抗人_型前胶原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

抗人_型前胶原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 () ( ) 本文报道用人工流产胎皮提取的 ?型前胶原BC I , Sigma, 牛 ?型胶原 BC ?, Sigma, h PC( ) () h PC ?免疫 Balb/ c 小鼠 , 获得 2 株抗 h PC ?mAb ?, 甲胎蛋白 A F P , 购自上海科苑生物公司, 角 ( ( ) 的杂交瘤细胞 MA1 和 M H8, 并对其特性进行了 蛋白 KE T , 第四军医大学西京医院消化病研究室 ) ( 初步鉴 定 。 樊代明教授赠及癌胚抗原 C EA , 购自无锡市第二 ) 制药 厂。包被浓度均为 215 mg/ L ; 酶标记抗体购 1 材料和方法自兰州生物制品研究所 。 111 hPC ?的提取 与 纯 化 按文献 1 的方法进 2 结果 行 。 112 杂交瘤细胞制备 参照文献2 的方法进行 。 211 hPC ?抗原的鉴定 提纯的 h PC ?经 PA GE 113 mAb 的特性鉴定 α) ( ? mAb 的效价测定 : 诱生后为单一区带 , 还原后可 见两条区带 , Pro 1 ? 4 α) ( 和 P1 ?, 与文献报道的结果完全一致。经高 腹水按文献 2 进行 , 效价测 定采用间接 EL ISA 法 ; ?mAb 的 Ig 亚类测定 : 采用琼脂双向免疫扩 分子量蛋白标准测定 , h PC ?两个亚单位的 M 分 r 3 散法和双 抗体夹心 EL ISA。所用 Ig 亚类的抗血 别为 190 000 和 170 000 。 212 抗 hPC ? mAb 杂交瘤细胞的制备 共融合 3清及 ABC 免疫组化试剂盒 , 均购自北 京华美公司 。 ?mAb 的特异性分析 : mAb 对组织的特异性 , 采用 块 96 孔板 , 克隆形成率为 38 % , 阳性率 10 % 。经 ( ( ) 链霉亲合素 2过氧化物酶 S2P 试剂 , 购自福建迈新 亚克隆后有 2 个克隆 MA1 和 M H8能稳定地分泌 ) 生物技术开发公司 做免疫组化染色 , 分析正常成 mAb , 即 于液氮中冻存 5 年后复苏及在体外连续传 ( 人组织 包括 : 心肌 、平滑肌 、纤维结缔组织 、胃 、 代 6 个月 , 仍能保持分泌 mAb 的能力 。 ) ( 肠 、卵巢 、肝 、脾和肾等, 人胚组织 包括 : 胃 、小 213 抗 hPC ? mAb 的特性 鉴 定 ? 腹水效价 : ) 肠 、肝 、胰 、气管 、淋巴结 、皮 肤 、肾 、心肌等与 EL ISA 法测定腹水的效价为 1?1280 ; ?抗 h PC ? (中国仓鼠成纤维细胞 V79 华西医科大学毒理教研 mAb 的特异性 ABC 免疫组化染色结果显示 , 成人 ) 室 提供的反应性 。即将 V79 细胞常规培养贴壁于 血管壁 、纤维间质与 V79 细胞 、肝癌细胞及间质均 () 玻片上 , 对组织切片和贴壁 的 V79 细胞 , 按常规 呈阳性显色 图 1 A , B , C, 与其他 成人组织均呈 方法进行免疫组化染色 。 ? mAb 对相关抗原的反 阴性 ; ?抗 h PC ? mAb 与相关抗原的交叉免疫反 应性采 用 EL ISA 法 。包被抗原分别为 :牛 I 型胶原应 , 所获结果见 1 。 是机体内重要的细胞因子 , 对抗原提呈细胞 、T 细 1 J u G , Kaff ka L , Tsien WH et al . St ruct ure2f unctio n analysis of hu2 胞及体液免疫应答均有较强的调节作用 。因此 , 已 man interleukin22 . J Biol Chem , 1987 ; 262 : 5723 - 5731 广泛用于临床抗感染 、抗肿瘤等治疗 。 IL22/ 2 Step hen R , Sp rang J , Fernando B. Cyto kine st ruct ural taxo no my GM2CSF 融合蛋白 , 既能通过 “桥联”作用加强 and mechanisms of recepto r engagement . Current Opinio n in St ruc2 ΦM与 T 细胞的结合 , 从而增强 T 细胞对抗原的识 t ural Biology , 1993 ; 3 : 815 - 827 Φ别能力 ; 同时又能活化 M和 T 细胞 , 具有类似第 3 Benso n MC , Do uglas EW , Hal EB et al . Enhanced hematopoietic 二信号的功能 , 提高抗原提呈的效果 。