微生物实验讲义

微生物实验讲义 微生物学课程组 编 龙岩学院 二00六年十月 编写说明 微生物学是现代生物学科的先头学科,是科学技术现代化和农业现代化的重要学科领域之一～就其学科性质而言它又是一门实践性很强的学科。 实验课的教学目的是训练学生掌握微生物学最基本的实验操作技能～了解微生物学的基本知识～加深理解课堂讲授的微生物学理论知识～同时～通过实验培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力,实事求是～严肃认真的科学态度,为以后课程的学习和将来的工作以及科学研究打下坚实的基础。 本实验指定是在参考有关院校的微生物学实验教材的基础上～结合我们的实验室条件以及仪器设备状况～经过多方取舍编写而成～可供生物技术及畜牧兽医等专业师生参考。 由于编者水平有限～加上时间仓促、经验不足～在许多方面肯定有不少缺点与错误～希望各位读者批评指正。 在编写过程中～龙岩学院生物系全体师生给予大力支持～在此表示感谢。 编者 2006.10 目 录 实验一 显微镜的使用 ............................................... 1 实验二 微生物染色法 ............................................... 4 实验三 培养基的配制和灭菌 ......................................... 9 实验四 霉菌和放线菌的形态观察 .................................... 11 实验五 微生物细胞数量的测定 ...................................... 14 实验六 药物敏感试验 .............................................. 18 实验七 糖发酵试验 ................................................ 21 实验八 牛乳中细菌的检查 .......................................... 23 实验九 校园环境空气微生物的调查 .................................. 26 实验十 病毒的鸡胚培养 ............................................ 28 实验十一 病毒的血凝及血凝抑制试验 ................................ 30 实验十二 菌种保藏 ................................................ 31 附录 ............................................................. 40 实验一 显微镜的使用 一、目的要求 1、熟悉普通光学显微镜的构造及其使用方法。 2、了解油镜的原理～并掌握其使用方法。 3、学习悬滴法观察细菌的运动性。 二、实验原理 ,一,、普通光学显微镜的构造 普通光学显微镜包括机械部分和光学部分两部分。机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、 载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。光学部分包括接目镜、 接物镜、反光镜、光圈,虹采,、聚光镜,集光器,等,图1-1,。 (二)、油浸系的原理 浸系是在油浸镜与标本之间加1滴香柏油～调整光源检查细菌标本的方法。油浸镜是一种高倍放大的物镜～一般都刻有放大倍数～如95x、100x等。其镜头标记国产镜多用“油”字表示～国外产品则用“Oil”,Oil Immersion,或HI,homogeneous Immersion,表示。而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长～镜片最小～这也是识别的另一种标志。其使用原理 1 是:由于香柏油与玻璃的折光率相似,香柏油为1.515～玻璃为1.52,。镜检时～滴加香柏油的作用是使光源尽可能多的进入物镜中～避免光线通过折光率低的空气,折光率为1.0,而散失～因而能提高物镜的分辨率～使物像明亮清晰,见图1-2,。 三、实验器材 1、菌种 金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌染色玻片标本。链霉菌及青霉的水封片。 2、香柏油、二甲苯、擦镜纸、凹玻片、滴管、纱布。 四、方法步骤 ,一,显微镜油镜的使用 1、用低倍镜对光。 2、低倍镜观察,寻找观察目标,。 3、高倍镜观察,选取理想的观察目标,。 4、油镜观察:高倍镜观察后----上升镜微--油镜转至正下方在载玻片上加一小滴香柏油--小心地下降镜微使镜头浸在油里----用粗螺旋将镜微缓慢上升～寻找目标,物象,----用螺旋调节～使物象清晰----观察记录。 5、观察完毕。上升镜筒转动物镜转换器～使油镜物镜偏位。用干净擦镜纸擦去镜头上的油迹～最后再用擦镜纸擦去残留在镜头上的二甲苯。 6、将显微镜各部分还原～放回箱中。 ,二,细菌三态和荚膜标本的观察 按照上述步骤用油镜观察标本后绘图。 ,三,用悬滴法观察细菌的运动 1、取一块凹玻片放在实验桌上～使凹面朝上。 2、取盖玻片一块～滴1%盐酸液～用纱布擦洗。 3、在盖玻片的中央滴一小滴稻草汁培养体,水滴要小而圆,。 4、然后翻转盖玻片～并放于凹玻片上使水滴悬于凹窝中央。 5、悬滴片臵于载物台上～缩小光圈～同时下降聚光器～用低倍镜寻找水滴边缘。 6、将水滴中心部分移至视野中央～再高倍镜观察。 2 五、结果与思考 1、绘图记录观察 结果,细菌的运动性:用虚线表示运动路线末端用箭头表示运动方向, 2、油镜完毕后～镜头应如何处理? 3、观察细菌运动性有何意义? 3 实验二 微生物染色法 一、目的要求 1、学习掌握单染色的操作技术和无菌操作技术。 2、了解革兰氏染色机理～并掌握其操作技术。 3、学习掌握细菌芽孢染色方法。 二、实验原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明～在普通的光学显微镜下不易识别～必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色～使经染色后的菌体与背景形成明显的色差～从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便～适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色～这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中～细菌细胞通常带负电荷～而碱性染料在电离时～其分子的染色部分带正电荷～因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比～在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时～细菌所带正电荷增加～此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 染色前必须固定细菌。其目的有二:一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上,二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创立的～革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌,G+,和革兰氏阴性菌,G-,两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。 革兰氏染色法的基本步骤是:先用初染剂结晶紫进行初染～再用碘液媒染～然后用乙醇(或丙酮)脱色～最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后～细胞保留初染剂蓝 4 紫色的细菌为革兰氏阳性菌,如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)～该菌属于革兰氏阴性菌。 