醋酸铵盐析法和DNA修复技术在福尔马林固定石蜡包埋组织DNA多态性分析中应用研究

醋酸铵盐析法和DNA修复技术在福尔马林固定石蜡包埋组织DNA多态性分析中应用研究 醋酸铵盐析法和DNA修复技术在福尔马林固定石蜡包埋 组织DNA多态性分析中应用研究 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名:(』:塑垫鱼日期:2堕:,y 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即:研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容 保密内容除外 ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名:圈鱼窿』 指导教师签名:耋[盔丝 日 期:丛坐:兰: 竺 Il四Y17八6嬲 目 录 一、摘要 中文论著摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„l 英文论著摘要„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„4 二、英文缩略语„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„8 三、论文 前‘言日U舌 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 9„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„9 材料与方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„10 实验结果„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„15 讨论 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„22 结论„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„28 四、本研究创新性的自我评价„„„„„„„„„„„„„„„„„„29 五、参考文献„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„30 六、附录 综述„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„32 致谢„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„46 个人简介„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„47 ??中文论著摘要?? 醋酸铵盐析法和DNA修复技术在福尔马林固定石蜡 包埋组织DNA多态性分析中应用的研究 刖 舌 福尔马林固定石蜡包埋组织 formalin(fixedand tissue， paraffin(embedded FFPET 因其能够较长时间地保存组织或制备检验所需的组织标本，因此在临床 病理检验、法医病理学鉴定和医学科学研究过程中常被用到。这一处理过程虽然 能够使DNA免受内源性核酸酶的破坏，但是甲醛不仅会导致DNA链的断裂和降 解、DNA发生脱嘌呤以及DNA。蛋白质的交联，造成被固定组织DNA质量的改 变，而且其在DNA中的残存也严重影响着PCR扩增。 研究表明，影响FFPETDNA提取的因素有很多。如固定液的种类、固定时 间、切片厚度、切片存储时间以及不同的提取处理方法等均可影响FFPET提取 DNA的质量，从而影响其基因分型。通过优化蛋白酶消化条件、增加循环次数或 采用巢式PCR等，虽然可以提高扩增产物量或扩增特异性，但并未明显改善其检 tandem nucleotide repeat 系统或SNP singlepolymorphism 系统，虽然提高了对 降解DNA检材的分型成功率，但仍然普遍存在诸如等位基因或位点丢失、不平衡 峰、伪峰等问题。此外miniSTR系统扩增片段长度不可能无限的减小 基本在50, 的位点数较多等缺点，也限制了其在实际检案中的应用。 本研究基于法医学检案的实际需要，结合前人的研究成果，通过对醋酸铵盐 析法进行改进，并结合PCR前修复技术提高模板DNA质量，以期为法医学实际 检案中FFPETDNA的STR分型提供一种新的方法。 材料与方法 医科大学法医病理学教研室提供。 2、经10,中性福尔马林溶液固定ld、3d、5d和7d后，进行石蜡包埋，常规 切片备检。 盐析法影响因素进行探讨，并将其与酚,氯仿法、Chelex(100法进行比较，同时探 讨法医学可以实现成功分型的最小FFPET检材量。 4、对改良醋酸铵盐析法所提基因组DNA采用修复酶进行模板DNA的修复。 结 果 1、不同脱蜡方法提取基因组DNA的PCR(PAGE结果显示未脱蜡和脱蜡均可 得到清晰谱带;但是从谱带亮度上看95?水浴脱蜡谱带最亮，65?水浴脱蜡次之， 后依次为二甲苯脱蜡、微波脱蜡、不脱蜡。 2、不同消化缓冲液消化提取DNA的PCR(PAGE结果显示0(5,Tween20消 化谱带最亮，1,TritonX-100消化次之，后依次为0(5,SDS消化，2,CTAB消化。 3、不同浓度醋酸铵溶液沉淀所得基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果显 示三 种浓度醋酸铵溶液提取的DNA量无显著性差异。PCR(PAGE结果显示三种浓度醋 酸铵溶液提取的基因组DNA扩增产物均可得到清晰谱带，谱带亮度上三者之间无 显著性差异。 