STR和miniSTR基因座在死亡时间推断中应用的研究（可编辑）

STR和miniSTR基因座在死亡时间推断中应用的研究（可编辑） t 8345 J1 南华大学学位原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特另J Jn以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发或撰写过的研究成果，也不包 含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共 同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名:-皆觏厂 川年y其巧日 南华大学学位论文版权使用授权书 本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有 权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论 文的全部或部分，可以编入有关数据库进行检索，可以采用复印、 缩印或其它手段保留学位论文;学校可根据国家或湖南省有关部门规 定送交学位论文。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。 作者签名: 导师签名: 、髫矿‖ 年厂月衫日 卅年珀影El 目 录 中文摘要„„„一„„„„„一„„„„„„„„„„„,„„(1 英文摘要„„„„„„„„„„一„„„一„„„„„„„„一-3 jI::支:„(„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6 前言„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6月日 罱„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„6 材?f;I„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((9 技术路线„„„„„„一„„„„„„„„一„„„„„„„(11 方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(12 l右果„„(„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„15::: 日木„„。„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„13 讨论„„„一„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(25 结(i《?„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(28 参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(29 主要英汉缩略词对照表„„„„„„„„„„„„„„„„„„-31 综j丕„(„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„((-32 撰写的论文„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„(43 致谢„„„(„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„44 STR和miniSTR基因座在人死亡时间推断中的应用研究 研究生:曾敏 导师:江斌 中文摘要 因座在人体血液、肌肉检材中的检出率与死亡时间的相关性，为死亡 间隔时间推测的实践提供一个新方法。 方法:采集30例死亡时间在24h以内的尸体血液和肌肉检材，样本离体后每隔 24h取材一次直到第9天;样本DNA的提取;对所有样本进行PCR扩增; 软件对电泳结果进行。+ 结果:血液和肌肉分别在死亡时间第3天、4天开始出现STR基因座分型不全， 而miniSTR基因座分型成功。随着死亡时间的延长，血液在死亡时 间第 6天开始出现miniSTR基因座分型不全，肌肉在死亡时间第8天也开始出 现miniSTR基因座分型不全。统计结果表明:STR基因座在血液检材不 同死亡时间点的检出率存在显著性差异 P O(05 ，spearman相关分 析结果显示:STR基因座的检出率与死亡时间呈负相关STR基因座在血 液中的检出率随死亡时间推移而下降;STR基因座在肌肉检材不同死亡 时间点的检出率存在显著性差异 P 0(05 ，spearman相关分析结果 显示:STR基因座的检出率与死亡时间存在负相关;STR基因座的检出 率随死亡时间推移而下降;miniSTR基因座在血液检材不同死亡时间点 的检出率存在显著性差异 P O(05 ，spearman相关分析结果显示: miniSTR基因座的检出率与死亡时间存在负相关，miniSTR基因座在血 液中的检出率随死亡时间推移而下降;miniSTR基因座在肌肉检材不同 死亡时间点的检出率存在显著性差异 P 0(05 ，spearman相关分析 结果显示:mminiSTR基因座的检出率与死亡时间有负相关，miniSTR 基因座的检出率随死亡时间推移而下降。