革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性～是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上～当用结晶紫初染后～像简单染色法一样～所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂～它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物～从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时～两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成～壁厚、类脂质含量低～用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小～透性降低～从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内～经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同～由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高～所以当脱色处理时～类脂质被乙醇(或丙酮)溶解～细胞壁透性增大～使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来～用复染剂复染后～细胞被染上复染剂的红色。 三、实验器材 1、菌种:苏云金杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌斜面菌种。 2、显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、接种环、吸水纸、盖玻片、试管、水浴锅。 3、草酸铵结晶紫染色液、路哥氏碘液、95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水、双料瓶,香柏油和二甲苯,、5%孔雀绿溶液。 四、方法步骤 ,一,单染色步骤: 1、涂片:用1%盐酸清洁玻片后～在玻片中央滴上一小滴蒸馏水～再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中～并充分混匀涂成薄膜。 2、干燥:将涂片臵火焰高处微热烘干或自然干燥。 3、固定:涂面朝上～通过微火2-3次。 4、染色:待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上～覆盖涂面染色1-2分钟。 5、水洗:倾去染色液～用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的水变无色为止,注:勿冲去菌体,。 6、干燥:自然干燥～或用吸水纸吸干。 7、镜检:油镜观察并绘图。 5 ,二,革兰氏染色步骤 1、涂片:取清洁玻片一块～在玻片两端1/4处下面用记号笔分别标明S和E,见图 示,～并滴一滴蒸馏水～分别将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌涂布在相应的区域内。 2、干燥与固定:方法同,一,中2～3步骤。 图示 3、染色: 结晶紫染色1-2分钟--水洗--碘液媒染1-2分钟--水洗--酒精脱色15-20秒--水洗 --番红复染色2-3分钟--水洗--干燥--镜检记录。 ,三,细菌的芽孢染色 1、制备菌液:加1-2滴蒸馏水于试管中～从斜面挑取2-3环的菌苔于试管中并充 分打匀～制成浓稠的菌液。 2、加染色液:加5%孔雀绿2-3滴于试管中用接种环搅拌～使其充分混合。 3、加热:将此试管浸于沸水浴中～加热15-20分钟。 4、涂片:从试管底部挑菌液于洁净的玻片上～涂成薄膜～晾干。 5、固定:将涂片通过微火3次。 6、脱色:水洗～直到流出的水中无绿色为止。 7、复染:加番红染色2-3分钟后～倾去染色液～不用水洗～直接用吸水纸吸去余 水～于酒精灯火焰上烘干。 8、镜检:用油镜观察绘图。 五、结果与思考 1、绘图记录观察结果 6 7 2、在制作涂片中～为什么要进行固定这一步, 3、革兰氏染色中哪一步关键～为什么, 4、为什么芽孢要采用复染色法,,芽孢和菌体分别染成什么颜色, 8 实验三 培养基的配制和灭菌 一、实验目的 1.了解配制培养基的原理～并掌握配制培养基的一般方法和步骤。 2.了解加压蒸汽灭菌的原理～并掌握其具体操作方法。 二、实验原理 培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型～对营养物质的要求也各不相同～加之实验和研究的目的不同～所以培养基的种类很多～使用的原料也各有差异～但从营养角度分析～培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外～培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。 琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质～是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98，100?下融化～于45?以下凝固。但多次反复融化～其凝固性降低。 任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌～以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。 三、实验器材 1.药品及试剂: 可溶性淀粉KNO3目K2HPO4?3H2OMgSO4?7H2OFeSO4?7H2O1mol/LNaOH琼脂 2.仪器及其它 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管,1ml,、玻璃珠。 四、方法步骤 (一,培养基的制备与分装 9 1.称量按培养基配方比例依次准确地称取药品。可溶性淀粉先用少量热水溶化后再 加入其他成份～补足所需水分～混匀后加入琼脂。 2.熔化在沸水浴锅中加热熔化。 3.调pH用1NNaOH调pH至7.4-7.6。 4.过滤趁热用多层纱布过滤,本实验勿需过滤, 5.分装将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上～装试管时～装量不超过试管的1/4～ 注意管口不要沾上培养基。 6.加棉塞然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸～贴上 标签～注明培养基名称、日期、组别。 ,二,无菌水的制备 7.用量筒量取45ml水于带玻璃珠三角瓶中～塞上棉塞～包扎牛皮纸。 8.用5ml吸管取4.5ml水于试管中～塞上棉塞～包扎牛皮纸。 ,三,器皿的准备 9.培养皿的包装每6套一包～用旧报纸包扎,或放在特制铁皮圆筒里～加盖扣严,。 10.吸管的包装首先在吸管的上端塞上一小段棉花～用长纸条包扎、打结。 11.玻璃涂布棒的包装方法同吸管的包装。 ,四,培养基、无菌水、器皿的灭菌 12.将培养基、无菌水放入高压蒸汽灭菌锅内～湿热灭菌。 13.灭菌完毕～将试管培养基搁成斜面。 14.器皿放入干热灭菌箱内～加热灭菌。 五、思考题 1.培养基配好后～为什么必须立即灭菌,如何检查灭菌后的培养菌是无菌的, 2.加压蒸汽灭菌的原理是什么,是否只要压力表上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温度,为什么, 3.干热灭菌应该注意哪些事项, 4.管口、瓶口为什么要用棉塞,能否用木塞或棉皮塞代替,为什么, 10 实验四 霉菌和放线菌的形态观察 一、目的要求 1、学习掌握水浸片观察霉菌形态特征。 2、学习掌握插片观察放线菌形态特征。 二、实验原理 放线菌一般由分枝状菌丝组成～它的菌丝可分为基内菌丝(营养菌丝)、气生菌丝或有孢子丝三种。放线菌生长到一定阶段～大部分气生菌丝分化成孢子丝～通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。孢子丝形态多样～有直、波曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。 放线菌的菌落早期绒状同细菌菌落月牙状相似～后期形成孢子菌落呈粉状、干燥～有各种颜色呈同心圆放射状。 三、实验器材 1、菌种:梨头霉、根霉、青霉、曲霉、平菇、放线菌等平板菌种。 2、载玻片、盖玻片、显微镜、解剖针、蒸馏水。 四、实验步骤 ,一,梨头霉属接合孢子的形态观察 1、清洁载玻片～并在中央加一滴蒸馏水。 2、用解剖针在培养皿中挑取,+,、,-,菌丝交接处的菌丝放入水滴中。 3、两手各持解剖针～将菌丝仔细分开～不使其缠绕成团。 4、盖上盖玻片～注意不要产生气泡。 5、先用低倍镜～后用高倍镜进行观察。 11 ,二,根霉的形态观察 挑菌丝少许制作水浸片～然后用低倍镜观察根霉的形态～并注意其假根、孢子囊、 孢子的特征、 ,三,青霉分生孢子梗的观察 用接种针从培养皿中连培养基一起挑一小块放于载玻片中央的小滴蒸馏水中～盖上盖玻片～并轻轻地挤压盖玻片使之分散。