4、不同固定时间FFPET所提基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳结果显示不同 固定时间切片组织所提取的基因组DNA的电泳谱带均成弥散状，且随着固定时间 的延长，谱带弥散越明显，谱带最亮区域逐渐下移。PCR(PAGE结果显示不同固 定时间切片组织均可得到清晰谱带，但随着固定时间的延长，谱带亮度逐渐减弱。 5、不同提取方法所得基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果显示Chelex(100法 所得DNA的电泳谱带最亮，改良醋酸铵盐析法次之，酚,氯仿法相对最弱;同一 种方法内部比较显示随着检材量的减少，三种方法所提取的基因组DNA的电泳谱 带亮度均逐渐减弱。OD260,OD280比值，改良醋酸铵盐析法在1(6,2之间 于其他两种方法;改良醋酸铵盐析法次之，酚,氯仿法最少;且随着检材量的减少， 这种趋势更明显。PCR(PAGE结果显示改良醋酸铵盐析法提取的DNA均可扩增出 清晰的谱带;酚,氯仿法提取的DNA扩增谱带较弱，且随着检材量的减少，谱带 亮度明显减弱，当检材量减小为1,8片时已基本显示不出谱带;Chelex(100 法提取 的DNA在1片时未扩增出谱带，1,2片时谱带隐约可见，而在1,4片、1,8片时可 见清晰谱带，但亮度不及改良醋酸铵盐析法所提取的DNA的亮度。 DNA聚合酶修复，修复组均扩增出清晰的谱带，而未修复组无谱 果显示采用Taq 带或谱带较弱;采用T4连接酶修复，修复组和未修复组在谱带亮度上未见显著性 DNA聚合酶和T4连接酶联合修复，结果显示两个样品的修复组 差异;采用Taq 均可见清晰谱带，而未修复组均未见谱带。 结论 1、改良醋酸铵盐析法具有简单、经济、无毒等优点;与酚,氯仿法、Chelex(100 法相比，提取基因组DNA的量更大、质量更好，适合微量检材DNA的提取。 DNA聚合酶修复技术可以极大地提高高度降解检材STR分型的 2、使用Taq 成功率，适合高度降解检材STR分型的应用。 79m STR的成功分型，在特殊生物性检材的个人识别中具有重要意义。 关键词 法医物证学;DNA提取;改良醋酸铵盐析法;DNA修复;福尔马林固定石 蜡包埋组织 ??英文论著摘要?? The ofAmmoniumAcetateExtractionandDNA study alr in‘thttlle 州 Ol―D―NA‘ pairtechniqtechniqueaOOlication in formalin―-fixedand polymorphismanalysis n-embeddedembeddedtissues arapseussit paraffin Introduction Formalin-fixedand totheir to paraffin-embeddedtissues，dueabilitypreserve for timeorthe ofthe oftest organizationslonger requirementspreparationspecimens， andthereforeareoftenusedclinical in andmedicine they pathology,forensicpathology scientific this can DNAfromthe of research(Although processprevent damage nuclease，the willnot leadtothebreakand endogenous formaldehydeonly degradation oftheDNA betweenDNAand in strands，depurination，Gross―linkingprotein，resulting the ofthe ofDNAinfixed alsoinhibitPCR change quality tissues，but amplification whenitsresidualinthe DNA( stay template Studieshadshownthat factorsCan theDNAwhich affect wasextracted many fromformalin-fixedand asthe of paraffin―embeddedtissues，suchtypefixative， the ofthe thickness ofthesliceandthedifferent fixed-time，the slice，the storage―time treatment the methods(By conditionsof optimizing proteasedigestion， increasingcycle timesor nestedPCRandSO thesecouldincreasetheamountof using on，eventhough PCR or didnot thesuccess productsspecificity,thesesignificantlyimprove rate(By the ofthe asthe ofminiSTRor shorteninglength fragments，such development system SNP thesuccessrateof ofthe DNA the system，althou曲enhancingsub―type degrade werestill asthelossofallelesor many Samples，there