统计结果表明:miniSTR与 与STR基因座在肌肉中总的检出率存在显著性差异 P 0(05 ;STR位 点在血液与肌肉检材中的检出率存在显著性差异 P O(05 ，miniSTR 在血液和肌肉检材中的检出率存在显著性差异 P 0(05 。 见表5―12 结论 1、在人死亡1(9天的尸体DNA检验中，肌肉DNAj羊本比血液DNA样本更有利于 基因分型。 2、在人死亡1―9天的尸体D眦验中，MiniSTRBLSTR技术分型更有效。 3、STR和miniSTR基因座在人血液、肌肉中的检出率均与死亡时间存在负相关。 关键词:STR;miniSTR;血液;肌肉;死亡时间 2 A of ofSTRandminiSTRiocisinthe application study inferenceof intervalinhuman postmortem Abstract Inorderto anewmethodoftheinferenceofdead??timeof Objective provide miniSTR ofthedetectionrateofthree corpse，thecorrelativity loci D4S2364、 sixteenSTRlociinbloodandmuscle with specimens D2S441、DISl677 and deaded―timeof was corpseinvestigated( andmuscle withdeaded―timeof in24h (Methodsblood Thirty specimens corpse drawn vivo 24huntiltheninth were were fromex collected，specimens every day; DNAofbloodandmuscle were PCR extracted; Allsamplesamplifiedby specimens atall PCRwere anABl3130XL theloci(The of Genetic by products separated 3(2software( andtheresultswere Analyzer analyzedusingGenemapper from ResultsThe16STRlocicouldnotbe thethirdand successfullygenotyped day fourth of inbloodandmuscle The day degraded―time samplesrespectively， but couldbe miniSTRlociD4S2364、D2S441、D1S1677 successfully genotyped could theextensionofdeaded―timeof miniSTRloci notbe corpse，the 100, ;With fromthesixthofdeaded-timeinblood wellas day samples，as successfullygenotyped theninthof the ofdeaded-timeinmuscle daydeaded-time， eighthday samples(After in thedetectionrateofminiSTRlociD4S2364、D2S441、D1S1677iszeromuscle indicated:therewas difference DNA significant samples(Statisticalanalysis among thedetectionrateofSTRlociofdifferetdead―timeinblood point specimens (P indicated:Thereis hi(ghnegative 0(05 ，Spearmancorrelativityanalysis correlativity inblood betweenthe intervalandthedetectionrateof16STRloci postmortem of after from detectionrateofSTRloci human bodies，The specimens departing descendwiththeextensionof was difference interval;there postmortem significant loci dead-timeinmuscle thedetectionrateofSTRofdifferet among point specimens indicated:Thereis P O(05 ，Spearmancorrelativityanalysis hilghnegative betweenthe intervalandthedetectionrateof16STRlociin postmortem correlativity 3 muscle ofhumanafter from detectionrateofSTR bodies;The specimens departing descendwiththeextensionof WaS loci postmorteminterval;there significant differencethedetectionrateofminiSTRlociofdifferetdead-timein among point blood indicated:There is specimens P 0(05 ，Spearmancorrelativityanalysis high betweenthe intervalandthedetectionrateof3 negativecorrelativity postmortem lociinblood ofhumanafter from miniSTR specimens departingbodies，Spearman indicated:Thereis betweenthe correlativityanalysis highnegativecorrelativity intervalandthedetectionrateofminiSTRlociinblood of postmortem specimens humanafter from detectionrateofminiSTRlocidescendwith bodies，The departing theextensionof was difference the postmorteminterval;theresignificant among detectionrateofminiSTRlociofdifferetdead-timeinmuscle point specimens P indicated:Thereis 0(05，Spearmancorrelativityanalysis hi(ghnegative correlativity betweenthe intervalandthedetectionrateof3miniSTRlociin muscle postmortem human from The of after bodiesdetectionrateofminiSTRloci specimens departing descendwiththeextensionof interval(Statisticalindicated: there postmortem analysis differencebetweenalldetectionrateofminiSTRlociand was all significant detectionrateofSTRlociin30blood was specimens P O(05 (theresignificant differencebetweena11detectionrateofminiSTRlociandalldetectionrate ofS1rI己 lociin30muscle was differencebetween P 0(05 ;there specimens significant detectionrateofSTRlociin30blood anddetectionrateofSTRlociin30 specimens muscle WaS differencebetween degraded specimens P O(05 ，theresignificant in detectionrateofMiniSTRloci30blood anddetectionrateofMiniSTR specimens lociin30muscle specimens( Tab 5―13 Conclusion 1、Themuscle werebetterthantheblood forDNA samples samples genotypeanalysis DNA fromthefirst toninthof interval samples day daypostmortem 2、miniSTRlociweremore thanSTRlocifortheforensic for predominant analysis DNA fromthefirst ninthof interval( to samples day daypostmortem 3、Thereis betweenthe intervalandthe highnegativeeorrelativity postmortem 4 detectionrateofminiSTRlociorSTR in loci muscleorblood of specimens humanafter frombodies( departing tandem tandem [Keywords]short repeats;mini-short of Graduatestudent:Zeng min ScienceMedico-legalPhysical Evidence DirectedProfessorBin by Jiang 5 -^上(-JL- 刖 看 tandem 在人基因组中，短串联重复序列 Shon repeat，STR 是一种可遗传的 不稳定的并且具有高度多态性的短核苷酸重复序列。