先用低倍镜～后用高倍镜观察青霉的形态～并注意其扫帚状分生孢子梗的特征。 ,四,曲霉的形态观察 制作曲霉水浸片[方法同,三,]～然后用低倍镜、高倍镜观察曲霉顶部～瓶状体及其细胞的形态。 ,五,平菇的锁状联合现象观察 挑菌丝少许制作水浸片[方法同,一,]。然后用低倍镜、高倍镜观察平菇的锁状联合现象。 ,六,放线菌的形态观察 取下经过插片法培养的盖玻片～臵于载玻片上。先用低倍镜～后用高倍镜观察放线菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝的形态。 五、结果与思考 1、绘出所观察到的梨头霉的接合孢子～根霉、青霉、曲霉、放线菌的形态及平菇锁状联合现象。 12 2、为什么观察霉菌时～用水浸片法制作～而观察细菌时却要用涂片法制作, 3、说明放线菌的基内菌丝和气生菌丝各有何特点, 13 实验五 微生物细胞数量的测定 一、目的要求 1、明确血球计数板计数的原理 2、掌握测定酵母细胞总数、出芽率和死亡率的技术 二、实验原理 镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液～如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫〃霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同～只是细菌计数板较薄～可以使用油镜观察。而血球计数板较厚～不能使用油镜～故细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚载玻片～载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽～其中间又被一短横槽分隔成两半～每个半边上面各有一个方格网。每个方格网共分9大格～其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种:一种是大方格分为16个中方格～而每个中方格又分成25个小方格,另一种是一个大方格分成25个中方格～而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造～它们都有一个共同特点～即每个大方格都由400个小方格组成。 每个大方格边长为1mm～则每一大方格的面积为1mm2～每个小方格的面积为1,400mm2～盖上盖玻片后～盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm～所以每个计数室(大 33方格)的体积为0.1mm～每个小方格的体积为l,4000mm。使用血球计数板直接计数时～先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量～再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。 14 血球计数扳的构造 血球计数板 计数网的分 区和分格 三、实验器材 啤酒酵母菌悬液～显微镜～血球计数板～载玻片～电吹风～盖玻片～接种环～0.1%吕氏美蓝染色液。 四、方法步骤 1、菌悬液的制备 为便于计数～对样品进行适当稀释～稀释程度以每小格内含5-10个酵母宜～可采用10倍系列稀释法。 2、镜检计数室 在加样前～先对计数板的计数室进行镜检。如有污物～则需清洗～用点吹风吹干后才能进行计数。 3、加样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片～再用无菌的毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室～用吸水纸吸去多余菌液。样品要均匀充满计数室～不可有气泡。 15 4、显微镜计数 加样后静止5min～然后将血球计数板臵于显微镜载物台上～先用低倍物镜寻找计数室的位臵～然后换成高倍物镜,40倍,进行计数。显微镜视野中的光线要暗一些～否则～不容易看清计数室的方格线。计数时～对位于线上的酵母菌～可采取只计数两条边的办法～即遵循查上不查下～查左不查右的原则。当酵母菌芽体达到母细胞大小1/2时～即可计作两个细胞。 1ml 5、出芽率的测定 按前法～测定出酵母菌芽体数,小于母细胞1/2的,～计算出单位体积内测得酵母菌细胞的芽体占总数的百分率～即为酵母菌的出芽率。 6、酵母死亡率的测定 滴一滴0.1%吕氏美蓝液于载玻片中央～再用接种环取酵母菌液少许～与染液混匀～染色2–3min～加盖玻片～立即镜检～计数在一个视野中～以变蓝,死,和未变蓝,活,的细胞数。依法再计数2-3个视野中的细胞数。 死细胞数 死亡率= ×100% 细胞总数 死亡率是单位体积内死亡的细胞数占总细胞数的百分率。 7、计数完毕～将计数板在水龙头下冲洗干净～切勿用硬物洗刷～洗完后自行晾干或电吹风吹干。 五、结果与思考 1、将结果添入下表 次数 1 2 平均值 中方格序号 细胞数 16 芽体数 细胞数/ml 芽体数/ml 出芽率 2、 根据你的实验体会～说明用血球计数板进行微生物计数时～其误差来自哪些方面,如何避免,〃 17 实验六 药物敏感试验 一、目的要求 ,1,熟悉和掌握圆纸片扩散法检测细菌对抗菌药物敏感性的操作程序和结果判 断方法。 ,2,了解药敏试验在实际生产中的重要意义 二、实验原理 将含有定量抗菌药物的纸片,药敏纸片,贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部位。药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散～形成了随着离纸片距离加大～琼脂中的药物浓度逐渐减少的梯度浓度。其纸片周围一定区域琼脂内的药物浓度高于抑制待检菌所需浓度时～则该区域内细胞不能生长～形成透明抑制圈。抑菌圈的大小可以反映待检对测定药物的敏感程度～并与该药对待检菌的最低抑菌浓度,MIC,呈负相关～即抑菌圈愈大～MIC愈小。 三、实验器材 1(菌种 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌或临床分离的菌珠。 2(培养基 MH,Mueller-Hintion,琼脂。 3(试剂 无菌生理盐水～0.5麦氏标准比浊管,McFarland standard～相当于1.5×108CFU/ml,～抗菌药物纸片:选用直径6.35mm吸水量20μl的专用药敏纸片～包括青霉素、氨苄西林、土霉素、链霉素等。 4(其他 无菌棉拭子、镊子、毫米尺、接种环。 四、方法步骤 1(菌液制备 18 ,1,对数生长法:从琼脂平板上选取至少3~5个形态特征一致的菌落～用接种环转移至含4~5ml的肉汤培养管,如胰酶消化大豆肉汤,中～35?孵育2~6h。用无菌盐水或肉汤调整菌液浊度相当于0.5麦氏标准。 ,2,直接菌落法:从孵育18-24h的非选择性培养基,如血琼脂,平板上～挑取单个菌落～直接用肉汤或无菌盐水制成0.5麦氏标准浊度的悬液。 2(接种 细菌悬液制备后15min内接种至MH琼脂平板。用无菌棉拭醮取菌悬液～在管内壁液面上方旋转紧压～将多余菌液挤去～最后沿平板内缘涂抹一周。 3(贴药敏纸片 涂布后的平板在室温下干燥3~5min～用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面并轻压～使纸片与琼脂表面完成接触。各纸片中心相距应大于24mm～纸片贴上后就不能再移动位臵。 4(孵育 将平板倒臵放入35?孵箱,苛养菌敏平板应放臵于5%~10%CO2环境中,～16~18h读取结果～葡萄球菌和肠球菌必须孵育24h以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。 【结果判断】 抑菌圈的直径,包含纸片的直径,～以毫米数,取整数,。根据CLSI判定标准测量抑菌圈直径大小可以判断细菌对该抗生素是敏感、中介还是耐药～如下图。 敏感,S,:表示常规剂量的测定药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌。 19 中介,I,:不是敏感性的度量～而是一个“缓冲区”～用以防止因微小的技术因 素失控导致的结果偏差～因而其临床意义是不确定的～故不应作临床报告。 耐药,R,:表示常规剂量的测定药物在体内达到有效浓度时不能抑制待测菌生长。 五、结果与思考题 1、记录各菌对不同药物的敏感程度 2、思考题 ,1,圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项, ,2,试述药敏试验的意义 20 实验七 糖发酵试验 一、目的要求 了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。 