problems，such loci， unbalanced andSOon(In of inminiSTR addition，the peak，pseudo??peak lengmamplifiedfragment couldnotbereduced SNP system infinitely 50―200bp (Ifanalysistechnology 4 wantedtoachievethesame ratewiththe STR more recognition kits，it using required restrictedits inrealcases( loci，this applications This wasbasedontheneedsofforensic withtheresults study science，combined of the ammoniumacetateextraction previousstudies，byimproving method， and combinedwith orderto anew for pre-PCRrepairtechnology,in provide approach DNA-STRofformalin-fixedand tissuesinforensiccases( typing paraffin-embedded MaterialandMethods 1(The tissuesareobtainedfromthe inthedeathof24 kidney body hours， their x sizeswerelcm×lcm with15mlofthe heart-bloodwere 0(5cm(together provided the ofForensicMedicineinChinaMedical by Faculty University( 2(Paraffinembeddedafter with10,neutralformalin fixing solution， thefixing timewasl and forthe d，3d，5d7d，then slicing experiment( 3(ExtractedDNAfromthe flesh tissuesandthe blood，thekidney FFPET,and then the factorsoftheammoniumacetateextraction analyzedinfluencing method， then itwith extraction 00extraction comparedphenol,chloroformmethod，Chelex一1 method， andwealsostudiedthesmallestFFPET whichcouldachievesuccessful samples inforensicscience( classification the DNA extracted with 4(Repairedtemplateusingrepairenzymes，which Ammoniumacetateextractionmethod( improved Result 1(PCR―PAGEofthe DNAwhichextractedwithdifferent genomic dewaxing methodsshowedthat and allcan clear forthe non-dewaxing bands;but dewaxingget waterbathof95。C the intensity,the get brightestbands，followedby 65。C， xylene， microwaveand non-dewaxing( 2(PCR-PAGEofthe DNA genomicextractedwithdifferent buffer digestion showedthat withO(5,Tween20couldthe bands(followed digesting get brightest by with X-1 1,Triton00(O(5,SDSand2,CTAB( digesting 3(Fromthe ofthe extracted agarosegelelectrophoresisgenomicDNA，whichby 5 differences betweentheamountsoftheDNA(Forthe significant PCR― PAGE，it showedthat allcouldclear there wereno differencesof they get bands，and significant the betweenthem( brightness 4(The ofthe DNAwhichextractedfrom agarosegelelectrophoresisgenomic differentfixed―timeshowedthatthe bandswereall into electrophoretic dispersedshape， andwiththeextensionofthe bands the fixed-time，thedispersed gradually,andbrightest moveddown(PCR― PAGEshowedthatDNAextractedfromdifferent regionsgradually fixed-timeallCan clear withtheextension bands，but ofthe bands