之间的 静电力增强,导致保留时间延长. 2.4醋酸铵缓冲盐浓度对分离的影响 在”2.3”条下的色谱条件基础上,使醋酸铵缓 冲盐浓度分别为10,15,20,40,60mmol?L,,考 察缓冲盐浓度变化对容量因子,分离因子及分离 度的影响.结果表明分离因子受缓冲盐浓度影响 较小;分离度在缓冲盐浓度为20mmol?L时,出 现最大值. 2.5柱温对对映体分离的影响 在流速为0.6mL?rain_.,流动相为异丙醇一 20mmol?LI1的醋酸铵缓冲液(pH5.0)(体积比 为6:94)的条件下,分别设定柱温为20,25,30, 35?,考察柱温的变化对对映体分离的影响.结 果表明,柱温的降低使容量因子k增大,同时分离 因子a和分离度R也随着增加.这是因为柱温 升高时,溶质在固定相和流动相之间的传质速度 变快,保留时间变短.因此在手性拆分西布曲明 的实验中,降低温度可以使分离度得到改善.柱 温对容量因子(是),分离因子(a)和分离度(R)的 影响见表3. Table3EffectofcolumntemperatureOiltheseparationof sibutramineenantiomers 2.6流速对对映体分离的影响 用异丙醇一20mmol?LI1的醋酸铵缓冲液(pH 5.0)(体积比为6:94)作为流动相,在柱温为 20?条件下,考察了在不同流速(0.4,0.5,0.6, 0.7mL?rainI1)下对映体的分离情况.结果表 明,流速对分离因子几乎没有影响.但随着流速 的降低,分离度缓慢增加,流速为0.6mL?rain一1 时,两对映体达到了最好的分离.流速增加引起 分离度的增加可能是由于溶质与蛋白质类固定相 的结合是一个相对较慢的动力学过程[.由于 流速增大导致柱压增大,降低色谱柱的使用寿命, 因此,在保留值符合的情况下,特别是流动相 中有机改性剂的比例较高时,应尽量采用低流速. 第8期潘永玉等:G1--酸性糖蛋白柱拆分西布曲明对映体523 2.7手性柱的重复性及精密度 由以上研究可知,拆分西布曲明的最佳色谱条 件为:流动相为异丙醇_20mmol?L-1醋酸铵缓冲液 (pH5.0)(体积比为6:94),流速为0.6mL?min,, 柱温20?.在此条件下,考察了手性柱的定量重 复性:供试品溶液连续进样5次,先洗脱出来的对 映体峰面积相对偏差为2.4%,保留时间的 相对标准偏差为0.5%,后洗脱出来的对映体峰 面积相对标准偏差为2.6%,保留时间的相对标 准偏差为0.4%. 3讨论 蛋白质类固定相与药物进行立体结构上的相 互作用,产生手性药物分子的分离,其分离机理尚 不完全清楚.目前大家较为认同的分离机制是由 Dalgliesh[6J1首次提出的三点相互作用识别模型理 论:手性识别至少需要在手性固定相和对映体间 存在三点相互作用,而且至少有一点作用与其他 两点在不同平面上.这种相互作用包括氢键效 应,疏水效应,静电作用等. 一 般认为,有机改性剂能影响溶质在固定相 上的保留行为和手性作用,主要是因为改性剂和 溶质竞争固定相上的氢键结合位点或改变蛋白质 疏水性的结果.改性剂会减弱固定相和溶质间的 疏水作用,导致溶质在固定相上保留时间减少,但 R型和S型对映体的减少程度不同,从而使对映 体达到分离. 本实验考察了西布曲明对映体拆分的影响因 素:有机改性剂种类,比例,缓冲盐溶液的浓度和 pH值,流速以及柱温.在以上诸多因素中,对对 映体分离起着决定性作用是有机改性剂种类,浓 度,缓冲盐浓度和流动相的pH值. 参考文献: [1]RadhakrishnaT,NarayanaCL,RaoDS,eta1.LC methodforthedeterminationofassayandpurityof sibutraminehydroehlorideanditsenantiomersbychiral chromatography[J].JPharmBiomedAnal,2000,22 (4):627—639. 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Resolutionofsibutramineenantiomerswith1-AGP chiralstationaryphase PANYong—yu,YULi,YANGXiu—li,YANGLing.GUOXing—jie (SchoolofPharmacy,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China) Abstract:0bjectiveTouseahighperformanceliquidchromatographicmethodforthedirectresolutionof sibutramineenantiomerswitha.1-AGPchiralstationaryphase.MethodsInfluencesofthepHvaluesofthe mobilephases,theorganicmodifiers,thebufferconcentration,theflowratesandthecolumntemperatureon theenantiomericseparationwereinvestigated.Theenantio?merleseparationwasoptimized.ResultsThebest separationOfenantiomersofsibutraminewasobtainedwithisopropylalcohol一20mmol/Lammoniumacetate buffer,pH5.0(6:94,V/V)asmobilephasewithflowrate0.6mL?min一 at20?.Thedetectionwave. 1engthwassetat223nm.ConclusionSibutramineenantiomerscanbeseparatedcompletelyonal—AGPchi. ralstationaryphase.ThemethodiSsimple.rapidandreproducible. Keywords:siburamineenantiomers;口1一 AGPcolumn;chiralstationaryphase;HPLC