STR的核心序列为2"-'7bp， 呈串联重复排列。重复次数10"--60次左右，其总长度常小于400 bp。每个特定 位点的STR均由两部分构成:中间的核心区和外围的侧翼区。核心区含有一个以 上称为“重复"的短序列，一般该重复单位的碱基对数目不变，而串联在一起的 重复单位数目是随机改变的。多数的STR基因座具有多态性【11，其高度多态性主 要源于核心序列重复次数的个体间差异，这种差异在基因传递的过程中一般遵循 孟德尔共显性遗传规律12】。 由于STR遗传标记系统在人类基因组中分布广泛、具有高度的遗传多态性 和简单快捷的检测方法而被广泛应用于法医学领域，已能够解决大部分个体识别 和亲权鉴定案例。但在微量及降解检材检验时，可出现“优势扩增"或者“无效 扩增”，甚至无扩增产物【31，为了解决这个问题而产生的一种新的STR分型技 术，就是在引物时，使其结合在更靠近核心重复序列的侧翼序列，PCR 扩增 术通过缩短STR扩增片段的长度提高检测灵敏度和降解片段的检出率，获得较好 的变小提高了降解DNA分型的成功率; 2 目前大多数研究所用的mimSTR位点 都和商品化试剂盒的STR位点相同，这就使MiniSTR具有一个很明显的优势; 数据库兼容性[71; 3 高个人识别力 high 多态性的STR位点，理论上与商品化STR试剂盒具有同样的个人识别力，完 全可以达到法庭科学个人识别的标准。 4 高灵敏度咖gh 术灵敏度达至;J31 II“剐，远高于商品化试剂盒， 因此可以用于微量检材的 pg,25 检测。 合扩增体系与商品化STR试剂盒之间同一性进行了研究，Schumm等【加】则研究了 法医学工作1书111,12]，这些位点大多具有高度杂合度，扩增片段比13个DNA联合索 6 到法医学所要求的个人识别标准，适用于高度降解微量检材的检测，同时对于法 医领域中亲子鉴定、失踪人员及重大灾难残骇的鉴定具有重要意义。1993年，美 国邪教Branch ForensicScience 机构 ne Service 运用STR技术对这些降解的DNA分型时，当 时发现片段较小的的STR位点，得到较好的分型结果【13】。2001年，9(11事件造 成了2000多人死亡，对遇难者遗骸进行个人识别时，原有的STR技术对这些降解 的DNA分型结果不太理想，之后采用了两个新的STR复合扩增体系【141。通过缩 小STR位点扩增片断的长度，对原有分型方法存在困难的样品进行分型，促进了 对遇难者遗骸的鉴定工作，同时这种新的DNA分型技术正式命名为miIliSTR技 进行检测降解DNA样本，发现成功率比现有的商品化STR试剂盒提高很多【11111。 型成功率。Martin等人【16】也通过对264个西班牙非血缘关系健康个体的血液和唾 基因座能提高非父排率，因此建议将其加入欧洲标准中。2006年Bai等人 【17】对沈阳 D4S2364、 216例汉族和180例朝鲜族血液样本检测了D1S1677、D2S441、 点在两组人群中多态性程度都相对较高。期望杂合度HE范围汉族0(617至00(829、 现出较理想的数值。 死亡时间在法医学是指死后时间或死后间隔时f日q postmorteminterval，PMI ， 较准确估计PMI，对于衡量法医实际工作者的水平和效率具有重要的意义。十九 世纪三十年代以来，法医学者逐步发现依据尸冷、尸斑、尸僵、角膜混浊、超生 反应等尸体现象以及胃内容物的质与量、嗜尸昆虫生长与变更能推断PMI，但根 据尸体现象推断PMI受到许多外界因素的影响118】，因此精确性受到一定的限制。 7 二十世纪80年代以来，陆续有用不同的方法研究测定死后组织DNA含量，均呈 现逐渐下降的趋势，并与死亡时间有显著的相关性，有关报道6,b时内DNA含量 基本保持不变。1989年国内齐风英【191首次用流式细胞仪分析了大鼠死后心、肝、 肾细胞悬液的DNA'含量情况，发现个体差异较小，6d"时内细胞D全『A含量变化不 显著，12(244,时下降显著，30(48J'J、时下降趋于缓慢，以后有规律下降至消失。 1994年CinaI刎又使用流式细胞仪研究了人的脾组织的DNA含量随时间变 化情 况，并得出了DNA'含量变化与死亡时间的规律关系。1998年DiNunno等【21】用流 式细胞仪方法对人死后组织细胞的DNA变化情况进行观察发现，脾等组织细胞 在死后72,J、时内呈一定规律下降，DNA含量与死亡时间有较强相关性，72d',时 以上DNA大量降解变性，用流式细胞仪无法测定出有效数值。