get fixed-time， the weakened( gradually 5(The ofthe DNAwhichextractedfrom agarosegelelectrophoresisgenomic differentmethodsshowthatthebandsfrom Chelex一 100extractionmethodare brightest， followedfromthe ammoniumacetateextraction by improved methodandfromthe extraction internal ofonemethodshowed method;The phenol,chloroform comparing thatwiththereductionoftheamountofthe bandsall samples，theelectrophoretic weakenedinthethreemethodsof DNA showedthatit genomicextracted(OD260,OD280 between 4-O(1 was 1(6and the DNAextractedthe 95 of 2(0 1(962 genomic by ammoniumacetateextraction the methodit improved method，byphenol,chloroform exceeded theChelex-100methoditwasabout 4- 2(0 2(1104-0(470 ，by 1(0 1(018 the wecouldsee 0(1 amount that(TheChelex一 100extractionmethodthe 24 (From get imumofthe the ammoniumacetateextraction genomicDNA，followedby improved methodandthe extraction italsoshowedthatthefewer phenol,chloroformmethod，and thetrend the was(Fromthe resultstoldUS material，the bigger PCR―PAGE，the that，we couldclearbandsthe extraction ammoniumacetate the get by improved method; at sametime wereweakerthe extraction the they by phenol,chloroformmethod，and fewerthe weakerthebands the wasreducedto material，the were，when samples 1,8， we no the were1 DNAextracted nearlyget bands;When samples piece，thegenomic theChelex一100extractionmethodCallnot clear reducedto by get bands，when 1,2， they 6 thebandswere when reducedto1,4and couldclear undefined，while 1,8，we they get werestillweakerthanthebandsfromthe ammoniumacetate bands，butthey improved extractionmethod( DNA 6(Pre-PCRofthe whichextractedthe repair template by improved ammoniumacetateextractionmethodshow were bandsin that，there stronger repair with DNA thecontrolhadnobandorweaker groupTaq polymerase，whilegroup bands; were There no differencesbetweenthe andthecontrol significant repairgroup group when T4 for weused DNA withT4 usingligaserepair;whenTaq polymerasejoining for clearbandsatlast( ligaserepair,we get Conclusion I(The ammoniumacetateextractionmethodhas of improved goodqualities SO it andon;when with simple，economical，non-toxiccomparedphenol,chloroform extractionmethodandChelex一100extraction DNAextracted method，its gethigher and issuitablefor purityamount;it micro―samples( DNA with DNA Can 2(The enhancethe repairtechniquesTaq polymerasegreatly SuccessrateofSTR for issuitablefortheSTR highdegradesamples，which genotyping of genotypinghighdegradesamples( ammoniumacetateextractionmethod withDNA 3(Usingimproved joining repair Can thesuccessrateofSTR fortheminimumFFPET techniqueimprove genotyping forensic hasan science，which Samples 0(5cm×0(25cm×7pm in important identificationofformalin????fixed for and significancepersonal paraffin??