二、基本原理 糖发酵试验是最常用的生化反应～在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源～但是它们在分解糖的能力上有很大的差异～有些细菌能分解某种糖并产酸,如乳酸、醋酸、丙酸等,和气体,如氢、甲烷、二氧化碳等,,有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气,伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气～不能分解乳糖,枯草芽孢杆菌分解葡萄糖产酸产气～不能分解乳糖。 酸的产生可利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5(2,黄色,-6(8,紫色,]～当发酵产酸时～可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒臵的德汉氏小管中有无气泡来证明。 三、实验器材 大肠杆菌～枯草芽孢杆菌斜面各1支,盛有葡萄糖发酵培养基的试管和乳糖发酵培养基的试管各3支,内装有倒臵的德汉氏小管,～试管架～接种环等。 四、操作步骤 1、编号 用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。 2、接种 21 取盛有葡萄糖发酵培养基的试管3支～按编号1支接种大肠杆菌～另1支接种枯草芽孢杆菌～第3支不接种～作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支～同样1支接种大肠杆菌～1支接种枯草芽孢杆菌～第3支不接种～作为对照。 3(将上述已接种的葡萄糖和乳糖发酵试管和对照管臵37?温室中培养24小时。 4(观察结果。 五、结果与思考题 1、结果 将实验结果填入下表。“?+”表示产酸产气,“+”表示产酸不产气,“-”表示不产酸不产气。 2、思考题 假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖～发酵试验应该出现什么结果, 22 实验八 牛乳中细菌的检查 一、实验目的要求 1(了解牛乳的细菌学检查方法——显微镜直接计数法和标准平板计数法。 2(学习牛乳的巴斯德消毒法。 二、实验原理 从健康母牛体内刚挤出的牛乳～含有少量的正常起始微生物。但将牛乳装入未消毒的器具和在分装、运输过程中～会被很多其他微生物甚至致病菌污染～而且牛乳含有丰富的营养物质,碳水化合物、蛋白质、脂肪、无机盐和维生素等,～在其中的微生物～会很快生长繁殖～因此～一份牛乳样品的细菌含量可反映母牛的健康状况和牛乳生产与保藏的条件。显微镜直接计数法适用于含有大量细菌的牛乳～生牛乳可用此法检查。如果显微镜下观察～每个视野只有1—3个细菌左右～此牛乳即为上等牛乳,如果牛乳中有很多长链链球菌和白细胞～通常是来自患乳房炎的母牛,若一个视野中有很多不同的细菌～则往往说明是使用了脏器具保存的牛乳。由于此法不够敏感～一般不作为消毒牛乳的卫生检查。 标准平板计数法是广泛用于牛乳微生物计数的常规方法～此法比较敏感～牛乳中含少量细菌时～能得出比较正确的结果。我国消毒牛乳的卫生标准是用标准平板计数法检查～每毫 升细菌总数,30000。 三、实验器材 生牛乳10ml～灭菌水～肉膏蛋白胨琼脂, 灭菌培养皿～1ml与10ml灭菌吸管～灭菌试管～10μl微量吸液器与吸嘴各一个～载玻片～美蓝染液,Levowitz-Weber染料～配法见附录I,缶, 显微镜～水浴锅～试管架～吸水纸等。 四、操作步骤 1(显微镜直接计数,1,在白纸上画出1cm2的方块～然后将玻片放在纸上。 ,2,用10μl的微量吸液器吸取混匀了的生牛乳样品～放在玻片 1cm2区域的中央。 ,3,用接种针将牛乳涂匀～并涂满1cm2的范围。 ,4,使涂片于空气中慢慢干燥。将铁丝试管架放在沸水浴中～然后臵已干燥的涂片于试管架上～用蒸汽热固定5分钟～待干。 23 ,5,浸于美蓝染液缶内染色2分钟。 ,6,取出玻片～用吸水纸吸去多余的染料～晾干。 ,7,再用水缓缓冲洗～晾干。 ,8,油镜下观察细菌数～共数30—50个视野。 ,9,计算 每毫升的细菌总数=平均每视野的细菌数×500000 因为: 一般油镜的视野直径为 0(16mm～一个视野的面积=0(082×3(1416=0(02mm2～ 化成cm2～视野面积=0(02×0(01=0(0002cm2～1cm2的视野数=1(0?0(0002=5000～ 又因每1cm2的牛乳量为0(01ml～即1/100ml～则每一视野的牛乳量=1/100×1/5 000=1/500000ml 所以～一个视野中的1个细菌就代表1ml牛乳中有 500000个细菌。因此1ml牛乳中的细菌数=一个视野的细菌数×500000= 50个视野的细菌数?50×500000 2(巴斯德法消毒牛乳(1)将水浴锅的温度调节到63?。 (2)将生牛乳样品用力摇匀～使微生物能均匀分布。 (3)用灭菌的10ml吸管吸取5ml生牛乳样品放入灭菌试管内～然后将试管放入调好温度的水浴锅中,水面要超过牛乳的表面,。 (4)保持30分钟～并不时摇动。 (5)一到30分钟～立刻取出试管～用流动的自来水冲试管外壁～使其中的牛乳迅速冷却。 3(标准平板计数法 (1)将巴斯德消毒牛乳样品充分摇匀～按实验五十九中池水等的稀释法进行稀释～使稀释度为10-2、10-3和10-4 (2)用1ml灭菌吸管从最大稀释度开始各取1ml注入已标明样品和稀释度的空白培养皿内。 (3)各培养皿倾注约15ml已溶化并冷却至45?左右的肉膏蛋白胨琼脂～立即放桌上摇匀。 (4)凝固后倒臵于37?下～培养24小时。 (5)选择长有30—300个菌落的平板计数～并计算1ml牛乳中的细菌总数。 -5(6)生牛乳样品的检查同上法～但稀释度为10-3、10-4和10。 24 五、结果与思考题 1(结果 (1)显微镜直接计数法 平均每视野的菌数是多少, 每毫升生牛乳的细菌总数是多少, (2)标准平板计数法 2、思考题 ,1,你所检查的巴斯德消毒牛乳～细菌总数是否合乎卫生标准, ,2,你所检查的生牛乳在显微镜视野下观察到的情况～对照图??-1是属于哪一种情 况, 。 25 实验九 校园环境空气微生物的调查 一、实验目的 通过本实验的学习～使学生掌握微生物的分离与纯化的原理与方法～熟练掌握微生物的染色方法以及微生物的计数等基本技能～为今后微生物的遗传、生理以及分子生物学等学习打下基础。 二、实验原理 空气中微生物的主要来源于土壤、水体表面、动植物、人体及生产活动、污水污物处理等～其组成浓度不稳定～种类多样～有细菌、真菌、病毒、噬菌体等。空气微生物是大气污染物之一。空气微生物往往吸附在悬浮颗粒物上～随风飘荡～可导致人类和动植物某些疾病的发生与传播～且常与环境的其他污染物协同作用～致使环境恶化～空气质量降低。空气微生物的浓度是评价空气质量的重要指标之一。 近年来～室内空气污染问题已经引起人们的极大关注～其中微生物污染的监测也逐步受到重视。随着我校办学规模不断加大～校园已是人群比较密集的场所。为了解我校室内空气微生物污染现状～对学生宿舍、食堂、教学楼、图书馆等场所进行了空气细菌总数监测与分析～对影响室内空气中微生物污染的原因进行分析～提出防治～这对于加强卫生监督、预防和控制传染病的传播以及校园文明建设都将起着积极作用。 校园是学生集中生活学习的区域～采用微生物学方法～检测校园空气微生物的时空分布～可进一步了解校园空气污染现状～对于防止呼吸道疾病的传播～保护学生身体健康具有重要的现实意义。 三、实验器材 ,一,主要仪器 高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、电子分析天平、干燥箱、显微镜、超净工作台 ,二,主要试剂 26 牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、可溶性淀粉、KNO3、KH2P04、K2HP04.3H20、MgS04.7H20、FeS04. 7H20、K2HP04、蔗糖、葡萄糖、链霉素、孟加拉红溶液、碱性美兰染液、革兰氏染色液、香柏油、二甲苯等 四、方法步骤 1、 培养基的配制,牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、查氏培养基, 2、 选定采样点,教学楼、宿舍、图书馆、食堂、体育馆、操场等,建议每个采样点至 少有2个组进行采样～即每个采样点有2组以上重复, 3、 不同采样时间进行采样,上午、中午、下午各1次,～每次采样时间分5分钟、10 分钟、30分钟,平皿暴露时间,采样。 4、 讲采样的平皿进行培养 5、 菌落计数 6、 菌落鉴别 7、 作出校园空气微生物分布图,数量、种类, 五、思考题 1、 影响校园环境空气中微生物分布的因素有哪些, 2、如何进一步改进本实验, 27 实验十 病毒的鸡胚培养 一、 实验目的 1、了解动物病毒鸡胚培养的意义和用途 2、掌握鸡胚尿囊腔接种的方法与尿囊液收获的方法 二、 实验原理 鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法～此方法可用以进行多种病毒的分离、培养～毒力的滴定～中和试验以及抗原和疫苗的制备等。 