2000年刘良等【221 用图像分析技术对大鼠死后脑、肝组织细胞DNA变化与死亡时间进行了研究， 发现细胞核DNA降解速率在不同时间内存在不一致现象。尽管学者采用了各种 方法来进行PMI推断，但至今未找到较准确估计PMI的方法。 在多态性、亲子鉴定和高度腐败检材的个人识别方面。但STR和MiniSTR位点在 死亡时间推断中尚未使用。 肉中的检出率与PMI的相关性，为死亡间隔时间推断的提供一个新方法。 8 材料 一、 样本 采集30例 样本由南华大学司法鉴定中心和佛山市公安局提供 死亡24h以 内的尸体心脏血液20ml,-gl右大腿同一部位的肌肉样本lOOg，死亡原因为颅脑外伤 岁，平均年龄36(8岁，死者死前身体健康，死后尸体检验未发现明显病理改变， 肌肉无损伤及其它病理性改变。样本离体后每隔24h取材一次直到第9天， 室温在 20,25?范围内波动，湿度在50"--'60,范围内波动。 二、主要试剂及其配制 1 Chelexl00购自美[]Sigma-Aldrich公司。 5,Chelexl00:Chelex-100 59，加去离子水100ml，4"C保存。 ’ 2 蛋白酶K，dNTP购自上海生工生物工程有限公司。 20mg,ml蛋白酶K:50mgJJl]去离子水2(5ml，-20"C保存。 10mM 20毗MdNTPs??100pldNTPs力【I去离子水90叻l，4"C保存。 3 10×PCR 4 GS500LIZ购自美国ABI公司。 5 HIDI甲酰胺购自ABI公司 Identifiler kit试剂盒购自ABI公司 6 Ampf,STR 三、引物 miniSTR 见表1 。 9 表1(三个miniSTR基因座的有关信息 引物母液的配制见下表2。 表2(三个位点引物母液配制 使用前分别稀释5倍于去离子水中，终浓度为20pM，-20。C保存备用。 四、主要仪器设备 1 PCR仪 美国ABI 2 遗传分析仪3130XL 美国ABI 3 台式离心机 美国热电公司 7 冰箱 青岛海尔电冰柜股份有限公司 5 紫外分光光度仪 美国分子仪器公司 6 超净工作台 上海净化设备厂 4 恒温水浴箱 上海精宏实验设备有限公司 8 去离子水纯水仪 密理博上海有限公司 9 移液器 德国吉尔森公司 10 电子天平 上海精密科学仪器有限公司 10 技术路线 陌习 I((((((((((((((((((((((((_J 方法 一、血液DNA提取 1、在0(5ml离心管中加入400ul纯水，然后加入适量血液，小心混匀;放 置30 分钟，间歇振荡; 2、10000(15000rpm，3min，离心;小心移去上清液; 3、沉淀中加入5,chclcx100 100(200目 12吼l，56"C保温过夜; 4、高速振荡5(10s; 5、恒温98?中放置8s: 6、高速振荡5(10s; 二、肌肉DNA提取 100 100(200 1(、用手术刀片刮取适量的肌肉放入0(5ml离心管中加入5,chelex 目 20蛳l+蛋白酶KlOul，56"C保温30min以上; 2、高速振荡5―10s: 3、恒温98?中放置8s; 4、高速振荡5(10s: 三、DNA浓度测定 采用紫外分光光度计法: 预热约15分钟至仪器稳定，校准分光光度 DNA样品，把样品杯放分光光度计比色槽上。读取 计为零，取10,111 纯度，所有样本DNA纯度在1(35(1(5。 1。 I( 四、扩增 l AmpFLSTRIdentif'fler试剂盒:10u1反应体系内容见表3 表3(STR反应体系 名称 体积量以1 2(8 超纯水 4 PCRReactionMIX 0(2 Tag酶 5u,u1 PimerSet 2 DNA模板 5ng 28个循环，最后60" 2延伸60min，4"C保存备检。每次实 验都同时做阴性对照和阳 性对照。 miniSTR基因座:10ul反应体系内容见表4。 表4(miniSTR反应体系 28个循环，最后60?延伸45min，4"C保存备检。每次实验 都同时做阴性对照和 阳性对照。 五、3130XL电泳检测及等位基因分型 1、扩增产物1(靴l，Hi-Di即l，GS500LIZO(犁l混匀，分别点于96孔板中。 2、以3000(4000rpm，5-10s，离心。 3、PCR仪2(5分钟变性，取下后迅速置于冰水中。 4、待96孔板冷却后以3000(4000rpm，5(10s，离心。 I『L-???『 5、于3130XL遗传分析仪上进行自动检测。 6、Genemapper软件对电泳结果进行等位基因检测分型 六、统计学分析 等位基因检测分型结果的比较采用四格表、行×列?检验及Spearman相关分 析 以a--'0(05为检验标准 ，采用SPSSll(0统计软件进行数据处理。 14 结果 1、STR基因座在不同死亡时间的血液、肌肉中的分型 利用STR技术对不同死亡时间的血液进行分型比较，结果显示:血液分别在 死亡时间第3天、4天开始出现STR基因座分型不全，片段较大的STR基因座，如 片段增大而显著降低、等位基因缺失或完全丢失。