-embedded tissues( words Key evidence;DNA ammoniumacetateextraction Biological extraction;Improved method;DNA and tissues repair;Formalin??-fixedparaffin????embedded 7 ??英文缩略语?? ??论文?? 醋酸铵盐析法和DNA修复技术在福尔马林固定石蜡 包埋组织DNA多态性分析中应用的研究 (?上(-J- 刖 吾 and tissue， 福尔马林固定石蜡包埋组织 formalin(fixed paraffin(embedded FFPET 因其能够较长时问地保存组织或制备检验所需的组织标本，因此在临床 病理检验、法医病理学鉴定和医学科学研究过程中常被用到。这一处理过程虽然 能够使DNA免受内源性核酸酶的破坏，但是甲醛不仅会导致DNA链的断裂和降 解、DNA发生脱嘌呤以及DNA(蛋白质的交联【l】，造成被固定组织DNA质量的改 变，而且其在模板DNA中的残存也严重影响着PCR扩增，导致PCR扩增的失败。 因此，如何从FFPET中获得高质量的模板DNA，一直是法医物证学鉴定面临的 重大挑战。 研究表明，影响FFPETDNA提取的因素有很多。如固定液的种类、固定时 间、切片厚度、切片存储时间以及不同的提取处理方法等均可影响FFPET提取 DNA的质量，从而影响其基因分型。通过优化蛋白酶消化条件，增加循环次数或 采用巢式PCR等，虽然可以提高扩增产物量或扩增特异性，但并未明显改善其检 tandem nucleotide repeat 系统或SNP single polymorphism 系统，虽然提高了对降 解DNA检材的分型成功率，但仍然普遍存在诸如等位基因或位点丢失、不平衡峰、 伪峰等问题。此外miniSTR系统扩增片段长度不可能无限的缩小 基本在50, 200bp之间 ;SNP分析技术要达到与目前所用STR试剂盒一样的识别率，所需 的位点数较多等缺点，也限制了其在实际检案中的应用。 本研究基于法医学检案的实际需要，结合前人的研究成果，通过对醋酸铵盐 析法【21进行改进，并结合PCR前修复技术【31提高模板DNA质量，以期为法医学实 际检案中FFPETDNA的STR分型提供一种新的方法。 材料与方法 实验材料 一 实验样品 l、新鲜检材 科大学法医病理学教研室提供，(20?冷冻保存，备检。 2、FFPET检材 研室提供，分别用10,的中性福尔马林溶液固定1d、3d、5d和7d后，进行石蜡 包埋，常规切片备检。 二 主要仪器 ReseachINCPTC(200 1、DNA扩增仪 MJ 2、电泳仪 Pharmacia，ESP500,400 3、电泳槽 北京六一仪器厂，DYY-IIl33A 1Macro?JE 4、紫外透射光源 PharmaciaLKB，201 5、高速台式离心机 上海医用分析仪器厂，TGL(16G 1―1 6、电热恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂，HH(S1 7、凝胶成像系统 DNR Ltd，MiniBIS Bio-ImagingSystems 三 主要试剂 l、蛋白酶K MERCK DNA聚合酶、dNTP、1 2、Taq 0xBuffer Takara 3、琼脂糖、三羟甲基氨基甲烷 Tris 华美生物工程公司 4、Tween20 AMRESCO 100x#B9001S 5、BSA 小牛血清蛋白 NEB，purified lO 7、丙烯酰胺、N，N(亚甲基双稀酰胺 MERCK 8、T4连接酶 Fermentas DNA 9、50bpMarker Takara 二、实验方法 一 DNA提取 1、血液DNA提取 0(2,NaCl后充分混 1 取心血200pl置于1(5ml的Eppdorf管中，加入800I(tl 匀，12000r,min离心10min，弃上清，重复上述操作至上清液清澈透明为止。 NaCl，10mmol,L"Iris―HCl，lmmol,L 2 JIlSTE 100mmol,L EDTA，pH8(O 于上 2000r,min离心10min，吸取上层水相移 3 jJIJ2,(等体积饱和酚溶液，混匀，1 至新的Eppdorf管中，再分别加入等体积的酚,氯仿 体积比l:1 、氯仿，各抽提一 次。 乙醇，充分混匀沉淀DNA，12000r,min离心10min后，弃上清。 "Iris(HCl，lmmol,L EDTA，pH8(0 溶液中，4?保存备用。 2、新鲜组织DNA提取 STE 浸泡 剪取0(2emxO(2cmxO(2cm大小新鲜肾脏组织，适当研磨，加入lml 过夜，3000r,min离心后，去上层液体，再加入O(5mlSTE。后续操作同血液DNA 提取。 3、FFPET DNA提取 1 醋酸铵盐析法 入不同Eppdorf管中，进行脱蜡。 离心10min，小心移去二甲苯，以上过程重复三次。加入lml无水乙醇洗涤10min， B(微波加热脱蜡【4】:向装有组织切片的Eppdorf管中加入消化缓冲液 10mM Tris―HCl，0(5,Tween20，5mMEDTA，pH Eppdorf管中。 