鸡胚培养的技术比组织培养容易成功～也比接种动物的动物来源容易～无饲养管理及隔离等的特殊要求～且鸡胚一般无病毒隐性感染～同时它的敏感范围很广～多种病毒均能适应～因此～是常用的一种培养动物病毒的方法。 各种病毒接种鸡胚均有其最适宜的途径～故应注意选择。本实验用鸡新城疫病毒,Newcastle-disease virus,接种鸡胚。鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内～生长后～鸡胚全身皮肤出现出血点～以脑后最显著。 三、 实验器材 新城疫病毒液,白壳受精卵,自产出后不超过10天～以5天以内的卵为最好,, 孵卵器～检卵灯～齿钻～磨壳器～钢针～蛋座木架～注射器～2(5%碘酒～70%酒精～镊子～剪刀～封蜡,固体石蜡加 1/4凡士林～溶化,～灭菌培养皿～灭菌盖玻片等。 四、 实验步骤 1( 准备蛋胚 孵育前的鸡卵先用清水以布洗净～再用干布擦干～放入孵卵器内进行孵育,37?～相对湿度是45—60%,～孵育三日后～鸡卵每日翻动1—2次。孵至第4日～用检卵灯观察鸡胚发育情况～未受精卵～只见模糊的卵黄黑影～不见鸡胚的形迹～这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影～比较大一些的可以看见胚动～随后每日观察一次～将胚动呆滞或 28 没有运动的、血管昏暗模糊者～即可能是已死或将死的鸡胚～要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前～具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。 2(接种 用孵育10—12天的蛋胚～因这时尿囊液积存得最多。 (a)将蛋胚在检卵灯上照视～用铅笔画出气室与胚胎位臵～并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。 (b)将蛋胚竖放在蛋座木架上～钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳～并用钢针在记号处钻一小孔。 (c)用带18mm长针头的1ml注射器吸取鸡新城疫病毒液～针头刺入孔内～经绒毛尿囊膜入尿囊腔～注入0(1ml病毒液。 (d)用石蜡封孔后于37?孵卵器孵育72小时。 3(收获 (a)将蛋胚放在冰箱内冷冻半日或一夜～使血管收缩～以便得到无胎血的纯尿囊液。 (b)用碘酒消毒气室处的卵壳～并用灭菌剪刀除去气室的卵壳。切开壳膜及其下面的绒毛尿囊膜～翻开到卵壳边上。 (c)将鸡卵倾向一侧～用灭菌吸管吸出尿囊液。一个蛋胚约可收获6ml左右尿囊液。若操作时损伤了血管～则病毒会吸附在红细胞上～尿囊液成为无用。收获的尿囊液经无菌试验后可在4?以下的温度中保存。 (d)观察鸡胚～看有无典型的症状。 五、 结果与思考题 1、结果 1,观察鸡胚病变情况 , ,2,收获鸡胚尿囊液 2、思考题 ,1,本实验所用的病毒～除了能在鸡胚中进行培养外～还能用哪些方法进行培养,试比较他们的优缺点。 ,2,接病毒后的鸡胚常出现非特异性的意外死亡和病毒感染引起的死亡～如何判定死亡原因, 29 实验十一 病毒的血凝及血凝抑制试验 一、实验目的 掌握HA和HI的基本操作技术,了解其实用价值。 二、实验原理 某些病毒～如正粘病毒、副粘病毒～在病毒表现具有血凝素～可以凝集某些红细胞～这一特性可被相应抗体所抑制。血凝试验一般用于分离具有血凝特性病毒的常规检测方法和进行血凝抑制试验时血凝单位的确定,血凝抑制试验有两方面的用处～一是应用标准病毒液测定血清中的相应抗体～二是应用特异性抗体鉴定新分离的血凝性病毒。 三、实验器材 新城疫病毒液0.1ml、1%鸡红细胞50ml、生理盐水50ml、阳性血清0.5ml、96孔V形微量反应板～50微升定量液移管,滴头。 四、方法步骤 1、血球凝集实验(HA)以新城疫病毒为例,操作过程如下 ,1,在96孔V形微量反应板上进行,自左至右各孔加50ul生理盐水。 ,2,于左侧第1孔加50uL病毒原液或收获液,混合均匀后,吸50ul至第2孔,混合均匀后至第3孔,依次倍比稀释,至第11孔,吸弃50ul。稀释后病毒稀释度为第1孔1:2,第2孔1:4,第3孔1:8………..最后一孔为对照。 ,3,自左向右依次向各孔加1%鸡红细胞50ul～臵微型混合器上振荡1分钟或以固定转圈震荡反应板,使血球与病毒充分混合,在37摄氏度温箱中作用15----30分钟,待对照孔红细胞已沉淀可观察结果。 ,4,判断结果:以100%凝集的病毒最大稀释孔为该病毒血凝价,既一个凝集单位,不凝集者血细胞沉于孔低成点状。 2、血细胞凝集抑制反应,HI, ,1,根据HA实验结果,确定病毒的血凝价,配成4个凝血单位病毒溶液 ,2,在96孔V形微量板上进行用固定病毒稀释血清法,自第1孔至第10孔各加50ul生理盐水,11和12孔分别为4单位病毒液和抗新城液病毒血清对照. 30 ,3,第1孔加新城液阳性血清50UL～混合均匀～吸50ul至第2孔,依次倍比稀释至第10孔,吸弃50ul,如此稀释后血清浓度为第1孔1:2,第2孔1:4,第3孔1:8……。 ,4,自第1孔至11孔各加50ul血清,混合均匀,臵37摄氏度温箱作用15分钟. ,5,自第1孔至12孔加1%鸡红细胞50ul,混合均匀后臵37摄氏度作用15-30min～待4单位病毒已凝集红细胞可观察结果。 ,6,判断结果:以100%抑制凝集的血清最大稀释度为该血清的HI滴度,即血清效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者,该病毒为新城疫病毒。 五、结果与思考 1、病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原体反应?为什么? 2、HI实验是不是特异的抗原抗体反应?为什么? 实验十二 菌种保藏 一、实验目的 学习和掌握菌种保藏的基本原理,比较几种不同的包藏方法 二、基本原理 在发酵工业中～具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易～如何利用优良的微生物菌种保藏技术～使菌种经长期保藏后不但存活健在～而且保证高产突变株不改变表型和基因型～特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力～即很少发生突变～这对于菌种极为重要。 微生物菌种保藏技术很多～但原理基本一致～即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法～挑选优良纯种～最好是它们的休眠体～使微生物生长在代谢不活泼～生长受抑制的环境中。具体常用的方法有:蒸馏水悬浮或斜面传代保藏,干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏,超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。 现有的保藏方法主要有: 1蒸馏水悬浮法 这是一种最简单的菌种保藏方法～只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中～将容器封好口～于10?保藏即可达到目的。好气性细菌和酵母等可用此法保存。 31 2斜面传代保藏 斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养～然后在低温条件下保存。它可用于实验室中各类微生物的保藏～此法简单易行～且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。因此要求最好在基本培养基上传代～目的是能淘汰突变株～同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5?保藏～以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏～一般保存时间为3-6个月。如放线菌于4-6?保存～每3个月移接一次,酵母菌于4-6?保存～每4-6个月移接一次,霉菌于4-6?保存～每6个月移接一次。 3矿物油中浸没保藏 此方法简便有效～可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏～操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长～然后注入经160?干热灭菌1-2h或湿热灭菌后120?烘去水分的矿物油～矿物油的用量以高出培养物1cm为宜～并以橡皮塞代替棉塞封口～这样可使菌种保藏时间延长至1-2年。