随着死亡时间的延长，STR基 因座在血液检材死亡时间第7天开始出现无法分型;STR基因座在肌肉检材死亡 时间第8天也出现完全检测不出 见图1(7 驴T哩下矿1矿T啊叩矿巧叩Z‘呵7翟‘冒 m可m吧呵r丁T凹曙呵 图1(STR基因座在死亡2天血液检材中的分型图4(STR基因座在死亡3天肌肉检材中的分型 Z呷鼍yr’X1’”:r’翟叮’r下鼍rr王卜r气?―F1?’r 图2(STR基因座在死亡3天血液检材中的分型图5(STR基因座在死亡4天肌肉检材中的分型 I?”7 ’‘T1岫,”“r:!::”P::|: r”茹”‘r毯’”T1(工„”广譬rTl-工’ 图3(STR基因座在死亡6天血液检材中的分型图6(STR基因座在死亡6天肌肉检材中的分型 ST睦因座在死亡8天肌肉检材中的分型 2、miniSTR基因座在不同死亡时间的血液、肌肉检材中的分型 利用milliSTR技术对不同死亡时间的血液、肌肉检材进行分型比较，结果 显示:血液和肌肉检材在死亡时问第3天、4天时，miniSTR基因座扩增片段产物 相对荧光强度 Rfu 均在2000(3000之间，随着死亡时间的推移，血液检材从死亡 时间第6天开始出现miniSTR基因座分型不全;肌肉检材在死亡时间第8天也开始 出现miniSTR基因座分型不全 见图8(12 。 吲”„r‘掣。。。1111”P。"ln”’“Z。 '-lI|-11--”掣mI-JII„I?? -„I-IIII“(??|-I_Im??„„„I-?„ 撸 ? 柚 „(( eta m ? 100 110 ( ^，(( 图8(miniSTR基因座在死亡3天血液检材中的分型 叩“箬“。?三“„。?””I(|l。II””?l: ,?‘„嚣叫’’苫。抻P‘誊„(((鬈叫 ,”“,-(一”苫一“鬈”“攫w”:鬈”??磐 i从浊胤―? 图9(miniSTR基因座在死亡6天血液检材中的分型结果 16 ’tamr(q,T”‘r1。苫‘‘。r’ 。„,1”掣1”T“”。王“”鼍: 一 F一‘:呷??Z叫”r”??公巾:p”墨 ^ 图i0(miniSTR基因座在死亡4天肌肉检材中的分型结果 1”W“”‘公。‘”r”’翟“一掣” ”叮70””:叩譬”„1r”一: 1町 ? ? ”D ””;‘1|lI((0一苫叫”苫”’甾1”1。1r’? ?帕a ? 、_??-J??-_0’-“_、-??_t 一,一_^。 图11(miniSTR基因座在死亡6天肌肉检材中的分型结果 ‘M„I„’|IllII””„„IIIIII”lfI|。 “”“翼„”。Z„”。X“”“搓?。l:“” 7口 田 ? 'O口 ”口 1“‘,“”。羔“””羔„”’拦“P:|j: ?z舢I 图12(miniSTR基因座在死亡8天肌肉检材中的分型结果 17 3、STR与miniSTR基因座在不同死亡时间点血液和肌肉检材中的检 出率及检出率与PMI之间关系 3(1(STR基因座在血液检材不同死亡时问点的检出率的比较及检出率与PMI之 间关系 统计结果表明:STR基因座在血液检材不同死亡时间点的检出率存在显著 结果显示: STR基因座在血液检材死亡1和3天的检出率存在显著性差异 在此基础上又做了STR基因座检出率与死亡时间的speannan相关分析，结果显 因座在血液检材中的检出率随死亡时间推移而下降 见表5及图13 。 表5(STR基因座在血液检材不同死亡时间点的检出率 18 蚕 譬 惯 天数 图13(STR基因座在血液不同死亡时间点的检出率与PMI的变化趋势 3(2(STR基因座在肌肉检材不同死亡时间点检出率的比较及检出率与PMI 之间 关系 统计结果表明:STR基因座在肌肉检材不同死亡时间点的检出率存在显著性 结果显示:STR基因座在肌肉检材死亡1和4天的检出率存在显著性差异， 又做了STR基因座检出率与死亡时间的spearman相关分析，结果显示:STR基因 中的检出率随死亡时间推移而下降 见表6及图14 。 19 表6(STR基因座在肌肉不同死亡时间点的检出率 季 譬 懈 天数 图14(STR基因座在肌肉检材不同死亡时间点的检出率与PMI的变化趋势 3(3(miniSTR基因座在血液检材不同死亡时间点检出率的比较及检出率与PMI之 间关系 统计结果表明:miniSTR基因座在血液检材不同死亡时间点的检出率存在显 结果显示:miniSTR基因座在血液检材死亡1天和6天的检出率存在显著性差异 基因座检出率与死亡时间的spearman相关分析，结果显示:miniSTR基因座的检 蚕 藿 援 天数 图15(miniSTR基因座在血液检材不同死亡时间点中的检出率与PMI的变化趋势 21 3(4(miniSTR基因座在肌肉检材不同死亡时间点的检出率的比较及检出率与PMI 之间关系 统计结果表明:miniSTR基因座在肌肉检材不同死亡时间点的检出率存在显 结果显示: miniSTR基因座在肌肉检材死亡1天和8天的检出率存在显著性差 的检出率与死亡时间的spearman相关分析，结果显示:miniSTR基因座在肌肉 肉中的检出率随死亡时间推移而下降 见表8及图16 。 