0(5,Tween20，5mM EDTA，pH Eppdorf 管中。 于55?水浴消化48h，期间每隔2h轻轻振荡一次，并于24h末再次加入蛋白酶K 3“l。取出后，于95。C水浴lOmin灭活蛋白酶K。消化缓冲液种类有: 8(O; A(2,CTAB:10mM"Iris―HCI，2,CTAB，5mMEDTA，pH B(1,Triton X-100:10mM"Iris―HCI，1,TritonX一100，5mM 8(0; EDTA，pH 8(O; C(0(5,SDS:10mM"Iris―HCl，0(5,SDS，5mM EDTA，pH D(0(5,Tween 8(0。 20:10mM"Iris―HCI，0(5,Tween20，5mM EDTA，pH ?沉淀DNA在消化后的液体中加入10M的醋酸铵溶液 809l、1409l、 5min 清于另一Eppdorf管中，加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒20s，冰盒孵育1 后，15000r,min离心10min。 去上清，于37* 2温箱中挥发至基本干燥。加入适量ddH20溶解，4"C冰箱中保存 备用。 2 酚,氯仿法【5】经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化处理的FFPET切片按常 规酚,氯仿法提取基因组DNA。 3 Chelex(100法【6】同酚,氯仿法。 二 DNA质量检测 l、紫外分光光度计法 DNA样品，加入分光光度计的加样孔 用39lTE溶液校正零点后，各取39l 浓度。 2、琼脂糖凝胶电泳法 agarosegeleleetrophoresis，AGE 料 。各取59l基因组DNA与2pl 凝胶成像系统 DNR Ltd，MiniBIS 进行图像处理，以检测 Bio(ImagingSystems 所提取DNA的质量。 三 基因组DNA修复 DNA聚合酶和,或T4连接酶进行修复，修复反应体系组成及反应条件见 表1。 Taq 表1，修复反应体系组成及反应条件 DNA聚合酶修复。 ，I基因组DNA与反应缓冲液于55?孵育lh后，加入Taq 四 PCR扩增 l、反应体系 PCR 选用AmpF_cSTR@IdentifilerAmplificationKit 美国AppliedBiosystems 公司 中的CSFlPO位点作为扩增位点，分别扩增血液样品、新鲜组织和FFPET DNA聚合酶修复基因组或,和T4 切片提取基因组DNA 反应体系1 ，及经Taq 5min后，立即冰上冷却后加样 反应体系2 。反应体系组成见表2。 表2，PCR反应体系 2、反应条件 反应体系1和反应体系2均采用如下反应条件: 2minlminlmin90s lmin1min90s 5min ,――――――――、，―――――? ,―――――――、，―――――? 10 20 cycles cycles 五 PCR产物的检测 非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳 polyacrylamidegelelectrophoresis， PAGE 1、凝胶制备取交联度为5,，浓度为30,的母液，以lxTBE溶液 90mM"Iris， 90mM硼酸，lmM EDTA 为缓冲液，配制交联度为5,，浓度为6,的凝胶。 14 2、加样电泳PCR产物29l与29l 泳，根据指示剂位置确定电泳时间。 3、银染显谱 电泳结束后，将凝胶用10,乙酸溶液固定，蒸馏水洗涤三次 后，置入0(1,硝酸银溶液中 200ml硝酸银中加1701(d甲醛 染色，短暂水洗后， 用3,碳酸钠溶液 200ml碳酸钠加1709l甲醛，171(tl硫代硫酸钠 显色。 实验结果 一、醋酸铵盐析法提取DNA检测结果 1、脱蜡方法的影响 脱蜡、65?水浴脱蜡、95?水浴脱蜡和不脱蜡处理后，行常规SDS消化液消化， 醋酸铵盐析法提取DNA。提取后的基因组DNA，以CSFlPO位点为扩增位点， 进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶 T, 6，C, 5 电泳分离，银染显谱后，结果 显示不脱蜡和脱蜡均可得到清晰谱带，与DNA分子量Marker比对可见其位置均 符合CSFlPO位点的片段长度;但是与未脱蜡相比，脱蜡所得的谱带亮度较亮; 不同脱蜡方法之间比较可见95?水浴脱蜡谱带最亮，65?水浴脱蜡次之，后依次 为二甲苯脱蜡，微波脱蜡 如图1 。 图1，不同脱蜡方法提取DNA的扩增产物PAGE图谱 注:A为二甲苯脱蜡;B为微波脱蜡;C为650C水浴脱蜡;D为95"C水浴脱 蜡;E为未脱蜡;1，2为两个不同的样品;M为DNA分子量Marker。 2、消化缓冲液的影响 用含2,CTAB、1,TritonX(100、O(5,SDS、0(5,Tween20的消化缓冲液进行消 化。消化完成后，采用醋酸铵盐析法进行DNA提取。提取后的基凶组DNA， 以 泳分离，银染显谱后，结果显示不同消化缓冲液消化均可得到清晰谱带，与DNA 分子量Marker比对可见其位置均符合CSFlPO位点的片段长度;但是谱带亮度比 较可见0(5,Tween20消化谱带最亮，1,TritonX(100消化次之，后依次为0(5,SDS 消化，2,CTAB消化 如图2 。 图2，不同消化缓冲液消化提取DNA的扩增产物PAGE图谱 为0(5,Tween20消化;1，2为两个不同的样品;M为DNA分子量Marker。 3、醋酸铵浓度的影响 20消化后，选择浓度分别为:1(4M、2(3M、4(3M的醋酸铵溶液来沉淀蛋白质。 