以液体石蜡作为保藏方法时～应对需保藏的菌株预先作试验～因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源～还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏～为了预防不测～一般保藏菌株2-3年也应做一次存活试验。 4干燥-载体保藏 此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。是将菌种接种于适当的载体上～如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等～以保藏菌种。以沙土保藏用得较多～制备方法为:将河砂经24目过筛后用10%-20%盐酸浸泡3-4h～以除去其中所含的有机物～用水漂洗至中性～烘干～然后装入高度约1cm的河沙于小试管中～121?间歇灭菌3次。用无菌吸管将孢子悬液滴入砂粒小管中～经真空干燥8h～于常温或低温下保藏均可～保存期为1-10年。土壤法以土壤代替砂粒～不需酸洗～经风干、粉碎～然后同法过筛、灭菌即可。一般细菌芽孢常用砂管保藏～霉菌的孢子多用麸皮管保藏。 5冷冻保藏 冷冻保藏是指将菌种于-20?以下的温度保藏～冷冻保藏为微生物菌种保藏非常有效的方法。通过冷冻～使微生物代谢活动停止。一般而言～冷冻温度愈低～效果愈好。为了保藏的结果更加令人满意～通常在培养物中加入一定的冷冻保护剂,同时还要认真掌握好冷冻速 32 度和解冻速度。冷冻保藏的缺点是培养物运输较困难。 普通冷冻保藏技术(-20?):将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上～待生长适度后～将试管或瓶口用橡胶塞严格封好～于冰箱的冷藏室中贮藏～或于温度范围在-5-20?的普通冰箱中保存。或者将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分别接到试管或指管内～严格密封后～同上臵于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力1-2年。应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。这一方法虽简便易行～但不适宜多数微生物的长期保藏。 超低温冷冻保藏技术:要求长期保藏的微生物菌种～一般都应在-60?以下的超低温冷藏柜中进行保藏。超低温冷冻保藏的一般方法是:先离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞～再用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞～然后加入等体积的20,甘油或10,二甲亚砜冷冻保护剂～混匀后分装入冷冻指管或安瓿中～于-70?超低温冰箱中保藏。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2?/min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。 液氮冷冻保藏技术:近年来～大量有特殊意义和特征的高等动、植物细胞能够在液氮中长期保藏～并发现在液氮中保藏的菌种的存活率远比其他保藏方法高且回复突变的发生率极低。液氮保藏巳成为工业微生物菌种保藏的最好方法。具体方法是:把细胞悬浮于一定的分散剂中或是把在琼脂培养基上培养好的菌种直接进行液体冷冻～然后移至液氮(-196?)或其蒸汽相中(-l56?)保藏。进行液氮冷冻保藏时应严格控制致冷速度。液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤是先制备冷冻保藏菌种的细胞悬液～分装0.5-1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶～玻璃安瓿用酒精喷灯封口。然后以1.2?,min的致冷速度降温～直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30?)。待细胞冻结后～将致冷速度降为1?,min～直到温度达到-50?～将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196?)或气相(-156?)中保存。如果无控速冷冻机～则一般可用如下方法代替:将安瓿或液氮瓶臵于-70?冰箱中冷冻4h～然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷冻保藏中～最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油～最终使用浓度一般为甘油10,、二甲亚砜5,。所使用的甘油一般用高压蒸汽灭菌～而二甲亚砜最好为过滤灭菌。 6真空冻干保藏 真空冷冻干燥的基本方法是先将菌种培养到最大稳定期后～一般培养放线菌和丝状真菌约需7-10天～培养细菌约需24-28小时～培养酵母约需3天。然后混悬于含有保护剂的溶液中～保护剂常选用脱脂乳、蔗糖、动物血清、谷氨酸钠等～菌液浓度为109-1019个/ml～ 33 取0.1-0.2ml菌悬液臵于安瓿管中冷冻～再于减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华至1%-5%～使培养物干燥。最后将管口熔封～保存在常温下或冰箱中。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一～大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏～便于运输。但操作过程复杂～并要求一定的设备条件。 三、实验器材 1、菌种 大肠杆菌～酿酒酵母～假单胞菌～灰色链霉菌～产黄霉菌 2、培养基 肉汤培养基～马铃薯培养基～麦芽汁酵母膏培养基 3、溶液或试剂 液体石蜡～甘油～五氧化二磷～河沙～瘦黄土或红土～95%乙醇～10%盐酸～无水氯化钠～食盐～干冰 4、仪器和其他用具 无菌吸管～无菌滴管～无菌培养皿～安瓿管～冻干管～40目与100目筛子～油纸～滤纸条～干燥器～真空泵～真空压力表～喷灯～L形五通管～冰箱～低温冰箱～超低温冰箱和液氮管。 四、实验步骤 ,一,斜面法 将接种后的培养基放入培养箱中～在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30，37?～真菌培养温度一般为25，28?。 培养好的菌种于4，6?保存～根据要求每3，6个月移植一次。某些菌种～如芽裂酵母～阿舒假囊酵母～棉病囊霉等～须1，3个月移植一次。 保藏湿度用相对湿度表示～通常为50%，70%。 斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照～防止因意外和污染造成损失。 ,二,液体石蜡保藏法 亦称矿物油保藏法,定期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上～最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡～使其覆盖整个斜面～再直立放臵于低温,4，6?,干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。 34 操作步骤如下: 1液体石蜡的准备 选用优质化学纯液体石蜡～将液体石蜡分装加塞～用牛皮纸包好～采用以下两种方式进行灭菌: 121?湿热灭菌30min～臵40?恒温箱中蒸发水分～经无菌检查后备用。 160?干热灭菌2个小时～冷却后～经无菌检查后备用。 2斜面培养物的制备 参照斜面法。 3灌注石蜡 将无菌的液体石蜡在无菌条件下注入培养好的新鲜斜面培养物上～液面高出斜面顶部1cm左右～使菌体与空气隔绝。 4保藏 注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态臵低温,4，6?,干燥处保藏～保藏时间2，10年。保藏期间应定期检查～如培养基露出液面～应及时补充无菌的液体石蜡。 5恢复培养 恢复培养时～挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上～生长繁殖后～再重新转接一次。 ,三,沙土管保藏法 是载体保藏法的一种。将培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液,注入灭菌的沙土管中混合均匀～或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的沙土管中～使微生物细胞或孢子吸附在沙土载体上～将管中水分抽干后熔封管口或臵干燥器中于4，6?或室温进行保存的一种菌种保藏方法。 操作步骤如下: 1沙土管制备 将河沙用60目过筛～弃去大颗粒及杂质～再用80目过筛～去掉细沙。