表8(miniSTR基因座在肌肉检材不同死亡时间点的检出率 季 譬 酱 天数 图16(miniSTR基因座在肌肉检材不同死亡时间点的检出率与PMI的变化趋势 3(5(STR和miniSTR基因座在血液检材中总检出率的比较 统计结果表明:STR与miniSTR基因座在血液检材中总的检出率存在显著性 差异 X2 209(176，P 0(05 见表9 。 表9(STR和miniSTR在血液检材中总检出率 3(6(STR和miniSTR基因座在肌肉检材中总检出率的比较 统计结果表明:STR和miniSTR基因座在肌肉检材中总检出率存在显著性差异 x2 347(185，P 0(05 见表10 。 表10(GTR和miniSTR在肌肉检材中总检出率 3(7(STR基因座在血液和肌肉检材中总检出率的比较 统计结果表明:STR基因座在血液和肌肉检材中总检出率存在显著性差异 石2 75(21，P 0(05 见表11 。 表11(STR基因座在血液和肌肉检材中总检出率 3(8(miniSTR基因座在血液和肌肉检材中总检出率的比较 统计结果表明:miniSTR在血液和肌肉检材中总检出率存在显著性差 ， 64(028， P O(05 见表12 。 表12(miniSTR基因座在血液和肌肉检材中总检出率 讨论 一、STR技术与miniSTR技术在不同死亡时间组织中应用 在法医实际检案工作中，经常需对死亡尸体进行鉴定。提取死亡尸体组织 进行检验所需的检材，不同检验技术要求不尽相同。黄兴国等人对177起案件中 526件法医物证检验统计分析发现血液是法医检验最常见的检材，在15种检材中 现场血迹最多占37,;检材分类中血痕检材最多占70,;物证检验结果利用率为 77,。肌肉也是常见的一种检材，胡慧英【冽等人对从高度死亡尸体上提取的肌 肉、头皮、血液等进行的提取、荧光标记复合扩增技术进行扩增分型，并比较分 析了扩增效果，结果显示:所有STR基因座肌肉的检出率明显高于头皮和血液检 材。因此我们的实验也选用用了血液和肌肉组织的降解检材，在实验取材时间点 的选择上，我们通过预实验发现随着样本死亡时间的延长STR与MiniSTR基因座 的检出率每天变化较大，到第九天后二种技术均不能检测出来，因此我们选择了 1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天几个时间点。 Identifiler kit荧光标记STR复合扩增试剂盒包括D8S1179 Ampf,STR 16个STR基因 3 个常染色体MiniSTR基因座，等位基因片段长度60(120bp之间，是理想的 有法医 Identifiler kit荧光标记 STR 学价值的MiniSTR位点。我们的实验选择TAmpf,STR 试剂盒和D4S2364，D2S441和D1S1677 3"个MiniSTR基因座对不同死亡时间尸体 血液和肌肉组进行检测。 在以往的实验中，娄春光【冽选取了9例淇中高度腐败尸体血4例，微量检材 3例，腐蚀金属上血迹2例，编号1(9 DNA高度降解检材，应用miniSTR技术与商 Identifiler试齐lJ盒检测，其中8例样本在 品化试剂盒进行比较分析，利用Ampf,STR 16个基因座中均未得到明确分型，只有1例样本在5个基因座中得到明确分型群 座中均获得正确分型，另外3例样本获得明确分型的基因座数分别为2 样 本2 、 2 样本8 、1 样本9 ，较常规STR检出率明显提高。 我们的实验结果显示:血液和肌肉分别从第3、4天开始出现STR基因座分型 有效的扩增，表现为:扩增效率随片段增大而显著降低、等位基因缺失或完全丢 失。可能的机制为机体死亡后，组织细胞失去生物功能，胞浆内溶酶体膜破裂， 释放出各种酶类。在水解酶、死亡细菌等内外因素的共同作用下，使细胞核中 DNA降解成小片段，以至于大片段的STR基因座无法检出。有研究表明，严重 即各STR位点 降解的DNA样品存在一个“DNA降解曲线’’ decaycurve ， 扩增成功率与位点的等位基因长度成反比r71。因此在这种情况下大片段STR位 点扩增灵敏度降低甚至低于检测阈值，导致分型失败。而miniSTR基因座在死亡 时间为3天、4天的血液和肌肉中的扩增片段产物相对荧光强度 Rfll 均在 2000(3000之间。可能的机制为miniSTR技术是设计引物时尽可能接近核心重复序 列的侧翼序列，缩短扩增片段长度提高了降解DNA检测成功率。本研究发现 miniSTR基因座在血液和肌肉检材中的检出率均高于STR。上述结果提示:在腐 败尸体的DNA的检测中，miniSTR技术比STR技术分型的成功率高。我们的实验 结果与文献报道一致。 胡慧判24】等从高度死亡尸体中取材肋软骨、指甲、肌肉、头皮、血纱应用 PE profilerplus荧光STR复合扩增试剂盒发现肌肉组织试剂盒10个基因座检出 率明显高于血纱的检出率。本实验结果显示:血液检材中STR和miniSTR基因 座分别在第3天、第6天开始出现基因座分型不全，而在肌肉中STR和miniSTR 基因座分别在第4天、第8天开始出现基因座分型不全。STR和miniSTR基因座 在肌肉检材中的总检出率均高于血液 尸 0(05 ，上述结果提示:1、STR和 miniSTR基因座在死亡9天以内的尸体DNA检验中，提取肌肉检材比血液 检材分 型更有效，可能的原因为不同的器