提取后的基因组DNA DNA分子量 59l与2“l6xloadingbuffer混匀，并与29l Marker同时上样，经1,的琼脂糖凝胶电泳分离，结果显示三种浓度醋酸铵溶液 所提取的基因组DNA的电泳谱带均成弥散状，随着片段长度的减小，谱带逐渐变 扩增，聚丙烯酰胺凝胶 T, 6，C, 5 电泳分离，银染显谱后，结果显示三种 浓度醋酸铵溶液提取的基因组DNA扩增产物均可得到清晰谱带，在谱带亮度上三 16 点的片段长度 如图4 。 图3，不同醋酸铵浓度提取基因组DNA的AGE图谱 醋酸铵溶液沉淀蛋白质;1，2为两个不同的样品;M为DNA分子量Marker。 醋酸铵溶液沉淀蛋白质;1，2为两个不同的样品;M为DNA分子量Marker。 4、固定时间的影响 20消化后，选择浓度为2(3M的醋酸铵溶液进行醋酸铵盐析法提取DNA。提取后 的基因组DNA DNA分子量Marker同 59l与2“l6xloadingbuffer混匀，并与29l 时上样，经1,的琼脂糖凝胶电泳，结果显示不同固定时间所提取的基因组DNA 的电泳谱带均成弥散状，随着片段长度的减小，谱带逐渐变亮;且随着固定时间 的延长，谱带的最亮区域逐渐下移，固定7d时，基因组DNA已基本在集中 在100一-( 以上，与其在同一位置的FFPET切片提取DNA的谱带亮度随着固定时间延长逐 扩增，聚丙烯酰胺凝胶 T, 6，C, 5 电泳分离，银染显谱后，结果显示不同 固定时间均可得到清晰谱带，与DNA分子量Marker比对可见其位置均符合 CSFlPO位点的片段长度;但是谱带亮度比较可见随着固定时f、日J的延长，谱带亮 度逐渐减弱 如图6 。 + 图5，不同固定时问检材提取基因组DNA的AGE图谱 样品;I血液样品;II为新鲜组织;M为DNA分子量Marker。 Marker。 5、与其他提取DNA方法的比较 采用改良醋酸铵盐析法、酚,氯仿法和Chelex(100法进行DNA提取。 1 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳 提取后的基因组DNA DNA分子量 59l与29l6xloadingbuffer混匀，并与29l Marker同时上样，经1,的琼脂糖凝胶电泳分离，结果显示不同提取方法所得基 因组DNA的电泳谱带均成弥散状，且谱带最亮区域的位置相同，均在150",300bp 之间，而相应的血液和新鲜组织DNA的谱带位置在1500bp以上;谱带亮度比较 可见，Chelex(100法所得DNA的电泳谱带最亮，改良醋酸铵盐析法次之， 酚,氯 仿法相对最弱;同一种方法内部比较可见随着检材量的减少，三种方法所提取的 基因组DNA的电泳谱带亮度均逐渐减弱 如图7 。 + 图7，不同方法提取基冈组DNA的AGE图谱 注:I新鲜组织;II为血液样品;A为改良醋酸铵盐析法提取;B为酚,氯仿法 提取;C为Chelex(1oo法提取;1、2、3、4分别代表l片、1,2片、1,4片、1,8 片;M为DNA分子量Marker。 2 DNA的产量及OD260,OD280比值 采用紫外分光光度计测定所得的OD260,OD280以及DNA的浓度， 进而计 算出DNA的产量，结果见表3。经多相关样本非参检验 a(FriedmanTest 可见 来看，Chelex(100法所得DNA的量明显高于其他两种方法，改良醋酸铵盐析法次 之，酚,氯仿法最少;且随着检材量的减少，这种趋势更明显;两两比较均有统计 学意义 P O(05 。 表3，不同方法提取基因组DNA的紫外分光光度计检测结果 x士s 3 非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳 提取后的基因组DNA，以CSFlPO位点为扩增位点，进行PCR扩增，聚丙 烯酰胺凝胶 T, 6，C, 5 电泳分离，银染显谱后，结果显示改良醋酸铵盐析 法提取的DNA均可扩增出清晰的谱带;酚,氯仿法提取的DNA扩增谱带较弱，且 随着检材量的减少，谱带亮度明显减弱，在检材量为1,8片时已基本显示不出谱 带;Chelex(100法提取的DNA在l片时未扩增出谱带，1,2片时谱带隐约可见， 而在1,4片、1,8片时可见清晰谱带，但亮度不及改良醋酸铵盐析法所提取的DNA 的亮度;与DNA分子量Marker比对发现三种方法所提取的DNA的扩增产物位 置均符合CSFlPO位点的片段长度 如图8 。 图8，不同方法提取DNA的扩增产物PAGE图谱 注:A为改良醋酸铵盐析法提取;B为酚,氯仿法提取;C为Chelex(100法提 二、修复基因组DNA扩增产物检测结果 DNA聚合酶修复 l、Taq 采用改良醋酸铵盐析法对固定7d FFPET同一检材1,8片进行DNA提取。提 DNA聚合酶进行修复。以修复后的基因组DNA作 取后的基因组DNA采用Taq 为模板，以CSFlPO位点为扩增位点，进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶 T, 6， 20 C, 5 电泳分离，银染显谱后，结果显示三个样品的修复组均扩增出清晰的谱带， 而相应的对照组无谱带或谱带较弱，与DNA分子量Marker比对可见谱带位置均 符合CSFIPO位点的片段长度 如图9 。 + 注:A，B分别为对照组和修复组;1，2，3为三个不同的样品;+为血液样 品阳性对照;M为DNA分子量Marker。 2、T4连接酶修复 采用改良醋酸铵盐析法对固定7dFFPET同一检材1,8片进行DNA提取。提 取后的基因组DNA采用T4连接酶进行修复。以修复后的基因组DNA作为模板， 电泳分离，银染显谱后，结果显示两个样品的修复组和对照组谱带均较弱， 两者 在谱带亮度上无显著性差异，而相应的血液样品DNA阳性对照可见清晰谱带，与 + 图10，T4连接酶修复DNA的扩增产物PAGE图谱 注:A，B分别为对照组和修复组;l，2为两个不同的样品;+为血液样品阳 性对照;M为DNA分子量Marker。 