本文利用 activit y of a human granulocyte/ macrop hage colo ny2stimulating fac2 PCR 技术 , 对 IL22 3′端基因和 GM2CSF 5′端基因 to r / interleukin 3 f usio n p rotein . Proc Natl Acad Sci U SA , 1991 ; 88 进行了修饰 , 以利于 IL22 基因和 GM2CSF 基因的 ( ) 13: 5809 - 5813 ( ) 连接 , 用脯氨酸 Pro 作为连接臂 , 构建了 IL222 Weich NS , Tullai J , Guido E et al . Interleukin 3/ eryt hropoietin f u2 4 GM2CSF 融 合 基 因 的 表 达 质 粒 IL22/ GM2CSF2sio n p roteins : i n v i t ro effect s o n hematopietic cells. Exp Hematol , pL Y4 。经限制性内切酶分析及核苷酸序列测定表 1993 ; 21 : 647 ( )收稿 1997204228 修回 1997205229 明 , 此融合基因中 , 包含有读框正确的 IL22 基因和 () 上接第 145 页质的分子很大 , 有大量的决定簇 , 而 mAb 只能识别 表 1 mAb MA1 和 M H8 与相关抗原的反应性 其中的 1 个表位 , 故其强 度不足以使庞大而呈杆状 的胶原分子产生有效的颜色反应 ; ?胶原抗原与 mAb BCI A FP KE T CEA BC ?h PC ?mAb 的亲和力较差 , 只有 1 个位点的 mAb 很难显 MA1 + + + - + - 示出来 ; ?我们仅筛选出 2 株 mAb , 不足以与胶原 M H8 + + + - - - 分子多点结合 、增强其反应性 。总之 , 这 2 株 mAb 具有抗 PC ?的特异性 , 可作为 PC ?的免疫组化 试剂 。 3 讨论 胶原间质的免疫原性较差 , 加之间质胶原的广 参考文献 泛存在 , 因此提取纯化的 抗原 , 并制备无交叉反应 1 李伟道 , 刘兴明 , 林 丁等 1 人 ?型前胶原的提取、纯化与抗血 的抗体 , 技术上难度较大 。而利用淋巴细胞杂交瘤 清的 制备及应用于肝纤维化的诊断 1 胃肠病学和肝病学杂志 , 技术制备特异性的 mAb , 则无需高纯度的抗原 。目 ( ) 1992 ; 1 1: 44 - 46 Sundar Raj N , Martin J , Hrinya NJ et al 1 Develop ment and charac2 前已有抗各型胶原的 mAb 问世 , 但抗 h PC ? 的 2 terizatio n of mo noclo nal antibo dies to human t ype ? p rocollagen1 mAb 国内尚未见报道 。( ) Biochem Biop hys Res Co mm , 1982 ; 106 1: 48 - 57 ?型胶原主要分布在皮肤 、大血管壁 、肌肉及 樊代明 , 乔太东 , 陈宝军 等 1 一种简便快速敏感鉴定单克隆抗 3 ( ) 体 Ig 亚类的方法 1 中国免疫学杂志 , 1987 ; 3 2: 121 - 122 ( ) 纤维结缔组织的间质 。其前身为前胶原 PC ?, Byers P H , Mckenney KH , Lichtenstein J R et al 1 Preparatio n of 由上述间质细胞合成 , 分泌至细胞外后 , 进 一步转 4 t ype ? p rocolagen and collagen f ro m rat 1Biochem , 1974 ; 13 化为胶原纤维 。V79 细胞系体外培养的成纤维细胞 ( ) 25: 5243 - 5247 4 株 , 具有合成 、分 泌 PC ?的功能 。Byers 等报 Sakakibara K , Oshima AR , Igarashi et al 1 Immuno2localizatio n of t ype ?collagen and p rocollagen in cirr hetic human liver using mo no2 5 道当肝癌合并肝硬化时 , 肝癌细胞也可直接 合成 ( ) clo nal antibo dies1 Virchows Arch , 1986 ; 409 13: 37 - 46 PC ?。本文的实验结果与上述结论一致 , 表明这 2 ( )收稿 1997205216 修回 1998206225 株 mAb 也具有识别 PC ?的特异性 。但免疫组化 染色阳性者显色较浅 , 其原因可能是 : ?胶原 间