用吸铁石吸去铁质～放入容器中用10%盐酸浸泡～如河沙中有机物较多可用20%盐酸浸泡。24小时后倒去盐酸～用水洗泡数次至中性～将沙子烘干或晒干。 另取地面下40，60cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土～研碎～100目过筛,水洗至中性～烘干。 将处理后的沙、土按质量比2?1混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中～高度为1cm左右～塞好棉塞～121?湿热灭菌30min。 35 随机抽取灭菌后的砂土管若干支～无菌条件下取少许砂土至营养肉汁培养基中～30?培养24小时～检查无微生物生长后方可使用。 2斜面培养物的制备 参照定期移植法。 3制备菌悬液 向培养好的斜面培养物中注入3，5mL无菌水～洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液～均匀滴入沙土管中～每管0.2，0.5mL。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。 4干燥 真空抽去沙土管中水分。 5保藏 将沙土管用火焰熔封后存放于低温(4，6?)干燥处保藏～每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好～臵干燥器内保存。 保藏时间2，10年。 6恢复培养 无菌条件下打开沙土管～取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上～长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中～增殖培养后再转接斜面。 ,四,冷冻干燥法 将微生物冷冻～在减压下利用升华作用除去水分～使细胞的生理活动趋于停止～从而长期维持存活状态。 操作步骤如下: 好氧菌冷冻干燥管的制备 1安瓿管准备 安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时～先用2%盐酸浸泡过夜～自来水冲洗干净后～用蒸馏水浸泡至pH中性～干燥后、贴上标签～标上菌号及时间～加入脱脂棉塞后～121?下高压灭菌15-20分钟～备用。 2保护剂的选择和准备 保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时～应注意其浓度及pH值～以及灭菌方法。如血清～可用过滤灭菌,牛奶要先脱脂～用离心方法去除上层油脂～一般在100?间歇煮沸2-3次～每次10-30分钟～备用。 36 3冻干样品的准备 在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期～进行纯度检查后与保护剂混合均匀～分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜,以大肠杆菌为例～为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升～只需10毫升琼脂斜面两支,。采用较长的毛细滴管～直接滴入安瓿管底部～注意不要溅污上部管壁～每管分装量约0.1-0.2毫升～若是球形安瓿管～装量为半个球部。若是液体培养的微生物～应离心去除培养基～然后将培养物与保护剂混匀～再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短～最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。 4预冻 一般预冻2小时以上～温度达到-20?到-35?左右。 5冷冻干燥 采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。将冷冻后的样品安瓿管臵于冷冻干燥机的干燥箱内～开始冷冻干燥～时间一般为8-20小时。 6真空封口及真空检验 将安瓿管颈部用强火焰拉细～然后采用真空泵抽真空～在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。 7保藏 安瓿管应低温避光保藏。 8质量检查 冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查～如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。 ,五,-80?低温冷冻保藏 将菌种保藏在-80?冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。 操作步骤如下: 1安瓿管的准备 安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时～先用2%盐酸浸泡过夜～自来水冲洗干净后～用蒸馏水浸泡至pH中性～干燥后、贴上标签～标上菌号及时间～加入脱脂棉塞后～121?下高压灭菌15-20分钟～备用。 2保护剂的选择和准备 保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时～应注意其浓度及pH值～以及灭菌 37 方法。如血清～可用过滤灭菌,牛奶要先脱脂～用离心方法去除上层油脂～一般在100?间歇煮沸2-3次～每次10-30分钟～备用。 3微生物保藏物的准备 在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期～进行纯度检查后与保护剂混合均匀～分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜,以大肠杆菌为例～为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升～只需10毫升琼脂斜面两支,。采用较长的毛细滴管～直接滴入安瓿管底部～注意不要溅污上部管壁～每管分装量约0.1-0.2毫升～若是球形安瓿管～装量为半个球部。若是液体培养的微生物～应离心去除培养基～然后将培养物与保护剂混匀～再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短～最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。 4冻结保藏 将安瓿管或塑料冻存管臵于-80?冰箱中保藏。 5复苏方法 从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管～应立即放臵38?-40?水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止～约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管～将内容物移至适宜的培养基上进行培养。 ,六,液氮超低温保藏 液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196?的液态氮～或在-150?的氮气中的长期保藏方法～它的原理是利用微生物在-130?以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。 操作步骤如下: 1安瓿管或冻存管的准备 用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管～或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净～121?下高压灭菌15-20分钟～备用。 2保护剂的准备 保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时～应注意其浓度～一般采用10-20%甘油。 3微生物保藏物的准备 微生物不同的生理状态对存活率有影响～一般使用静止期或成熟期培养物。 分装时注意应在无菌条件下操作。 菌种的准备可采用下列几种方法: 38 刮取培养物斜面上的孢子或菌体～与保护剂混匀后加入冻存管内, 接种液体培养基～振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内, 将培养物在平皿培养～形成菌落后～用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块,直径约5-10毫米,～真菌最好取菌落边缘的菌块～与保护剂混匀后加入冻存管内, 在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基～接种菌种～培养2-10天后～加入保护剂～待保藏。 4预冻 预冻时一般冷冻速度控制在以每分钟下降1?为好、使样品冻结到-35?。 目前常用的有三种控温方法: ——程序控温降温法～应用电子计算机程序控制降温装臵～可以稳定连续降温～能很好地控制降温速率。 ——分段降温法:将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷却～或悬挂于冰的气雾中逐渐降温。一般采用二步控温～将安瓿管或塑料小管～先放-20?至-40?冰箱中1-2小时～然后取出放入液氮罐中快速冷冻。这样冷冻速率大约每分钟下降1-1.5?。 ——对耐低温的微生物、可以直接放入气相或液相氮中。 5保藏 将安瓿管或塑料冻存管臵于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-150?～液相中温度为-196?。 6复苏方法 从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管～应立即放臵在38?-40?水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止～一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管～将内容物移至适宜的培养基上进行培养。 五、结果 根据自身实验体会～比较几种菌种保藏方法的利弊。 39 附录 ? 染色液的配制 1、吕氏,Loeffer,碱性美蓝染液 美蓝,methylene blue, 0.6克 95%乙醇 10ml B液:KOH 0.01克 蒸馏水 100ml 分别配制A液和B液～配好后混合即可。 2、齐氏,Ziehl,石炭酸复红染色液 A液:碱性复红,basic fuchsin, 0.3克 95%乙醇 10ml B液:石炭酸 5.0克 蒸馏水 95ml 将碱性复红在研钵中岩磨后～逐渐加入95%乙醇～继续研磨使其溶解～配成A液。 将石炭酸溶解在水中～配成。 混合A液和B液即成。通常可将此混合液稀释5-10倍使用～稀释液易变质失效～一次不宜多配。 3、革兰氏,Gram,染色液 3.1 草酸铵结晶紫染液 A液:结晶紫,crysal violet, 95%乙醇 20ml B液:草酸铵,ammonium oxalate, 0.8克 蒸馏水 80ml 混合A、B二液～静臵48h后使用。 3.2 卢革氏碘液 碘片 1.0克 碘化钾 2.0克 蒸馏水 300ml 40 先将碘化钾溶解在少量水中～再将碘片溶解在碘化钾溶液中～待碘全溶后～加足水即可。 3.3 95%乙醇 3.4 番红复染液 番红,safranine O, 2.5克 95%乙醇 100ml 取上述配制好的番红乙醇溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即可。 4、乳酸石炭酸棉蓝染色液 石炭酸 10克 乳酸,比重1.21, 10ml 甘油 20ml 蒸馏水 10ml 棉蓝,cotton blue, 0.02克 将石炭酸在蒸馏水中加热溶解～然后加入乳酸和甘油～最后加入棉蓝～使其溶解即成。 5、美蓝,Levowitz Weber,染液 在52ml95%乙醇和44ml四氯乙烷的三角瓶中～慢慢加入0.6g氯化美蓝,methylene blue chloride,～旋摇三角瓶～使其溶解。放5-10?下～12-14h～然后加入4ml冰醋酸。用质量好的滤纸过滤。贮存于清洁的密闭容器中。 6、 芽孢染色液 ,1,孔雀绿染液 孔雀绿,malachite green, 5g 蒸馏水 100mL ,2,番红水溶液 番红 0.5g 蒸馏水 100mL ,3,苯酚品红溶液 碱性品红 11g 无水乙醇 100mL 配制方法:取上述溶液10mL与100mL5%的苯酚溶液混合～过滤备用。 ,4,黑色素,nigrosin,溶液 水溶性黑色素 10g 41 蒸馏水 100mL 配制方法:称取10g黑色素溶于100mL蒸馏水中～臵沸水浴中30min后～滤纸过滤两次～补充水到100mL～加0.5g甲醛～备用。 7、 荚膜染色液 ,1,黑色素水溶液 黑色素 5g 蒸馏水 100mL 福尔马林,40%甲醛, 0.5mL 配制方法:将黑色素在蒸馏水中煮沸5min～然后加入福尔马林作防腐剂。 ,2,番红染液 与革兰氏染液中番红复染液相同。 8、 鞭毛染色液 ,1,硝酸银鞭毛染色液 A液: 单宁酸 5g FeCl1.5g 3 蒸馏水 100mL 福尔马林,15%, 2mL NaOH,1%, 1mL 冰箱内可以保存3~7天～延长保存期会产生沉淀～但用滤纸除去沉淀后～仍能使用。 B液: AgNO 2g 3 蒸馏水 100mL 配制方法:待AgNO3溶解后～取出10mL备用～向其余的90mL AgNO3中滴入NHOH～使4之成为很浓厚的悬浮液～再继续滴加NH4OH～直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为止。再将备用的10mL AgNO3慢慢地滴入～则出现薄雾～但轻轻摇动后～薄雾状沉淀又消失～再滴入AgNO3～直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。冰箱内保存通常10天内仍可使用。如雾重～则银盐沉淀出～不宜使用。 ,2,Leifson氏鞭毛染色液 A液: 碱性复红 1.2g 42 95%乙醇 100mL B液: 单宁酸 3g 蒸馏水 100mL C液: NaCl 1.5g 蒸馏水 100mL 临用前将A～B～C液等量混合均匀后使用。三种溶液分别于室温保存可保存几周～若分别臵冰箱保存～可保存数月。混合液装密封瓶内臵冰箱几周仍可使用。 ? 常用培养基的配方 一、牛肉膏蛋白胨培养基,培养细菌用, 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 15-20g 水 1000ml pH 7.0-7.2 121?灭菌20min。 二、高氏,Gause,?号培养基,培养放线菌用, 可溶性淀粉 20g KNO 1g 3 NaCl 0.5g KHPO 0.5g 24 MgSO 0.5g 4 FeSO 0.01g 4 琼脂 20g 水 1000ml pH 7.2-7.3 43 配制时～先用少量冷水～将淀粉调成糊状～倒入煮沸的水中～在火上加热～边搅拌边加入其他成分～溶化后～补足水分至1000ml。121?灭菌20min。 三、马铃薯培养基,简称PDA,,培养真菌用, 马铃薯 200g 蔗糖,或葡萄糖, 20g 琼脂 15-20g 水 1000ml pH 自然 马铃薯去皮后～切成块煮沸30min～然后用纱布过滤～再加蔗糖及琼脂～溶化后补足水至1000ml。121?灭菌20min。 四、完全培养基,简称CYM, 葡萄糖 20g 白胨 2.0g 酵母膏 2.0g MgSO 0.5g 4 KHPO 0.46g 24 KHPO 1.0g 24 琼脂 15-20g 水 1000ml pH 自然 121?灭菌20min。 五 油脂培养基 蛋白胨 10g 牛肉膏 5g NaCl 5g 香油或花生油 10g 1.6%中性红水溶液 1ml 琼脂 15-20g 蒸馏水 1000ml 44 pH 7.2 121?灭菌20min 六 合成培养基 ,NH,PO 1g 434 KCl 0.2g MgSO)7HO 0.2g 42 豆芽汁 10ml 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml pH 7.0 加12ml 0.04%的溴甲酚紫,pH5.2-6.8～颜色由黄变紫～作指示剂,。121?灭菌20min 七 明胶培养基 牛肉膏蛋白胨液 100ml 明胶 12-18g pH 7.2-7.4 在水浴锅中将上述成分熔化～不断搅拌。溶化后调pH 7.2-7.4 121?灭菌20min 八 蛋白胨水培养基 蛋白胨 10g NaCl 5g 蒸馏水 1000ml pH 7.6 121?灭菌20min 九 糖发酵培养基 蛋白胨水培养基 1000ml 1.6% 溴甲酚紫乙醇溶液 1-2ml pH 7.6 另配20% 糖溶液,葡萄糖、乳糖、蔗糖等,各10ml。 制法: 45 1、将上述含指示剂的蛋白胨水培养基,pH 7.6,分装于试管中～在每管内放入一倒臵的小玻璃管～使其充满培养液。 2、将已分装好的蛋白胨水和20%的各种糖溶液分别灭菌～蛋白胨水121?灭菌20min,糖溶液灭菌30min。 3、灭菌后～每管以无菌操作分别加入20% 的无菌糖溶液 0.5ml,按每10ml培养基中加入20% 的糖液0.5ml～则成1% 的浓度,。 配制用的试管必须干净～避免结果混乱。 十 葡萄糖蛋白胨水培养基 蛋白胨 5g 葡萄糖 5g KHPO 2g 24 蒸馏水 1000ml 将上述成分融于1000ml水中～调pH7.0-7.2～过滤。分装试管～每管10ml～121?灭菌30min。 46 主要参考书 1、沈萍、范秀容、李广武 (微生物学实验,第三版,(高等教育出版社(1999( 2、钱存柔、黄仪秀(微生物学实验教程(北京大学出版社(1999年( 47