DNA聚合酶和T4连接酶联合修复 3、Taq 采用改良醋酸铵盐析法对固定7dFFPET同一检材1,8片进行DNA提取。提 DNA聚合酶和T4连接酶联合修复。以修复后的 基因 取后的基因组DNA采用Taq 组DNA作为模板，以CSFlPO位点为扩增位点，进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝 胶 T, 6，C, 5 电泳分离，银染显谱后，结果显示两个样品的修复组均可见 清晰谱带，而相应的对照组均未见谱带，与DNA分子量Marker比对可见谱带位 置符合CSFIPO位点的片段长度 如图11 。 DNA聚合酶和T4连接酶联合修复DNA的扩增产物PAGE图谱 图11，Taq 注:A，B分别为对照组和修复组;1，2为两个不同的样品;+为血液样品 阳性对照;M为DNA分子量Marker。 讨 论 一、醋酸铵盐析法的改良 福尔马林固定石蜡包埋组织是遗传学回顾性研究中生物检材的最大来源，在 一些案件中也是唯一可以获得DNA的来源。但是FFPET因受诸如固定液的种类、 固定时间、切片存储时间以及不同的提取处理方法等因素的影响，所以很难得到 完整的基因组DNA。因此如何有效的从FFPET中获得高质量的模板DNA，用于 以PCR为基础的回顾性研究一直是困扰着科研工作者的一大难题。 2006年前后，Elena 行提取，发现此方法和酚,氯仿法、DNA提取试剂盒相比，可以得到相同量的DNA， 但是醋酸铵盐析法与酚,氯仿法相比具有更简单，毒性更小的优点。随后，Mafia C(L(GS锄tos同等人用此方法从保存19年的福尔马林固定石蜡包埋胎儿组织中成 中具有一定的优势。本研究在醋酸铵盐析法的基础上，通过对其多个影响因素进 行探讨，以期为法医学实际检案中FFPETDNA的STR分型提供一种新的方法。 从FFPET中提取DNA一般包括预处理、蛋白质消化、沉淀和纯化DNA三 个过程。预处理主要为脱蜡。最常用的脱蜡方法为二甲苯脱蜡。此外也有作者报 道使用65。C水浴加热脱蜡【引、95。C水浴加热脱蜡【9】和微波脱蜡【lo】等。本研究对不 脱蜡和上述几种脱蜡方法进行了比较，结果发现从提取基因组DNA的PCR扩增 效果来看，脱蜡的效果好于不脱蜡，其中以95?水浴加热脱蜡法效果最好，表现 为扩增产物PAGE谱带亮度最高。其原因可能为:石蜡的存在，会形成DNA一石 蜡混合物，使得裂解液不能渗透组织，不利于组织的消化;同时石蜡在PCR反应 中的残留也会抑制PCR反应。同时，由甲醛介导的DNA(蛋白质交联具有可逆性， 95?水浴加热可以使DNA变性，氢键打开，促使DNA(蛋白质交联松解，既有利 于彻底脱蜡，又有利于DNA和蛋白质的分离，提高蛋白酶K的消化效果。此外， 95?水浴加热脱蜡和传统的二甲苯脱蜡相比较还具有以下优点:一是省时、省力， 同时也避免了过多的操作步骤增加DNA受污染的可能以及人为造成的DNA机械 性损伤;二是避免了接触有毒化学试剂――二甲苯，保护了实验者的人身安全。 与65?水浴加热脱蜡相比，95?水浴加热不仅可以使石蜡融化，而且高温可以促 使DNA(蛋白质交联松解，氢键断裂，因而脱蜡更彻底。在以前的研究中，有的 作者提倡采用微波加热脱蜡法，利用电磁波的穿透力，对组织进行深层加热，达 到短时间内彻底脱蜡的效果。但是在本研究中，作者发现微波加热脱蜡法的脱蜡 效果不及95?水浴加热脱蜡，同时存在“嘣管”现象，安全性差。 蛋白质消化多采用的是蛋白酶K基础上的化学试剂消化法。目前最常用的裂 解液为含SDS的消化液，但是SDS的微量残留会对下游的PCR扩增产生抑制作 用。因此一些学者在实验中尝试使用其他的去垢剂，如TritonX(100，Tween20， CTAB等来代替SDS。本研究对含0(5,SDS、1,TritonX-100，0(5,Tween20， 2,CTAB的不同消化缓冲液消化所提取的基因组DNA的扩增效果进行了比较， 结果发现含0(5,Tween 20的消化缓冲液所提取基因组DNA的扩增效果最好，表 现为扩增产物PAGE谱带亮度最高。其原因可能为Tween20为非离子型表面活性 剂，增加了乳化的稳定性，作用柔和:同时在乳化蛋白的同时其少量的残留不会 对下游的PCR扩增产生抑制，相反低浓度的Tween20甚至会促进PCR反应。 在醋酸铵盐析法中，醋酸铵的浓度是否会对DNA提取效果产生影响也是一个 主要方面。本研究通过对不同浓度醋酸铵溶液 1(4M、2(3M、4(3M 沉淀所得基 因组DNA的AGE以及扩增产物的PAGE结果比较发现，不同浓度的醋酸铵溶液 提取的DNA的量及PAGE谱带亮度没有显著性差异，醋酸铵的浓度对DNA提取 效果没有较大影响，这一结果与ElenaR(C(Riverotll】等人的报道相同。基于实际工 作中控制液体体积的需要，作者推荐采用2(3M醋酸铵溶液来沉淀蛋白质。 对于福尔马林对标本的固定时间长短是否会对提取的DNA的质量产生影响， 目前普遍认为，与其他因素相比，固定时间对提取DNA的质量影响更大。一些作 者报道称甲醛固定超过一周将会导致核苷酸的大量破坏，因为由甲醛介导的广泛 的DNA(蛋白质的交联，会导致核苷酸的断裂【121。袁丽【131等报道称经普通甲醛固 定5天、石蜡包埋的心脏和肾脏组织基本上能检出完整的STR等位基因型，而随 着固定时间的延长，能检出的STR基因座数目逐渐减少，出现了大片段等位基因 PCR Kit中的CSFlPO位点作为扩增位点，就是因为其在此试剂盒的16 Amplification 个位点中片段长度最大 291(33lbp ，若此位点可以被成功扩增，那么一定程度 PCR Kit在个人识别上的应用。本研究也同样发现随着固定时间的延长， Amplification 所提取的基因